張 宇，唐志鵬，秦榮耀，歐克緯

（1.廣西大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001）

金柑Fortunella japonica亦稱金彈、寧波金柑、金橘，起源于中國(guó)，植物學(xué)分類屬蕓香科Rutaceae金柑屬Fortunella[1-3]。金柑果實(shí)香氣怡人、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)多樣，具有減緩衰老、理氣止咳、健胃化痰、預(yù)防哮喘及支氣管炎等醫(yī)療功效[2]。隨著生活水平的提高，相關(guān)部門對(duì)金柑資源的保護(hù)與開發(fā)越來越關(guān)注，在金柑品種資源優(yōu)良性狀的挖掘和利用方面取得了積極的研究成果。龔小慶[4]對(duì)金柑FcWRKY70、FcWRKY40、FcSISP3 個(gè)逆境響應(yīng)基因進(jìn)行克隆，分析它們各自的功能及潛在作用機(jī)制，得到如下結(jié)論：FcWRKY70超表達(dá)可明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性，F(xiàn)cWRKY40基因可被低溫、鹽、ABA 和SA 誘導(dǎo)表達(dá)，但被干旱抑制。超表達(dá)FcWRKY40可明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)氧化脅迫的抗性。FCSISP基因在煙草中超表達(dá)，可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。胡穎[5]以廣西融安金柑為材料，克隆了37 個(gè)MADS box基因序列信息，并進(jìn)行了生物信息學(xué)和聚類分析，篩選得到12 個(gè)特異調(diào)控花器官發(fā)育關(guān)鍵基因，構(gòu)建6 個(gè)MADS box家族基因植物表達(dá)載體。以上研究結(jié)果的獲得均是以獲取高質(zhì)量的總RNA 為基礎(chǔ)，徐昌杰等[6]、吳秀蘭等[7]針對(duì)近緣種柑橘富含多糖多酚類物質(zhì)的特點(diǎn)，報(bào)道了總RNA 的獲取。但較詳細(xì)獲取金柑果實(shí)總RNA 的方法鮮見報(bào)道，筆者以果實(shí)為材料研究了適合金柑果實(shí)總RNA 的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為‘桂金柑一號(hào)’、‘桂金柑二號(hào)’、‘融安金柑’、‘滑皮金柑’、‘脆密金柑’。于2017年10月21日從廣西融安縣雅瑤鄉(xiāng)采摘5 個(gè)金柑品種的果實(shí)，每個(gè)品種收集果實(shí)約200 g，放入裝有液氮的冰壺迅速運(yùn)回廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，用雙蒸水清洗果實(shí)并濾干水分，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆肹8-13]。

1.2 方 法

1.2.1 提取RNA 的試劑

①異硫氰酸胍變性液；②2 mol/L NaAc；③水飽和苯酚（pH 5.2）；④氯仿/異戊醇（體積比24 ∶1）；⑤異丙醇；⑥ 75%乙醇；⑦ EDPC 處理水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%）；⑧ CTAB 提取液[0.15 mol/L Tris-HCl，1.6 mol/L NaCl，20 g/L CTAB，0.25 mol/L EDTA，3% β-巰基乙醇，20 g/L PVP-40(pH 8.0)]；⑨0.15 mol/L Tris-HCl，0.8 mol/L NaCl，SDS（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%），0.06 mol/L EDTA，β-巰基乙醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%），20 g/L PVP-40（pH8.0）]。

1.2.2 提取RNA 的步驟

異硫酸胍提取法：（1）金柑果實(shí)用經(jīng)75%酒精消毒過的手術(shù)刀切割成1 cm3大小后，取約0.5 g在液氮中研磨成粉末，將研磨后的粉末放入經(jīng)液氮預(yù)冷后的10 mL 離心管；（2）加入4 mL ①，上下顛倒混勻，依次加入0.3 mL ②、3 mL ③、0.7 mL ④上下顛倒混勻，冰浴15 min；（3）4 ℃，12 500 r/min 離心28～30 min；（4）取上清液，加入和上清液等體積預(yù)冷的⑤，混勻，-30 ℃靜置1 h；（5）4 ℃，12 500 r/min 離心25 min，棄上清，用⑥洗滌沉淀2～3 次，超凈臺(tái)上風(fēng)干，用100 μL ⑦溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CTAB 提取法：（1）第一步同異硫酸胍提取法；（2）加入5 mL ⑧，上下顛倒混勻，置于65 ℃水浴1 h，期間顛倒混勻3 次，水浴結(jié)束后，加入等體積預(yù)冷的④，4 ℃，12 500 r/min 離心25 min；（3）取上清，加入1/2 體積③，混勻，冰浴靜置5 min，取上清液，加入1/10 體積的②，-30 ℃ 靜置30 min，4 ℃，12 500 r/min 離心25 min；（4）取上清，加入到2.0 mL 離心管中，加入等體積的⑤，-30 ℃靜置1 h，4 ℃，12 500 r/min 離心25 min，棄上清；（5）用⑥洗滌2～4 遍，自然干燥，100 μL ⑦溶解，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS 提取法：參考羅聰?shù)萚14]的方法。（1）第一步同異硫酸胍提取法；（2）加入65 ℃預(yù)熱的5.5 mL ⑨，上下顛倒混勻，65 ℃溫浴45 min，期間不時(shí)晃動(dòng)離心管3～5 次，4 ℃，12 500 r/min，離心15 min，留上清液；（3）加入與清液同體積提取試劑③，震蕩混勻，4 ℃，靜置3～5 min，12 500 r/min，離心15 min，取上清液，加1/10 體積③和等體積⑤，混勻，-30 ℃靜置20 min，4 ℃，12 500 r/min 離心20～25 min；（4）棄上清，用⑥洗沉淀2～3 次，超凈臺(tái)上風(fēng)干，用100 μL ⑦溶解，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑盒提取法：選0.15 g 果實(shí)樣品，研磨前處理同異硫酸胍提取法，使用TakaRa 公司的RNAisoTM plus Trizol，提取步驟遵照Trizol 試劑產(chǎn)品說明書操作。

1.2.3 RNA 提取質(zhì)量檢驗(yàn)及濃度計(jì)算

用0.5 倍TBE 電泳緩沖液，在含1%瓊脂糖凝膠上于4～5 V/cm 條件下進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用凝膠電泳成像儀拍照，分析提取的總RNA 質(zhì)量[15-16]。

取10 μL RNA 樣 品，用0.1%EDPC 處 理 水將原液稀釋20 倍，使用Eppendorf Biophotometre核酸蛋白分析儀測(cè)定230、260 及280 nm 波長(zhǎng)的吸收光度值，對(duì)照為0.1%EDPC 處理水，計(jì)算A260/A230和A260/A280，檢測(cè)RNA 純度。

1.2.4 RT-PCR 反應(yīng)

根據(jù)近緣植物甜橙基因組序列的CrAI 序列設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，如下。

primer-F：ATGCACACCCGATACGATCAT CTCGA；

primer-R：GCGTTAAATTTGATCCAATGGC AAAGC。

PCR 擴(kuò)增體系為20 μL：2 μL 10 倍的buffer、0.8 μL DNTP（2.5 μmol/L）、0.5 μL（10 μmol/L）引物、0.5 μL cDNA（25 ng）、用0.1%EDPC 水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 1 min，53 ℃退火 50 s，72 ℃延伸3 min，34 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 純度及濃度檢測(cè)

比較分析提取金柑果實(shí)總RNA 的4 種方法，結(jié)果表明（見表1）：4 種方法均能夠提取金柑果實(shí)總RNA，但濃度和純度有所不同。CTAB 提取法、SDS 提取法和試劑盒提取法提取金柑果實(shí)總RNA 的A260/A280比值在1.88～1.97 區(qū)間內(nèi)，說明采用這3 種方法提取的RNA 不存在或者極少存在DNA 和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)以及次生代謝物質(zhì)的干擾。以上3 種方法所提取總RNA 的A260/A280分別在1.90～1.95、1.89～1.92、1.95～1.97 區(qū)間內(nèi)，比較分析3 種方法所提取總RNA 的A260/A280可知：CTAB 提取法和試劑盒提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 的A260/A280均大于1.9，說明這2 種方法具有較好的去除蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)的能力，且采用試劑盒提取法所提取的金柑果實(shí)總RNA 的A260/A280值更集中，采用試劑盒法提取金柑果實(shí)總RNA時(shí)去除大分子干擾的效果最佳；采用SDS 提取法所提取金柑果實(shí)時(shí)總RNA 的A260/A280有部分品種小于1.9，由此可知該法與其它2種方法相比，去除蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)干擾的能力較弱；采用異硫酸胍提取法所提取金柑果實(shí)時(shí)總RNA 的A260/A280值分布在1.69～1.73 區(qū)間內(nèi)，遠(yuǎn)小于A260/A280值應(yīng)大于1.90 的提取標(biāo)準(zhǔn)，說明采用該法所提取的金柑果實(shí)總RNA 存在相對(duì)較嚴(yán)重的大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和多糖）的干擾，盡管可以獲得總RNA，但難以勝任對(duì)RNA 質(zhì)量要求較高的后續(xù)試驗(yàn)。

表1 用4種方法所提取不同金柑品種果實(shí)總RNA的比較?Table 1 Comparison of total RNA from different cultivars of kumquat fruit extracted by four methods

采用CTAB 提取法、SDS 提取法和試劑盒提取法所提取的金柑果實(shí)總RNA 的A260/A230在2.00～2.10 區(qū)間內(nèi)，說明采用這3 種方法所提取的金柑果實(shí)總RNA 完整性較好，小分子物質(zhì)的干擾較少，而采用異硫酸胍法所提取的金柑果實(shí)總RNA 的A260/A280值分布在2.14～2.35 區(qū)間內(nèi)，說明該方法雖然可以提取金柑果實(shí)總RNA，但RNA存在降解問題，且有小分子雜質(zhì)的干擾。

根據(jù)所提取的金柑果實(shí)總RNA 濃度從高到低排序，4 種方法依次是異硫酸胍提取法、CTAB 提取法、SDS 提取法、試劑盒提取法。采用異硫酸胍提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 濃度是采用試劑盒法所提取金柑果實(shí)總RNA 濃度的4～5 倍，差異顯著，而采用CTAB 提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 濃度略大于采用SDS 法所提取金柑果實(shí)總RNA 濃度。說明提取方法、采用的試驗(yàn)步驟和試劑組合對(duì)金柑果實(shí)總RNA 提取結(jié)果影響顯著。

2.2 RNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

觀察分析RNA 凝膠電泳圖譜是評(píng)判RNA 質(zhì)量的一種重要途徑，從18S、28S 和5S RNA 條帶的帶型和亮度可以判斷RNA 的提取質(zhì)量。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠上，用4 種方法所提取總RNA 電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 用4 種方法所提取金柑果實(shí)總RNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果的比較Fig.1 Comparison of agarose electrophoresis results of total RNA from kumquat fruit extracted by four methods

采用4 種方法均可提取金柑果實(shí)總RNA，且28S 條帶亮度大于18S 條帶亮度，采用異硫酸胍提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 亮度較高，采用試劑盒提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 亮度相對(duì)較差，這與表1中總RNA 濃度結(jié)果相一致，總RNA 濃度越高條帶亮度越高，說明采用異硫酸胍提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 可以獲得較高濃度的RNA，但該法提取的金柑果實(shí)總RNA 點(diǎn)樣孔有少量雜質(zhì)存留，且5S RNA 條帶微弱，肉眼不易觀察。其余3種方法提取的金柑果實(shí)總RNA，亮度高、帶型完整，說明提取質(zhì)量較高，可用于后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)的開展。

2.3 RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)

以用4 種方法所提取金柑果實(shí)總RNA 作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，所提取RNA樣品均可被檢測(cè)到該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，獲得100～150 bp 的目的片段。

圖2 用4 種方法所提取金柑果實(shí)總RNA 的RT-PCR 結(jié)果的比較Fig.2 Comparison of RT-PCR electrophoresis results of total RNA from kumquat fruit extracted by four methods

3 結(jié) 論

由230、260 和280 nm 紫外吸收波長(zhǎng)不同組合的比值以及總RNA 濃度可知：試劑盒提取法去除大分子和小分子物質(zhì)干擾的能力最強(qiáng)；就所提取總RNA 的濃度來說，異硫酸胍提取法所提取總RNA 濃度最高；綜合比較4 種提取方法可知，盡管采用CTAB 提取法和SDS 提取法所提取總RNA濃度不是最高，但可以從金柑果實(shí)中提取到符合質(zhì)量要求的總RNA，兩者所提取總RNA 濃度相比，CTAB 提取法略高于SDS 提取法；試劑盒提取法雖然可以提取質(zhì)量最高的總RNA，但其提取的總RNA 濃度顯著低于其他3 種方法，并非是進(jìn)行后續(xù)相關(guān)研究的首選方法。RT-PCR 擴(kuò)增效果顯示：4 種方法均可以獲得清晰、整潔的RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。比較分析3 種檢測(cè)方法可以得出，CTAB 提取法是提取金柑果實(shí)總RNA 的最優(yōu)選擇。

4 討 論

金柑果實(shí)富含金桔甙、檸檬萜、橙皮甙、脂肪酸、蛋白質(zhì)、糖類、酚類、單寧及色素等次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在嚴(yán)重阻礙了總RNA 的提取。因此，一般提取總RNA 的方法有可能并不適用于金柑果實(shí)總RNA 的提取。4 種提取方法中，采用CTAB 提取法和SDS 提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 濃度相接近，且總RNA 提取質(zhì)量也相對(duì)較高，可能是因?yàn)椴捎眠@2 種方法提取過程中均加入了β-巰基乙醇和PVP-40，將金柑果實(shí)切割成小塊，減少了研磨難度，同時(shí)使得研磨更加充分，經(jīng)過人工研磨的機(jī)械損傷，植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破碎，β-巰基乙醇與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行生化反應(yīng)，打斷了蛋白質(zhì)的肽鏈，降解了蛋白質(zhì)，也抑制了多種氧化酶的活性；PVP 粉末與酚類物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，阻止酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)無法生成，就不存在醌類物質(zhì)與氫鍵絡(luò)合，進(jìn)而遏制了總RNA 氧化后的褐變現(xiàn)象；總RNA提取的同時(shí)往往伴隨著白色粉面的多糖形成，降低了RNA 純度，也嚴(yán)重阻礙了后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)展，CTAB 提取法和SDS 提取法均使用了2 mol/L 除雜試劑NaAc，該試劑可有效去除多糖物質(zhì)對(duì)RNA提取質(zhì)量的影響[17]。由圖1和表1可知：采用異硫酸胍提取法所提取的RNA 濃度最高，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，其點(diǎn)樣孔有極少蛋白質(zhì)殘留，筆者根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為異硫酸胍提取法操作步驟少，使用試劑少，較大程度地保留了金柑果實(shí)中總RNA，但也因此連帶未能較好地去除許多雜質(zhì)（蛋白質(zhì)），說明該法是把雙刃劍，未能達(dá)到兩全其美的提取效果；CTAB 提取法和SDS 提取法未見蛋白質(zhì)殘留，與異硫酸胍提取法相比，這有可能是因?yàn)椴捎昧?5 ℃水浴，提取試劑中加入了PVP 粉末和β-巰基乙醇的緣故，雖然這樣操作增加了試驗(yàn)時(shí)間、耗材成本以及復(fù)雜程度，但提取結(jié)果優(yōu)于異硫酸胍提取法，而采用CTAB 提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 濃度大于采用SDS 提取法所提取金柑果實(shí)總RNA 濃度，有可能是因?yàn)榍罢咛崛≡噭┙M成成分以及操作流程在更徹底地去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的同時(shí)更大程度地保留了RNA；按照說明書操作的試劑盒提取法，適合大批量提取RNA，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間，但成本相對(duì)較高，該法所提取金柑果實(shí)總RNA 質(zhì)量最優(yōu)，但濃度也最低，可能是因?yàn)樵撎崛》ㄟx用了除雜能力極強(qiáng)的試劑配比組合，同時(shí)連帶與部分RNA 發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的雜質(zhì)均被去除掉，獲取高純化的RNA 同時(shí)也較其他提取法損失掉更多的RNA，因此出現(xiàn)了高質(zhì)量RNA 的同時(shí)伴隨著低濃度RNA。綜合4種方法的提取效果，CTAB 提取法更適合金柑果實(shí)總RNA 的提取。

將采用4 種提取方法所提取的金柑果實(shí)總RNA 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增得到的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物在100～200 bp 之間（見圖2）。但肉眼無法區(qū)分其差異，還應(yīng)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步分析。筆者選用的4 種方法均能夠提取出金柑果實(shí)總RNA，但采用4 種方法所提取的總RNA 濃度和純度存在一定程度的差異。其中CTAB 提取法能夠較好地除去金桔甙、檸檬萜、多酚、單寧、橙皮甙、脂肪酸、多糖、色素以及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提取的RNA 純度較高，濃度也較理想，可進(jìn)一步用于開展基因克隆、差異表達(dá)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析等相關(guān)研究工作[18-22]。

查閱前人的研究資料，未見提取金柑RNA 的相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于其近緣植物柑橘的RNA 提取的研究報(bào)道較多，吳秀蘭等[23]、葉慶亮等[24]、徐昌杰等[25]采用不同方法提取柑橘不同組織RNA，雖然得出一些結(jié)論，但采用的改良Asif 法和改良Bugos 法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，偏離了方法簡(jiǎn)便、易普及和效果良好的選擇方向；而柑橘果實(shí)汁囊總RNA 提取，只是比較了不同廠家生產(chǎn)的試劑盒之間的差異，選用提取方法范圍不夠廣泛，具有片面性；柑橘雖然與金柑是近緣植物，但其內(nèi)含物成分、比例以及濃度差異較大，適用于柑橘RNA 提取的方法未必適用于金柑RNA 提取，因此筆者選用普通實(shí)驗(yàn)室常用的4 種方法針對(duì)金柑果實(shí)RNA 的提取結(jié)果進(jìn)行比較分析。

本研究也存在一定的局限性。如同一種提取方法所提取總RNA 結(jié)果不可能最高濃度和最佳質(zhì)量并存，提取效果較好的方法往往費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高，RT-PCR 反應(yīng)未能區(qū)分4 種提取方法的差異。若要克服上述研究的不足，需要制訂更精細(xì)全面的試驗(yàn)方案、投入更多的研究成本，并需要大量詳實(shí)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為支撐。