董立軍 李 嵐 宋國軍

(1 包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 包頭 014030； 2 南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院放射科， 廣州 510900)

卵巢癌是繼宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌的三大惡性腫瘤之一，其病死率高居婦科惡性腫瘤之首，由于起病隱匿、且缺乏行之有效的實驗室檢測手段, 因此難于早期發(fā)現(xiàn)并診斷[1-5]。長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)因?qū)Π谢虮磉_(dá)的調(diào)控作用參與了許多癌癥發(fā)生、發(fā)展的過程。前期研究表明，HOTAIR在卵巢癌組織中表達(dá)量明顯高于正常卵巢組織, 提示可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。因此本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上進一步研究HOTAIR在卵巢癌中的作用及其機制, 為HOTAIR在卵巢癌中的作用以及精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780和OVCAR3由包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室保存。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清、四季血清購自杭州四季青生物材料工程有限公司；青鏈霉素溶液(雙抗)碧云天生物技術(shù)研究所胰酶RNA提取試劑盒；DMSO購自 Sigma公司；RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、HOTAIR引物均購自廣州復(fù)能基因有限公司。

1.2 研究對象

標(biāo)本來源于行手術(shù)治療的患者術(shù)中切除的新鮮組織，卵巢癌組織(病例組)來源于術(shù)前診斷為卵巢癌，術(shù)后病理確診為卵巢癌患者20例，正常卵巢來源于因其他疾病(子宮肌瘤老年患者)行手術(shù)治療，術(shù)后病理未提示卵巢癌病變的患者。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞先置于37℃水浴箱里融化復(fù)蘇，復(fù)蘇后加入10%血清1%雙抗培養(yǎng)基孵育進行細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長的細(xì)胞。寫上細(xì)胞類型，時間，凍存者姓名。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測HOTAIR mRNA表達(dá)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞106個1 ml裂解，加入0.2 ml氯仿分層后取上層無色液相，用異丙醇沉淀其中RNA，用去RNA酶的70%乙醇洗滌沉淀，最后用預(yù)熱適量的無RNAse的水溶解RNA，取1.5 μl RNA測定濃度和純度. 融解反應(yīng)所需要的First Strand Cdna Synthesis Kit中的所有試劑，低速離心機離心混勻。放在冰上備用。按說明書配置RNA-primer Mix 13 μl, 5×RT Reaction Buffer 5 μl, 25 mmol/L dNTP 1 μl, 25 U/μl RNase inhibitor 1 μl, 200 U/μl M-MLV RTase 1 μl, 無酶水4 μl總量25 μl的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。反應(yīng)結(jié)束后，85℃滅活處理5 min，然后用無酶水對反應(yīng)產(chǎn)物稀釋5倍，形成positive cDNA Mix。最后-20℃保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。配置qPCR反應(yīng)液2×All-in-One qPCR Mix 10 μl, All-in-One qPCR Prime 2 μl, 1ststrand cDNA(5倍稀釋液)2 μl，無酶水6 μl總量 20 μl(每個組3個復(fù)孔)?；靹蚝筮M行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 min，變性95℃ 10 s后，進行1個循環(huán)，退火60℃ 20 s延伸：72℃ 10 s，進行40個循環(huán)反應(yīng)。運用溶解曲線檢測擴增產(chǎn)物的純度。獲得Ct值，采用qPCR相對定量方法對2-ΔΔCt進行統(tǒng)計分析，檢測mRNA的表達(dá)。

1.5 EdU增殖實驗評價卵巢癌株SKOV3的活性

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照每孔約 1×105個細(xì)胞接種于24孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至正常生長階段。

1.5.2 EdU標(biāo)記 用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基按1 000∶1的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量的濃度為50 μmol/L EdU培養(yǎng)基。每孔加入200 μl 50 μmol/L EdU培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后棄培養(yǎng)基；PBS清洗細(xì)胞2次，每次5 min。

1.5.3 固定細(xì)胞 每孔加入200 μl含4%多聚甲醛的細(xì)胞固定液，室溫孵育10 min，然后傾倒固定液。每孔加入200 μl濃度為2 mg/ml的甘氨酸，在搖床上孵育5 min后，傾倒甘氨酸溶液。每孔加入200 μl PBS，脫色搖床清洗5 min，棄去PBS。每孔加入100 μl含 0.5% Triton X-100的PBS，脫色搖床孵育10 min后，PBS清洗2次，每次5min。

1.5.4 Apollo染色 每孔加入200 μl的1×Apollo?染色反應(yīng)液，于室溫下避光孵育30 min后，棄掉染色反應(yīng)液。加入200 μl含0.5% Triton X-100的PBS作為滲透劑，在脫色搖床清洗3次，每次10 min，棄掉滲透劑。每孔加入100 μl甲醇，在搖床上清洗2次，每次 5 min。PBS再次清洗1次，每次5 min。傾倒PBS液體。

1.5.5 DNA染色 用雙蒸水按50∶1的比例稀釋試劑F，配制適量1×Hoechst 33342 DNA染色液，然后避光保存。每孔加入200 μl 1×Hoechst 33342 DNA染色液，室溫下避光孵育20 min后，棄掉染色反應(yīng)液。每孔每次加入200 μl PBS清洗3次。

1.5.6 結(jié)果分析 在熒光顯微鏡下拍照，計數(shù)，分析結(jié)果。

1.6 劃痕實驗檢測卵巢癌株的侵襲轉(zhuǎn)移能力

將6孔板在接種細(xì)胞之前先用標(biāo)記筆在6孔板背面畫直線標(biāo)記。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種入6孔板，同時加入嘌呤霉素維持篩選。待細(xì)胞鋪滿板底后，用10 μl槍頭垂直于孔板劃出細(xì)胞劃痕，盡可能保證各個劃痕寬度一致。加入2 ml含無血清培養(yǎng)基，同時在倒置顯微鏡下拍照，記為0 h的劃痕寬度。放于細(xì)胞孵箱，48 h后再次拍照。根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果。

1.7 Transwell小室侵襲實驗檢測卵巢癌株的遷移能力

實驗前換無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×104/ml在每個小室里面加入5×104個細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將小室取出，用棉簽擦除小室里面的細(xì)胞，保留小室外側(cè)面的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定10 min。蘇木精染色10 min，自來水沖洗5 min，將小室放于烤箱中烤干，用刀片沿著小室邊緣將膜切下。加1滴中性樹膠在干凈的載玻片上, 顯微鏡下隨機選擇5個視野(上、下、左、右和中)計算細(xì)胞的個數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 qt-PCR檢測HOTAIR在卵巢癌細(xì)胞株的表達(dá)情況

檢測卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV3和OVCAR3中HOTAIR mRNA的表達(dá)情況。HOTAIR mRNA表達(dá)量，SKOV3(6.00±0.41)、OVCAR3(5.60±0.14)分別與A2780(1.80±0.23)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 檢測SKOV3細(xì)胞株的增殖、侵襲、遷移能力

卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默HOTAIR基因后，EdU細(xì)胞陽性率明顯降低(圖1,P<0.05)；卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默HOTAIR后，細(xì)胞遷移能力降低(圖2,P<0.05)；Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示, 與對照組比較，卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默HOTAIR后，細(xì)胞侵襲能力降低(圖3，P<0.05)。

EdU細(xì)胞增殖實驗顯示：與對照組比較，卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默HOTAIR后， EdU細(xì)胞陽性率明顯降低(圖1,P<0.05)。

劃痕實驗檢測沉默HOTAIR后，SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和對照組比較，SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOTAIR siRNA后，轉(zhuǎn)移能力降低(圖2，P<0.05)。

Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組比較， 卵巢癌SKOV3細(xì)胞株沉默HOTAIR后， 細(xì)胞侵襲能力降低(圖3，P<0.05)。

圖1 卵巢癌SKOV3細(xì)胞對照組(A～C)和沉默HOTAIR后(D～F)EdU檢測細(xì)胞增殖情況, ×200. A、D：EdU標(biāo)記；B、E：Hoechst染核；C、F：圖像重疊.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，HOTAIR在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中表達(dá)高于A2780細(xì)胞。同時顯示，沉默HOTAIR后，卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力均明顯受到抑制。這提示HOTAIR可以促進卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移。

HOTAIR可以通過募集PCR2復(fù)合體，進而促進組蛋白H3K27的甲基化，從而抑制抑癌基因的表達(dá)，然后促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[6-8]。Qiu 等[9]研究顯示HOTAIR在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)增加，并且其升高水平與患者的病理分級、臨床分期、總生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及無病生存期縮短呈正相關(guān)。同時研究顯示，HOTAIR是上皮性卵巢癌患者預(yù)后的1個獨立因子。本課題組前期研究通過qPCR檢測44例卵巢癌組織及14例正常卵巢組織中HOTAIR的表達(dá)情況，顯示卵巢癌組織中HOTAIR表達(dá)高于正常卵巢組織，病理類型為低度分化及未分化的卵巢癌組織中HOTAIR表達(dá)高于中-低、中-高及高度分化組織。提示卵巢癌組織中HOTAIR的表達(dá)增高，且癌組織分化越低，HOTAIR 表達(dá)越高。提示HOTAIR有可能作為卵巢癌診斷標(biāo)記物，并可以作為判斷其惡性程度的1個分子標(biāo)志[5]。

本研究結(jié)果顯示，沉默HOTAIR后，卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力均降低。有研究報道，沉默HOTAIR后，A2780 和OVCA429細(xì)胞增殖能力降低，并且通過干擾細(xì)胞周期引起細(xì)胞凋亡[9]。Qiu等[9]研究顯示，沉默HOTAIR后，可以通過抑制EMT從而抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移。另一項研究表明，過表達(dá)HOTAIR可以促進卵巢癌的轉(zhuǎn)移作用[10]。和本研究沉默HOTAIR后抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移的結(jié)果一致。

綜上所述，HOTAIR在卵巢癌的高表達(dá)有利于卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展，同時有可能作為1個新的診斷標(biāo)志。