黃 煜 李艷嬌 張本斯 李 莊 張 覃 趙 斌△

(大理大學(xué)， 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室， 2 附屬醫(yī)院胸外科， 大理 671000)

在發(fā)展中國家，由于預(yù)期壽命增加，城市化擴(kuò)大和采用西方生活方式，乳腺癌發(fā)病率正在上升。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與體內(nèi)信號通路的異常及癌基因的表達(dá)產(chǎn)物密切相關(guān)，這也使得分子靶向治療成為乳腺癌治療的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡阻斷是包括乳腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的最大特征，細(xì)胞凋亡功能的抑制將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及免疫功能的異常[1]。探討乳腺癌細(xì)胞凋亡信號通路異常分子機(jī)制,誘導(dǎo)其重新進(jìn)入凋亡周期可能是治愈乳腺癌的最根本途徑[2]。EphA2受體為受體酪氨酸激酶家族成員之一，主要配體為EphrinA1。EphA2高表達(dá)于多種惡性腫瘤和細(xì)胞系，與許多腫瘤的組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，已成為腫瘤治療的研究新靶點(diǎn)[3]。凋亡效應(yīng)分子caspase-3位于凋亡通路樞紐，caspase-3活化能引起細(xì)胞凋亡[4]。如果能確認(rèn)重組Ad-EphrinA1-caspase-3對體外乳腺癌細(xì)胞的靶向性抑制作用將會為乳腺癌的分子靶向治療提供新的治療途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

基因和組織(來自大理大學(xué)附屬醫(yī)院病理科)，重組Ad-EphrinA1-caspase-3、T淋巴細(xì)胞、乳腺癌組織和乳腺組織;D-Hanks液、膠原酶、胰酶、PBS、多聚甲醇、Triton X-100、胎牛血清、Rabbit anti-EphA2(Invirogen, Catalog No. 34-7400)、Rabbit anti-EphrinA1(Invirogen,Catalog No.343300)、FITC標(biāo)記的羊抗兔Ig(G+M)抗體(Thermo Fisher,Catalog No.A16097)，MTT溶液、DMSO、抗EphrinA1的血清、Annexin V-FITC、PI和Binding Buffer。

1.2 乳腺癌細(xì)胞的分離

用D-Hanks液清洗所取得的乳腺癌組織和乳腺組織，去除表面血污，并用手術(shù)鑷去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織，清洗后用手術(shù)刀將組織切成若干小塊，移入5 ml離心管中，加入適量緩沖液后將組織反復(fù)剪切成糊狀，約1 mm大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗1次后過200目篩網(wǎng)并收集濾液，將未過篩網(wǎng)的組織塊用0.25%的膠原酶在37℃搖床振蕩消化1 h，消化完成后將消化液過篩網(wǎng)并收集細(xì)胞液。將前2次收集的液體合并放入50 ml離心管中，以1 000 r/min離心5 min，去除上清，用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為(2～5)×105個/ml，分裝于培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5% CO2，37℃靜置培養(yǎng)。采用反復(fù)貼壁法逐漸去除分離細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞，最終得到純化后的乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞。

1.3 乳腺癌細(xì)胞的鑒定

取分離培養(yǎng)的人乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞用胰酶消化計數(shù)后接種于48孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)后用間接免疫熒光法(IFA)檢測細(xì)胞中EphA2受體及EphrinA1的表達(dá)，主要操作如下：4.0%多聚甲醇固定10 min，用0.1% Triton X-100透化10 min，用含10%胎牛血清的PBS 37℃封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的Rabbitanti-EphA2(Invirogen, Catalog No. 34-7400)或Rabbit anti-EphrinA1(Invirogen, Catalog No. 34-3300)一抗，37℃作用1 h，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔Ig(G+M)抗體(Thermo Fisher, Catalog No. A16097)37℃作用1 h，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.4 EphrinA1-caspase-3對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

使用MTT法檢測重組Ad-EphrinA1-caspase-3感染T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清對EphA2陽性乳腺癌細(xì)胞的體外增殖的影響，主要操作如下：(1)用分離的正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞鋪96孔板，每個孔中接種5×103個細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后吸去舊培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞；(2)分別加入梯度稀釋的正常T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清或重組Ad-EphrinA1-caspase-3感染T淋巴細(xì)胞上清(100、50、25 μl和0 μl)并補(bǔ)齊到100 μl/孔，放入37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；(3)分別在24、48和72 h后取培養(yǎng)板進(jìn)行MTT檢測；(4)每孔中加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h；(5)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液并在每孔加入150 μl的DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；(6)加DMSO后10 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測各孔波長570 nm的吸光值，并計算細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5 EphrinA1-caspase-3對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞儀檢測重組Ad-EphrinA1-caspase-3感染T淋巴細(xì)胞上清對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，主要操作如下：(1)乳腺癌細(xì)胞鋪6孔板，每個孔中接種5×105個細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后吸去舊培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞；(2)分別加入梯度稀釋的重組EphrinA1-caspase-3感染T淋巴細(xì)胞上清，以未感染T淋巴細(xì)胞上清作對照，37℃培養(yǎng)72 h；(3)收集培養(yǎng)上清，細(xì)胞用胰酶消化后與上清一起離心收集細(xì)胞；(4)將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer；(5)加入10 μl Annexin V-FITC和 10 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min或4℃反應(yīng)30 min；(6)加入300 μl Binding Buffer，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 EphrinA1-caspase-3對靶細(xì)胞殺傷效應(yīng)的特異性

為了進(jìn)一步檢測感染上清中EphrinA1-caspase-3對靶細(xì)胞殺傷效應(yīng)的特異性，使用抗體中和實驗觀察EphrinA1能否拮抗重組EphrinA1-caspase-3 T淋巴細(xì)胞對EphA2陽性乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用,抗體中和實驗主要操作如下：(1)抗EphrinA1的血清56℃滅活30 min；(2)于96孔板每個孔中預(yù)先加入50 μl無血清培養(yǎng)基，取滅活后的血清從第1列開始連續(xù)進(jìn)行2倍濃度梯度稀釋；(3)加入50 μl EphrinA1-caspase-3感染上清，混勻后于37℃培養(yǎng)箱孵育60 min；(4)向感染上清與血清混合液中加入50 μl乳腺癌細(xì)胞或正常乳腺細(xì)胞(密度1×104cells/孔)；(5)細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后用MTT法檢測細(xì)胞存活情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用t檢驗,分析抗體稀釋度與細(xì)胞增殖相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

通過反復(fù)貼壁法分離細(xì)胞中的的成纖維細(xì)胞，得到純化后的乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞。乳腺癌細(xì)胞生長快，呈梭形、多邊形等多種形態(tài)，聚集成巢狀，貼壁生長(圖1)。

2.2 乳腺癌細(xì)胞的鑒定

EphrinA1和EphA2陽性著色部位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，結(jié)果表明正常乳腺細(xì)胞中幾乎沒有EphA2受體及EphrinA1的表達(dá),而乳腺癌細(xì)胞中可見高水平的EphA2受體及EphrinA1表達(dá)(圖2)。

圖1 正常乳腺細(xì)胞(A)和乳腺癌細(xì)胞(B)培養(yǎng)，×100Fig 1 Normal breast cells(A) and breast cancer cells (B) culture，×100

圖2 間接免疫熒光檢測乳腺癌細(xì)胞EphrinA1染色，×100Fig 2 Indirect immunofluorescence identification of breast cancer cells，EphrinA1，×100A, C: Normal and breast cancer cells; B, D: EphA2 staining for normal and breast cancer cells

2.3 EphrinA1-caspase-3對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示(圖3)，Ad-EphrinA1-caspase-3液感染對正常乳腺細(xì)胞的生長的影響性不大，對乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的生長抑制作用(P<0.05),Ad-EphrinA1-caspase-3液對乳腺癌細(xì)胞生長的抑制率為48.9%。

圖3 EphrinA1-caspase-3對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effect of EphrinA1-caspase-3 on cell proliferation of brest cancer cells

2.4 EphrinA1-caspase-3對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

上清稀釋度為0、1、2、4、8對應(yīng)的凋亡率為36%、24%、18%、8%、 7%，顯著高于對照組4%(P<0.05)，表明EphrinA1-caspase-3能夠促進(jìn)EphA2陽性乳腺癌細(xì)胞的凋亡，且呈濃度依賴性。

2.5 抗體中和實驗

結(jié)果顯示(圖4)，隨著抗體稀釋度的增加細(xì)胞的增殖也隨著增加(r=0.994,P=0.001)，證明中和抗體能有效的減弱重組EphrinA1-caspase-3對EphA2陽性乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，同時也證明EphrinA1-caspase-3能特異性的抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。

圖4 中和抗體實驗Fig 4 Neutralizing antibody test

3 討論

細(xì)胞凋亡在生物體內(nèi)是普遍存在的現(xiàn)象，具有重要的生物學(xué)意義[5]。細(xì)胞凋亡異常在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中占有十分重要的地位。在腫瘤治療方面,放療、化療、內(nèi)分泌治療均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡,并且可能是腫瘤細(xì)胞死亡的主要形式[6]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶家族caspase的重要一員，是位于級聯(lián)反應(yīng)下游的調(diào)控效應(yīng)分子，被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行者[7-8]。而本實驗Ad-EphrinA1-caspase-3感染上清對乳腺癌細(xì)胞增殖表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，生長抑制率達(dá)到 48.9%，表明EphrinA1-caspase-3Ad-EphrinA1-caspase-3感染上清能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。黃凌燕等[9]研究顯示caspase-3蛋白含量的降低與乳腺癌細(xì)胞凋亡減少有關(guān)，和本實驗結(jié)果一致，且EphrinA1-caspase-3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡呈濃度依賴性。

Eph基因家族是最大的RTKs家族成員, EphA2是該家族中被發(fā)現(xiàn)具有酪氨酸激酶活性的第1個基因。EphA2定位于人染色體 1p36.1, 編碼1個含有976個氨基酸殘基的多肽, 為膜結(jié)合Ⅰ型糖蛋白。EphA2廣泛高表達(dá)于許多人類腫瘤, 前列腺癌[10]、乳癌[ 11]、惡性黑色素瘤[ 12]、非小細(xì)胞肺癌[ 13]、結(jié)腸癌[ 14]及卵巢癌[ 15]等多種實體瘤中均存在 EphA2受體高表達(dá)。EphA2受體在惡性腫瘤中高表達(dá)的可能機(jī)制為蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加、基因表達(dá)失調(diào)[16]。趙玉斌等[17]研究顯示EphA2過表達(dá)于乳腺癌組織中，且表達(dá)強(qiáng)度隨乳腺癌惡性度的增高而增強(qiáng)，本研究在乳腺癌細(xì)胞的鑒定中也得出正常乳腺細(xì)胞中幾乎沒有EphA2受體及EphrinA1的表達(dá)，而乳腺癌細(xì)胞中可見高水平的EphA2受體及EphrinA1表達(dá)，且EphA2、EphrinA1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜, 呈棕黃色或棕褐色[18]。它們在乳腺癌的陽性率與病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和組織學(xué)分級相關(guān)[19]。EphA2有望成為診斷乳腺癌1個新的標(biāo)志物和分子治療的靶點(diǎn)。

EphrinA1是EphA2受體的主要配體之一。EphrinA1和EphA2在許多惡性腫瘤組織和腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞共同表達(dá),這種重疊表達(dá)模式允許EphrinA1和EphA2的充分接觸[20]。在抗體中和實驗中,中和抗體能有效減弱重組EphrinA1-caspase-3對EphA2陽性乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)合以上實驗結(jié)果說明EphrinA1-caspase-3能特異性抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。