王　潔， 李辛雷， 殷恒福， 范正琪， 李紀元

(中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所， 浙江 杭州 311400)

茶梅(CamelliasasanquaThunb.)為山茶屬(CamelliaLinn.)植物[1]，冬季和春季開花，盛花期在冬季，是寒冬時期少有的開花植物，具有較高的觀賞價值，在園林綠化上應(yīng)用廣泛[2]。與同屬的金花茶(C.nitidissimaChi)、山茶(C.japonicaLinn.)及滇山茶(C.reticulataLindl.)等種類的觀賞品種相比，茶梅品種多具有香味[3]25，香氣是其重要的園藝性狀。已有研究者對山茶和杜鵑紅山茶(C.azaleaWei)等山茶屬植物的香氣組成成分進行了研究[4-6]，明確了主體香氣組成成分及其相對含量的變化規(guī)律，為該屬植物芳香品種選育及香氣組成成分的開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。目前，雖然有研究者對茶梅花朵的揮發(fā)性成分進行了分析[7]，但對其不同花期及不同花器官中香氣組成成分的變化規(guī)律尚不清楚。

隨著山茶屬植物分子生物學研究的深入，利用生物技術(shù)和傳統(tǒng)方法培育花色豐富且具芳香氣味的品種成為茶梅育種趨勢。鑒于此，作者以具芳香氣味的茶梅品種‘冬玫瑰’(C.sasanqua‘Dongmeigui’)為實驗材料，利用GC-MS技術(shù)分析其不同花期及花器官中香氣組成成分及其相對含量，探討其中的變化規(guī)律，以期為茶梅釋香機制的研究以及克隆相關(guān)芳香基因和培育芳香型茶梅新品種提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料

實驗材料為茶梅品種‘冬玫瑰’的8年生盆栽嫁接苗，其花型為“托桂型”，外輪花瓣為大花瓣，1輪；內(nèi)輪花瓣為雄蕊瓣化的小花瓣，多輪簇擁呈球狀。該品種花期可分為花蕾期(大部分花蕾完全伸出萼片，花蕾變紅)、初花期(花瓣微展，雄蕊被包裹在花瓣中)、盛花期(花瓣完全張開，花藥發(fā)育成熟)和末花期(花瓣出現(xiàn)褶皺，質(zhì)地變薄)。

供試的盆栽嫁接苗種植于中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所試驗苗圃，按徐碧玉等[3]85-91的方法進行日常栽培養(yǎng)護。于2016年12月選取生長狀況基本一致的盆栽嫁接苗5株，在不同花期，在每一樣株樹冠外圍南向枝條的頂端分別采摘3朵花，其中，盛花期的花朵分為外輪花瓣、內(nèi)輪花瓣、雄蕊和雌蕊。所采樣品分別在采后30 min內(nèi)置于頂空樣品瓶中，進行揮發(fā)性成分萃取。

1.2　方法

1.2.1香氣組成成分提取以40 ng·μL-1癸酸乙酯0.5 μL為內(nèi)標物，采用固相微萃取法，在40 ℃條件下使用PDMS/DVB萃取頭(65 μm，美國Supelco公司)萃取30 min后進行GC-MS分析。

1.2.2GC-MS分析采用Agilent 6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)進行GC-MS分析。色譜條件：HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。進樣口溫度250 ℃(升溫程序：柱溫50 ℃，保持2 min；以3 ℃·min-1速率升溫至80 ℃，保持2 min；再以10 ℃·min-1速率升溫至210 ℃，保持1 min；最后以15 ℃·min-1速率升溫至250 ℃，保持5 min)。

質(zhì)譜條件：四級桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃。電子轟擊電離，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍30～500 amu。

1.3　數(shù)據(jù)分析

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和GC-MS聯(lián)用儀標準圖譜數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果鑒定成分；根據(jù)各化合物峰面積與內(nèi)標物峰面積計算各組成成分的相對含量。

2　結(jié)果和分析

2.1　不同花期花朵香氣的組成成分分析

2.1.1組成成分的GC-MS分析在花蕾期、初花期、盛花期和末花期，茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣的組成成分分別有30、49、42和48種，主要組成成分及其相對含量見表1。

由表1可見：在花蕾期，1，3-二甲基苯、α-蒎烯、丁香酚、十四烷、2，6-二叔丁基苯酚、十五烷、2，6-二叔丁基對甲苯酚的相對含量遠高于其余成分，但隨花朵開放這些成分的相對含量明顯下降，在初花期、盛花期和末花期其相對含量較低或極低而無法檢出。鄰二甲苯、芳樟醇、6，7-二甲基-1，2，3，5，8，8a-六氫萘和2-異丙基-5-甲基-9-亞甲基-雙環(huán)[4.4.0]十二-1-烯等成分的相對含量也較高，且隨花朵開放呈先升高后降低的趨勢。苯乙酮和順式-芳樟醇氧化物在花蕾期均未檢出，而在初花期、盛花期和末花期這2種成分的相對含量明顯高于其余成分，且隨花朵開放呈逐漸升高的趨勢，其相對含量均在末花期達到最高，在初花期、盛花期和末花期二者的相對含量總和分別達到20.08%、44.92%和62.02%，為‘冬玫瑰’花朵香氣的主要組成成分。

表1不同花期茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣的主要組成成分及其相對含量

Table1MaincomponentsandtheirrelativecontentsinaromafromflowersofCamelliasasanqua‘Dongmeigui’atdifferentfloweringstages

編號No.保留時間/minRetentiontime成分Component在不同花期的相對含量/%1)Relativecontentatdifferentfloweringstages1)BSIFSFFSLFS14.0642o-xylene4.577.64—1.1724.12351,3-dimethyl-benzene5.17———34.72302-ethyl-1-butanol———2.4844.72312-methyl-1-pentanol—4.14——55.5599α-pinene4.881.331.140.4365.8389camphene2.150.240.350.0577.0022(E,E)-2,4-nonadienal——1.00—87.3287octanal——1.060.3198.08842-ethyl-1-hexanol1.900.950.310.16109.0499acetophenone—7.4830.2744.11119.6850cis-linaloloxide—12.6014.6517.911210.0352linalool2.016.835.793.101310.1597(E)-2-nonen-1-ol1.93———1410.21926-ethenyldihydro-2,2,6-trimethyl-2H-pyran-3(4H)-one—1.472.321.231511.05003,6-dimethylene-1,7-octadiene1.17———1612.1541epoxylinalol—2.352.852.711712.8366undecane1.07———1813.47776,7-dimethyl-1,2,3,5,8,8a-hexahydronaphthalene——5.845.331915.5847tridecane3.611.390.740.392016.9023α-cubebene1.040.950.680.302117.1575eugenol8.313.10——2217.59072,6,10-trimethyl-dodecane1.061.06——2318.0063(-)-β-elemene—0.951.271.082418.2022tetradecane15.656.263.341.872518.51671-cyclohexene1.081.060.35—2618.6829cubebene—0.851.470.732718.9381[s-(E,E)]-1-methyl-5-methylene-8-(1-methylethyl)-1,6-cyclodeca-diene0.971.410.750.502819.19332,6-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol10.965.602.041.272919.3773neoclovene—1.040.400.233019.7869(+)-epi-bicyclosesquiphellandrene—2.392.010.963119.96493-methyl-tetradecane1.010.55——3220.23802-isopropyl-5-methyl-9-methylene-bicyclo[4.4.0]dec-1-ene—4.838.334.173320.50512,3-dehydro-4-oxo-β-ionone—1.100.520.293420.6891pentadecane8.343.622.001.143521.0392butylatedhydroxytoluene10.345.862.621.623621.2766δ-cadinene—1.350.990.473721.887914-pentadecenoicacid2.03———3823.0453hexadecane3.151.540.910.433925.2830heptadecane1.500.590.360.214025.81122-(1-phenylethyl)-phenol1.920.87——

1)BS： 花蕾期 Bud stage； IFS： 初花期 Initial flowering stage； FFS： 盛花期 Full flowering stage； LFS： 末花期Late flowering stage. —： 未檢出 Undetected.

由表1還可見：各花期的共有成分有13種，其中芳樟醇、十四烷、2，6-二叔丁基苯酚、十五烷和2，6-二叔丁基對甲苯酚的相對含量在各花期均在1%以上，維持在較高的水平，也是‘冬玫瑰’整個花期花朵香氣的主要組成成分。

2.1.2組成成分的類型分析對不同花期茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣的組成成分進行歸類，可劃分為7類成分，即芳香烴類、烯類、醛酮類、醇類、酚類、烷烴類和其他(包括酯類和醌類)，不同花期各類成分的相對含量見表2。

由表2可見：在花蕾期，烷烴類和酚類成分的相對含量明顯高于其余類型，但隨花朵開放明顯降低。醛酮類成分的相對含量隨花朵開放逐漸升高，在末花期達到最高(45.94%)；且在盛花期和末花期，醛酮類成分的相對含量在7類成分中均最高。在各花期，醇類和烯類成分的相對含量均較高，且隨花朵開放總體上呈先升高后降低的趨勢。醇類成分相對含量的最高值出現(xiàn)在末花期，為27.07%；烯類成分相對含量的最高值出現(xiàn)在盛花期，為21.40%。各花期芳香烴類成分的相對含量均介于5%～10%之間，并隨花朵開放呈先降低后升高的趨勢。

表2不同花期茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣的主要組成成分的類型及其相對含量1)

Table2MaincomponenttypesandtheirrelativecontentsinaromafromflowersofCamelliasasanqua‘Dongmeigui’atdifferentfloweringstages1)

花期Floweringstage各類成分的相對含量/% Relativecontentofeachtypeofcomponent芳香烴類Aromatichydrocarbons烯類Alkenes醛酮類Aldehydesandketones醇類Alcohols酚類Phenols烷烴類Alkanes其他ElseBS9.7412.160.566.4631.3535.912.73IFS8.4921.0310.6526.8715.4317.55—FFS5.8421.4035.1724.114.668.83—LFS7.0512.1445.9427.072.894.550.34

1)BS： 花蕾期 Bud stage； IFS： 初花期 Initial flowering stage； FFS： 盛花期 Full flowering stage； LFS： 末花期Late flowering stage. —： 未檢出 Undetected.

2.2　盛花期不同花器官香氣的組成成分分析

2.2.1組成成分的GC-MS分析在盛花期，茶梅品種‘冬玫瑰’的外輪花瓣、內(nèi)輪花瓣、雄蕊和雌蕊香氣的組成成分分別有31、48、34和24種，內(nèi)輪花瓣香氣的組成成分最多，其次是雄蕊和外輪花瓣，而雌蕊香氣的組成成分明顯較少。不同器官香氣的主要組成成分及其相對含量見表3。

由表3可見：總體上看，在不同花器官中，苯乙酮和順式-芳樟醇氧化物的相對含量明顯高于其余成分，為各花器官香氣的主體成分。其中，苯乙酮的相對含量在內(nèi)輪花瓣和雄蕊中分別達到49.11%和61.27%，在外輪花瓣中達到24.07%，而在雌蕊中僅為0.96%；順式-芳樟醇氧化物在外輪花瓣中未檢出，但在內(nèi)輪花瓣和雄蕊中相對含量分別達到25.18%和15.05%，在雌蕊中相對含量也達到9.21%；苯乙酮和順式-芳樟醇氧化物在內(nèi)輪花瓣和雄蕊中相對含量的總和分別達到74.29%和76.32%，說明這2種成分是內(nèi)輪花瓣和雄蕊香氣的主體成分。除主體成分外，內(nèi)輪花瓣和雄蕊中相對含量較高的成分還有芳樟醇(分別為6.37%和5.65%)，外輪花瓣中相對含量較高的成分則為2-異丙基-5-甲基-9-亞甲基-雙環(huán)[4.4.0]十二-1-烯和6，7-二甲基-1，2，3，5，8，8a-六氫萘(分別為14.64%和11.50%)，雌蕊中相對含量較高的成分則為十四烷和1-辛醇(分別為10.41%和9.90%)。

由表3還可見：盛花期各花器官的共有成分有12種，其中，芳樟醇、環(huán)氧芳樟醇和2-異丙基-5-甲基-9-亞甲基-雙環(huán)[4.4.0]十二-1-烯的相對含量在各花器官中均達到1%以上，維持在較高的水平；而苯乙酮的相對含量在外輪花瓣、內(nèi)輪花瓣和雄蕊中均最高(均在24%以上)，僅在雌蕊中較低(0.96%)。十四烷、2，6-二叔丁基苯酚、十五烷和2，6-二叔丁基對甲苯酚4種共有成分的相對含量在外輪花瓣和雌蕊中均較高(均在3%以上)，在內(nèi)輪花瓣和雄蕊中均較低，且這4種共有成分也是該品種不同花期花朵的共有成分(表1)。

表3盛花期茶梅品種‘冬玫瑰’不同花器官香氣的主要組成成分及其相對含量

Table3MaincomponentsandtheirrelativecontentsinaromafromdifferentfloralorgansofCamelliasasanqua‘Dongmeigui’atfullfloweringstage

序號No.保留時間/minRetaintiontime成分Component在不同花器官中的相對含量/%1)Relativecontentindifferentfloralorgans1)OPeIPeStPi14.68751-propoxy-pentane—3.67——24.70522-ethyl-1-butanol——2.37—36.53931-heptanol———2.5147.0736(E,E)-2,4-nonadienal——0.316.4057.7323octanal———8.1368.07052-ethyl-1-hexanol———2.0479.0499acetophenone24.0749.1161.270.9689.07941-octanol———9.9099.6849cis-linaloloxide—25.1815.059.21109.9876nonanal———6.311110.0232linalool1.676.375.658.321210.20726-ethenyldihydro-2,2,6-trimethyl-2H-pyran-3(4H)-one4.371.171.12—1312.1362epoxylinalol3.573.862.802.061412.6941methylsalicylate—0.131.09—1513.47006,7-dimethyl-1,2,3,5,8,8a-hexahydronaphthalene11.501.66——1615.5846tridecane0.890.080.301.911718.0063(-)-β-elemene2.240.360.330.091818.2022tetradecane5.140.261.2810.411918.9381[s-(E,E)]-1-methyl-5-methylene-8-(1-methylethyl)-,1,6-cyclodecadiene1.580.190.19—2018.9441cubebene2.670.330.35—2119.19332,6-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol3.630.190.627.552219.7869(+)-epi-bicyclosesquiphellandrene2.820.350.38—2320.1430γ-selinene1.260.200.14—2420.23802-isopropyl-5-methyl-9-methylene-bicyclo[4.4.0]dec-1-ene14.642.452.352.252520.6238(+)-aromadendrene1.680.250.220.402620.6891pentadecane3.120.210.565.442721.0392butylatedhydroxytoluene4.840.320.728.402821.2766δ-cadinene1.440.200.13—2923.0453hexadecane1.160.070.172.323025.2830heptadecane—0.03—1.153125.79922-(1-phenylethyl)-phenol——0.111.35

1)OPe： 外輪花瓣 Outer petal； IPe： 內(nèi)輪花瓣 Inner petal； St： 雄蕊 Stamen； Pi： 雌蕊Pistil. —： 未檢出Undetected.

2.2.2組成成分的類型分析對盛花期茶梅品種‘冬玫瑰’不同花器官的香氣組成成分進行歸類，也可劃分為7類成分，即芳香烴類、烯類、醛酮類、醇類、酚類、烷烴類和其他(包括酯類和醌類)，不同花器官中各類成分的相對含量見表4。

由表4可見：在外輪花瓣的香氣中，烯類成分的相對含量最高，為33.11%；其次為醛酮類成分，相對含量為29.21%。內(nèi)輪花瓣和雄蕊的香氣組成均以醛酮類成分為主，相對含量分別高達50.79%和63.07%；其次為醇類成分，其相對含量分別也達到35.54%和26.09%；其余各類成分的相對含量均較低。在雌蕊的香氣中，各類成分的相對含量差異不明顯，其中醇類成分的相對含量最高(34.61%)，其次為醛酮類、烷烴類和酚類成分，其相對含量分別為22.69%、22.03%和17.30%。

表4盛花期茶梅品種‘冬玫瑰’不同花器官香氣的主要組成成分的類型及其相對含量1)

Table4MaincomponenttypesandtheirrelativecontentsinaromafromdifferentfloralorgansofCamelliasasanqua‘Dongmeigui’atfullfloweringstage1)

花器官Floweringstage各類成分的相對含量/% Relativecontentofeachtypeofcomponent芳香烴類Aromatichydrocarbons烯類Alkenes醛酮類Aldehydesandketones醇類Alcohols酚類Phenols烷烴類Alkanes其他ElseOPe12.3933.1129.215.248.4711.56—IPe2.086.3750.7935.540.514.440.26St—5.9363.0726.091.452.361.09Pi—3.4422.6934.6117.3022.03—

1)OPe： 外輪花瓣Outer petal； IPe： 內(nèi)輪花瓣Inner petal； St： 雄蕊Stamen； Pi： 雌蕊Pistil. —： 未檢出Undetected.

3　討論和結(jié)論

對花的揮發(fā)性成分的研究結(jié)果表明：苯乙酮具有強烈的山楂香味和甜香[8]，而芳樟醇氧化物則具有百合花或玉蘭花香型[4]；揮發(fā)性香氣組成成分的含量直接影響香氣的表達[9]。本研究中，茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣中苯乙酮和順式-芳樟醇氧化物的相對含量在初花期至末花期均較高，說明這2種成分可能為該品種花朵香氣的主體成分，對整體香氣表達起主導(dǎo)作用，而這些香氣的主體成分在不同花期的變化規(guī)律尚不清楚，有待進一步深入研究。不同植物的香氣組成成分存在較大差異[10]，茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣的主體成分與茶〔Camelliasinensis(Linn.) O. Ktze.〕花朵香氣中的成分[11-12]類似，但與山茶花朵香氣的主體成分[6]有一定差異。茶梅品種‘冬玫瑰’花朵中苯乙酮相對含量最高，其次為順式-芳樟醇氧化物和芳樟醇等成分；而山茶品種‘克瑞墨大牡丹’(‘Kramer’s Supreme’)花朵中芳樟醇相對含量最高，其次為順式-芳樟醇氧化物、水楊酸甲酯和十四烷等[6]。這種同屬的不同種類植物花朵香氣組成成分的差異一方面可能與其產(chǎn)地生境的差異有關(guān)，另一方面也可能與不同種類次生代謝物合成途徑的遺傳差異有關(guān)，具體原因有待進一步研究。

醛酮類和醇類成分的香氣值一般較高[4，13]，而本研究中，醛酮類成分在茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣中相對含量最高，且隨著花朵開放其相對含量持續(xù)增高，而醇類成分的相對含量在各花期均較高，說明醛酮類和醇類成分是茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣濃度的關(guān)鍵成分。通常烯類成分的嗅感閾值較低，且對嗅覺有增效作用[8]，如α-蒎烯和莰烯等是多種具有濃郁芳香氣味花朵的主體成分[14-15]；茶梅品種‘冬玫瑰’花朵中烯類成分較多，且相對含量在各花期均相對較高，并隨花朵開放而升高，僅在末花期降低，說明烯類成分對茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣也可能有主導(dǎo)作用。花朵的香氣是在開放過程中逐漸釋放的，茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣的釋放也如此，但在其香氣組成成分中烷烴類和酚類成分的相對含量在花蕾期較高，隨花朵開放呈明顯下降趨勢，在初花期、盛花期和末花期均較低，說明這2類成分不是茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣的主體成分，但該品種花朵香氣的各組成成分在花朵開放過程中的變化趨勢可能受各類成分的代謝途徑以及相關(guān)酶活性的變化等因子影響[6，16]。

張瑩等[16]認為，植物的釋香部位是花瓣，雌蕊、雄蕊和蜜腺等也能散發(fā)少量香氣；李辛雷等[5]認為，杜鵑紅山茶的花瓣和雄蕊是釋放香氣的主要部位；山茶品種‘克瑞墨大牡丹’的所有花瓣的花香絕對揮發(fā)量是所有雄蕊的3倍以上，但相同質(zhì)量雄蕊的香氣絕對揮發(fā)量卻明顯高于花瓣[6]；而徐碧玉等[3]19認為，茶梅花香的主要釋放部位為雄蕊。本研究中，茶梅品種‘冬玫瑰’內(nèi)輪花瓣和雄蕊中苯乙酮和順式-芳樟醇氧化物2種成分的相對含量均最高，而在外輪花瓣中二者的相對含量明顯很低或無，茶梅品種‘冬玫瑰’的內(nèi)輪花瓣主要由雄蕊瓣化發(fā)育而來，說明該品種花朵的雄蕊可能是其香氣的主要釋放器官。植物產(chǎn)生香氣的部位通常為花器官的基本薄壁組織或特化的腺狀表皮細胞[17]，花器官對花香的釋放并不取決于其組成成分的揮發(fā)特性，而取決于這些成分合成區(qū)域膜結(jié)構(gòu)上的某些載體對其選擇性的釋放特性[13，18]，但茶梅品種‘冬玫瑰’花朵香氣組成成分的來源途徑、亞細胞定位及相關(guān)酶活性的變化等尚不明確，有待進一步研究。

由上述研究結(jié)果可見：茶梅品種‘冬玫瑰’不同花期的香氣組成成分中共有成分有13種，在不同花器官中共有成分有12種，各花期以及各花器官中均存在的共有成分有7種，其中，芳樟醇、十四烷、2，6-二叔丁基苯酚、十五烷和2，6-二叔丁基對甲苯酚的相對含量不但在各花期均較高(均在1%以上)，也是盛花期各花器官中相對含量較高的共有成分，這些共有成分構(gòu)成了茶梅品種‘冬玫瑰’花香氣的基礎(chǔ)成分，是茶梅品種‘冬玫瑰’整個花期花朵香氣的主要成分。其中，十四烷、2，6-二叔丁基苯酚、十五烷和2，6-二叔丁基對甲苯酚4種共有成分的相對含量在外輪花瓣和雌蕊中均較高(均在3%以上)，在內(nèi)輪花瓣和雄蕊中均較低，從化學成分方面也佐證了茶梅品種‘冬玫瑰’的內(nèi)輪花瓣與雄蕊起源相同。

綜合分析結(jié)果表明：茶梅品種‘冬玫瑰’花朵中苯乙酮相對含量最高，其次為順式-芳樟醇氧化物，二者為花朵香氣的主體成分，是影響其香氣表達程度的關(guān)鍵成分。在花朵開放過程中，各成分相對含量變化不盡相同，2種主體成分的相對含量呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。盛花期茶梅品種‘冬玫瑰’花朵的內(nèi)輪花瓣和雄蕊是香氣釋放的主要部位，其香氣組成成分的種類及其主體成分苯乙酮和順式-芳樟醇氧化物的相對含量明顯高于外輪花瓣和雌蕊。

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