金　曼， 蘇彥華

(1. 中國科學院南京土壤研究所 土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室， 江蘇 南京 210008； 2. 中國科學院大學， 北京 100049)

沙冬青〔Ammopiptanthusmongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.〕隸屬于豆科(Fabaceae)沙冬青屬(AmmopiptanthusCheng f.)，是中國西北阿拉善荒漠地區(qū)特有的常綠闊葉灌木，也是第三紀殘遺物種，為稀有瀕危植物[1]。沙冬青主要分布區(qū)生境嚴酷，氣候干旱，年蒸發(fā)量為年降水量的20多倍；夏季酷熱，高溫可達35 ℃以上；冬季嚴寒，低溫可至-30 ℃～-20 ℃[2]。此外，沙冬青在固定流沙以及防止沙漠化方面有重要作用。鑒于沙冬青具有在嚴苛環(huán)境條件下生存的能力及在生態(tài)上的重要地位，可將其作為植物抗逆研究的重要材料。

目前已經(jīng)從沙冬青中分離克隆得到多個參與逆境脅迫的抗性相關基因，這些抗逆相關基因編碼的蛋白質可分為2大類：一類為具有保護作用的功能性蛋白質，主要為與逆境脅迫相關的蛋白質，如晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白AmLEA[3]和脫水素蛋白AmDHN[4]等；與滲透調節(jié)物質合成和降解相關的酶類，如肌醇半乳糖苷合成酶AmGolS[5]和脯氨酸轉運體AmProT[6]等；與植物毒性物質降解、抗氧化防御能力相關的酶類，如超氧化物歧化酶AmSOD、谷胱甘肽過氧化物酶AmGPX以及抗壞血酸過氧化物酶AmAPX[7]等。另一類為參與逆境條件下信號轉導和轉錄調控相關的蛋白質，主要包括響應及轉導脅迫信號的磷酸酶AmCBL[8]，以及與脅迫相關的轉錄因子AmDREB[9]和AmMYB[10]等。

轉錄因子是一類在轉錄調控過程中具有十分重要作用的蛋白質，在植物逆境響應調控網(wǎng)絡中起關鍵作用[11]。當植物受到逆境脅迫后，轉錄因子與下游基因啟動子部分特異性結合并對基因的表達進行調控，進而調節(jié)細胞內的逆境應答物質含量以響應逆境脅迫。由于轉錄因子在轉錄調控過程中具有不可或缺的作用，在對逆境脅迫響應的研究中，當前的研究熱點聚焦于轉錄因子及其與下游靶基因的識別與調控[11]。通過轉錄組測序技術，可以獲得大量的在逆境脅迫下的植物轉錄本數(shù)據(jù)，并為篩選響應逆境脅迫的轉錄因子，以及為后續(xù)調控機制的研究提供充足的基因資源。

本研究對非生物脅迫處理前后沙冬青幼苗進行轉錄組測序及分析，以期為更深入地研究沙冬青響應非生物脅迫的分子機制提供基因資源庫，并為進一步鑒定下游的重要非生物響應基因以及研究其調控機制奠定基礎。

1　材料和方法

1.1　材料

沙冬青種子由甘肅民勤沙生植物園提供。將沙冬青種子用流動的清水沖洗干凈后，挑取大小一致、籽粒飽滿的種子用體積分數(shù)70%乙醇浸泡30 s，無菌水清洗4～5次后，在黑暗條件下清水浸泡1 d，使種子充分吸脹。將吸脹的沙冬青種子轉移到鋪滿浸潤無菌水的吸水紙的滅菌培養(yǎng)皿中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中遮光萌發(fā)催芽。3 d后，將發(fā)芽后長勢基本一致的沙冬青幼苗轉移至塑料盒中，用改良的1/2Hoagland營養(yǎng)液(pH 5.8)進行培養(yǎng)[6]，每隔2 d更換1次營養(yǎng)液。

對在1/2Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)3周的沙冬青幼苗進行質量體積分數(shù)18%聚乙二醇6000(PEG 6000)模擬的干旱脅迫以及100 mmol·L-1NaCl模擬的鹽脅迫。分別于脅迫1、6、12、24和48 h對地上部和地下部的組織取樣，并以脅迫0 h的樣品為對照，將樣品用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2　轉錄因子分析及差異表達基因選擇

沙冬青轉錄組數(shù)據(jù)來源于作者所在實驗室前期實驗結果。采用RNAiso Plus試劑〔寶生物工程(大連)有限公司〕分別提取正常培養(yǎng)3周以及質量體積分數(shù)18%聚乙二醇6000處理6 h的沙冬青幼苗地上部和地下部的總RNA，構建cDNA文庫。使用Illumina HiSeqTM2000測序儀(美國Illumina公司)對上述樣品進行轉錄組測序，測序結果經(jīng)過質量控制過濾去除無效序列，拼接后得到44 959條沙冬青unigenes序列，以fasta格式保存。

利用InterProScan軟件(http：∥www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)和PlnTFDB 3.0數(shù)據(jù)庫(http：∥plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/)對沙冬青轉錄組數(shù)據(jù)中拼接獲得的unigenes進行轉錄因子預測。通過Hmmsearch軟件搜尋植物轉錄因子基因的保守域，并將具有這些植物轉錄因子基因保守域的unigenes歸類到相應的轉錄因子基因家族中。通過RPKM(reads per kilobase per million reads)法計算沙冬青unigenes的表達豐度(RPKM值)，根據(jù)在干旱脅迫處理條件與對照條件下基因的表達豐度計算其表達量的差異[12]。將表達量差異倍數(shù)大于等于2倍的轉錄因子視為差異表達轉錄因子。

1.3　總RNA提取及熒光定量PCR

采用RNAiso Plus試劑〔寶生物工程(大連)有限公司〕分別提取經(jīng)干旱脅迫和NaCl脅迫的沙冬青幼苗地上部和地下部的總RNA，根據(jù)PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說明書合成第1鏈cDNA，用于后續(xù)基因定量表達分析。通過Primer Premier 5軟件設計6個在轉錄組中差異表達的AmbHLH基因的熒光定量PCR引物，引物序列見表1，并以編號為comp62392的基因(AmeIF1)[7]作為沙冬青的內參基因，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。根據(jù)SYBR?PremixExTaqTM試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說明書，在Bio-Rad CFX-96實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進行qRT-PCR反應。反應體系總體積20.0 μL，包含SYBRPremixExTaq10.0 μL、正向引物和反向引物各0.4 μL、ddH2O稀釋5倍后的cDNA 5.0 μL及ddH2O 4.2 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。每個樣品3次重復，采用2-ΔΔCT法[13]計算基因的相對表達量。

表1用于沙冬青AmbHLH基因熒光定量PCR擴增的引物序列

Table1PrimersequencesusedforfluorescencequantitativePCRamplificationofAmbHLHgenesfromAmmopiptanthusmongolicus(Maxim.exKom.)Chengf.

基因編號GeneID正向引物序列(5'→3')Sequenceofforwardprimer(5'→3')反向引物序列(5'→3')Sequenceofreverseprimer(5'→3')comp62392(AmeIF1)CTGACATGCGCCGTAGGAACGCCCTGCTTATGCCAGTCTTTTcomp55415TGCAGCATCAAGTGGAGTTCTCATCAACTGGCAACTACT-TCTcomp38040ATTGCTCAGATGGGCGAAGGATGTAGCCGTGCGTAGTGTCcomp58250TGACTTGTCCATCATCTG-GTTTGAGGAGGCTTAGCCATAGACACcomp64918.1GATTTGCTCGCATCACTGGGGGAACAGTGTGACACCAGACAcomp64918.2GCTCATTGACGCCAAATTCTTGGTCTGCGGGTACAAAACAcomp65919AAGAGATGGTTCCCGCTTGGTCTGGAGGGTTTATCCCCGT

2　結果和分析

2.1　干旱脅迫下沙冬青轉錄因子基因鑒定

對轉錄組測序拼接的unigenes進行轉錄因子分析，結果表明：沙冬青中共有1 575個unigenes(即1 575個轉錄因子基因)，歸類到49個轉錄因子基因家族(圖1)。在沙冬青各轉錄因子基因家族中基因數(shù)最多的為MYB基因家族，共有222個轉錄因子基因；之后依次為AP2-EREBP基因家族(144個轉錄因子基因)、bHLH基因家族(114個轉錄因子基因)、DBP基因家族(106個轉錄因子基因)、NAC基因家族(82個轉錄因子基因)和WRKY基因家族(79個轉錄因子基因)。

圖1　沙冬青轉錄因子基因家族分類Fig. 1　Classification of transcription factor gene families from Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f.

2.2　干旱脅迫下沙冬青差異表達轉錄因子基因分析

干旱脅迫下沙冬青地上部共有44個轉錄因子基因差異表達，其中，33個轉錄因子基因上調表達，11個轉錄因子基因下調表達；地下部共有57個轉錄因子基因差異表達，其中，50個轉錄因子基因上調表達，7個轉錄因子基因下調表達(表2)。NAC基因家族中差異表達轉錄因子基因的數(shù)量最多，地上部和地下部分別有8和9個差異表達轉錄因子基因；之后依次為AP2-EREBP基因家族(地上部和地下部分別有6和9個差異表達轉錄因子基因)、MYB基因家族(地上部和地下部均有7個差異表達轉錄因子基因)和WRKY基因家族(地上部和地下部分別有7和2個差異表達轉錄因子基因)。

干旱脅迫下沙冬青差異表達轉錄因子基因表達量差異倍數(shù)的分布情況見圖2。由圖2可以看出：干旱脅迫下沙冬青差異表達轉錄因子基因在地上部和地下部的表達模式不同，地上部表達量的差異倍數(shù)為2～5倍的轉錄因子基因最多，而地下部表達量的差異倍數(shù)為5(含5)～10(含10)倍的轉錄因子基因最多。在地上部，表達量的差異倍數(shù)在10(含10)倍以內的轉錄因子基因有35個，占地上部差異表達轉錄因子基因總數(shù)的79.5%。其中，表達量上(下)調2～5倍的轉錄因子基因有23個，占地上部差異表達轉錄因子基因總數(shù)的52.3%；表達量上(下)調5(含5)～10(含10)倍的轉錄因子基因有12個，占地上部差異表達轉錄因子基因總數(shù)的27.3%。表達量的差異倍數(shù)在10倍以上的轉錄因子基因有9個，占地上部差異表達轉錄因子基因總數(shù)的20.5%。

表2干旱脅迫下沙冬青地上部和地下部差異表達轉錄因子基因分析1)

Table2Analysesondifferentiallyexpressedtranscriptionfactorgenesfromabove-andunder-groundpartsofAmmopiptanthusmongolicus(Maxim.exKom.)Chengf.underdroughtstress1)

轉錄因子基因家族Transcriptionfactorgenefamily地上部Above-groundpart地下部Under-groundpartNUNDNUNDNAC8090AP2-EREBP3390MYB6170WRKY7011DBP3050bHLH1032GRAS0130HSF2020C2C2-GATA0201C3H1110OFP1010C2C2-YABBY0100CPP0100mTERF0100SBP1000ABI3VP10020C2C2-Dof0011LOB0020MADS0011LIM0001Sigma70-like0010TCP0010zf-HD0010合計Total3311507

1)NU： 上調差異表達轉錄因子基因數(shù)Number of up-regulated differentially expressed transcription factor genes； ND： 下調差異表達轉錄因子基因數(shù)Number of down-regulated differentially expressed transcription factor genes.

□： 地上部Above-ground part； ： 地下部Under-ground part. FC： 差異倍數(shù)Fold change. Ⅰ： -10≤FC≤-5； Ⅱ： -510. 負數(shù)表示基因下調表達，正數(shù)表示基因上調表達The negative numbers mean down-regulated expression of genes， and the positive numbers mean up-regulated expression of genes.圖2　干旱脅迫下沙冬青差異表達轉錄因子基因表達量的差異倍數(shù)分布Fig. 2　Distribution of fold change of expression level of differentially expressed transcription factor genes from Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under drought stress

在地下部，表達量的差異倍數(shù)在10(含10)倍以內的轉錄因子基因有38個，占地下部差異表達轉錄因子基因總數(shù)的66.7%。其中，表達量上(下)調2～5倍的轉錄因子基因有14個，占地下部差異表達轉錄因子基因總數(shù)的24.6%；表達量上(下)調5(含5)～10(含10)倍的轉錄因子基因有24個，占地下部差異表達轉錄因子基因總數(shù)的42.1%。表達量的差異倍數(shù)在10倍以上的轉錄因子基因有19個，占地下部差異表達轉錄因子基因總數(shù)的33.3%。

2.3　干旱脅迫下沙冬青差異表達bHLH轉錄因子的系統(tǒng)進化分析

bHLH類轉錄因子是植物體內一類重要的轉錄因子家族，在植物響應逆境脅迫過程中起著重要的調控作用。對沙冬青轉錄組數(shù)據(jù)的分析結果顯示：沙冬青中存在114個bHLH基因，當受到干旱脅迫后，表達量的差異倍數(shù)大于等于2倍的bHLH基因有6個。在轉錄組數(shù)據(jù)中對這6個bHLH基因進行搜索，獲得各基因序列開放閱讀框的全長，這6個bHLH基因在轉錄組中的編號分別為comp64918.1、comp64918.2、comp55415、comp58250、comp65919和comp38040。利用NCBI的BLASTp軟件對這6個bHLH基因編碼的氨基酸序列進行同源性比對，分析結果表明：這6個bHLH基因編碼的氨基酸序列與擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕bHLH基因編碼的氨基酸序列有不同程度的相似性。

對沙冬青中6個差異表達bHLH基因和擬南芥bHLH基因編碼的氨基酸序列進行聚類分析(圖3)。結果顯示：沙冬青中編號為comp55415的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號為AT1G73830.1的基因(BEE3，BRenhancedexpression3)編碼的氨基酸序列的相似度為46%，編號為comp38040的基因編碼的氨基酸序列與編號為AT4G37850.1的基因編碼的氨基酸序列的相似度為41%，編號為comp58250的基因編碼的氨基酸序列與編號為AT1G10120.1的基因編碼的氨基酸序列的相似度為42%，編號為comp64918.1和comp64918.2的基因編碼的氨基酸序列與編號為AT3G43790.3的基因(ZIFL2，zincinducedfacilitator-like2)和編號為AT5G13750.1的基因(ZIFL1，zincinducedfacilitator-like1)編碼的氨基酸序列的相似度較高，相似度分別為54%和59%，編號為comp65919的基因編碼的氨基酸序列與編號為AT4G34530.1的基因(CIB1，cryptochrome-interactingbasic-helix-loop-helix1)編碼的氨基酸序列的相似度可達55%。

AT4G37850.1，AT1G10120.1，AT1G73830.1，AT4G34530.1，AT5G13750.1，AT3G43790.3： 擬南芥bHLH基因的編號ID of bHLH genes from Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 沙冬青bHLH基因的編號ID of bHLH genes from Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f.圖3　干旱脅迫下沙冬青差異表達bHLH基因和擬南芥bHLH基因編碼的氨基酸序列的聚類分析Fig. 3　Cluster analysis on amino acid sequences encoded by differentially expressed bHLH genes from Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under drought stress and bHLH genes from Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

2.4　干旱脅迫和NaCl脅迫下沙冬青差異表達bHLH基因的表達模式

通過熒光定量PCR對干旱脅迫和NaCl脅迫下沙冬青地上部和地下部6個差異表達bHLH基因的表達模式進行分析，結果分別見圖4至圖7。

由圖4可以看出：隨著干旱脅迫時間的延長，沙冬青地上部差異表達bHLH基因的相對表達量略有波動，除編號為comp55415的基因的相對表達量在干旱脅迫1 h明顯提高外，其他5個差異表達bHLH基因的相對表達量總體上低于2.0。

comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 基因編號Gene ID.圖4　干旱脅迫下沙冬青地上部差異表達bHLH基因的表達模式Fig. 4　Expression pattern of differentially expressed bHLH genes from above-ground part of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under drought stress

comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 基因編號Gene ID.圖5　干旱脅迫下沙冬青地下部差異表達bHLH基因的表達模式Fig. 5　Expression pattern of differentially expressed bHLH genes from under-ground part of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under drought stress

comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 基因編號Gene ID.圖6　NaCl脅迫下沙冬青地上部差異表達bHLH基因的表達模式Fig. 6　Expression pattern of differentially expressed bHLH genes from above-ground part of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under NaCl stress

comp64918.1，comp64918.2，comp55415，comp58250，comp65919，comp38040： 基因編號Gene ID.圖7　NaCl脅迫下沙冬青地下部差異表達bHLH基因的表達模式Fig. 7　Expression pattern of differentially expressed bHLH genes from under-ground part of Ammopiptanthus mongolicus (Maxim. ex Kom.) Cheng f. under NaCl stress

由圖5可以看出：隨著干旱脅迫時間的延長，沙冬青地下部編號為comp58250和comp65919的基因的相對表達量呈先降低后升高的趨勢，在干旱脅迫處理后期，這2個基因的相對表達量略高于對照；編號為comp64918.1、comp64918.2和comp55415的基因的相對表達量總體上高于對照；而編號為comp38040的基因的相對表達量在干旱脅迫處理前期高于對照，在干旱脅迫處理后期低于對照。此外，編號為comp64918.1、comp64918.2和comp55415的基因的相對表達量在干旱脅迫6 h達到峰值，編號為comp380405的基因的相對表達量在干旱脅迫1 h達到峰值。

由圖6可以看出：隨著NaCl脅迫時間的延長，沙冬青地上部編號為comp65919和comp38040的基因的相對表達量略有下降；編號為comp64918.2、comp55415和comp58250的基因的相對表達量總體上升高；而編號為comp64918.1的基因的相對表達量在NaCl脅迫12 h高于對照并達到峰值，在其他脅迫時間則低于對照。

由圖7可以看出：隨著NaCl脅迫時間的延長，沙冬青地下部編號為comp64918.1、comp64918.2、comp55415和comp38040的基因的相對表達量呈先升高后降低的趨勢，均在NaCl脅迫6 h達到峰值；編號為comp58250和comp65919的基因的相對表達量無顯著變化，均在NaCl脅迫12 h降至最低。

3　討　　論

轉錄因子在植物響應逆境脅迫的過程中起重要的調控作用，通過調控下游功能基因的表達，從而顯著增強植物對逆境的耐受能力。沙冬青是一種古老的沙漠植物，在逆境脅迫條件下具有很強的抗逆能力，是挖掘植物抗逆相關基因的優(yōu)質物種。本研究的轉錄組測序結果顯示：干旱脅迫下沙冬青NAC、AP2-EREBP、MYB、WRKY和bHLH基因家族的差異表達基因數(shù)較多，說明這些基因在響應干旱脅迫的過程中起到重要作用。

在質量體積分數(shù)18%聚乙二醇6000模擬的干旱脅迫條件下處理6 h，沙冬青中數(shù)個包含NAC和MYB結構域的轉錄因子基因差異表達。大量研究結果表明：NAC轉錄因子家族成員參與植物的生長發(fā)育、衰老及次生壁合成等生物過程，在逆境應答響應過程中具有重要功能[14-15]。MYB轉錄因子家族成員對植物的生長發(fā)育、次級代謝和激素信號轉導以及在響應生物和非生物脅迫過程中均發(fā)揮重要的調控作用[16-17]。本研究結果表明：沙冬青在受到干旱脅迫后，其地上部和地下部分別有8和9個NAC基因表達量上調，以及6和7個MYB基因表達量上調。這2類轉錄因子家族基因在沙冬青受到干旱脅迫后響應強烈，說明其參與了沙冬青干旱脅迫響應的調控過程。

AP2-EREBP是植物特有的一類轉錄因子家族，可分為AP2和EREBP 2個亞家族[18]。AP2-EREBP轉錄因子家族成員參與植物逆境響應過程的調控，進而提高植物對逆境的耐受能力[19]。本研究認為，沙冬青地上部有6個AP2-EREBP基因在受到干旱脅迫后差異表達，表達量上調和下調的轉錄因子基因各有3個；地下部有9個AP2-EREBP基因表達量上調。AP2-EREBP轉錄因子家族不同基因在干旱脅迫下呈現(xiàn)不同的上調或下調表達模式，表明該轉錄因子家族中不同成員在干旱脅迫響應過程中的調控方式存在差異。

本研究中，沙冬青地上部有7個WRKY基因表達量上調，地下部有2個WRKY基因差異表達，表達量上調和下調的WRKY基因各1個，說明WRKY轉錄因子家族在沙冬青干旱脅迫響應過程中起到重要作用。通常，一個WRKY基因能夠響應多種脅迫條件，進而對不同的生理過程進行正調控或負調控[20]。研究結果表明：在NicotianabenthamianaDomin中過表達GhWRKY17基因可增強N.benthamiana對干旱和高鹽脅迫的耐受能力[21]，但是在水稻(OryzasativaLinn.)中過表達OsWRKY45基因則導致水稻對鹽脅迫更為敏感[22]。

bHLH轉錄因子家族具有典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構域，其不僅參與了植物體內一系列的生長發(fā)育調控過程[23-25]，而且在植物響應干旱[26-27]、高鹽[28-29]、脫落酸[30]、低溫[31]、缺鐵[32]和低磷[33]等非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要作用。本研究結果顯示：沙冬青bHLH轉錄因子家族中有114個基因，其中有6個bHLH基因在干旱脅迫處理下表達量的差異倍數(shù)大于等于2倍。這6個bHLH基因不僅在干旱脅迫下差異表達，而且在NaCl脅迫下的表達也受到不同程度的誘導。將沙冬青6個bHLH基因(編號分別為comp64918.1、comp64918.2、comp55415、comp58250、comp65919和comp38040)和擬南芥bHLH基因編碼的氨基酸序列進行聚類分析，結果顯示：根據(jù)氨基酸序列的相似度，編號為comp55415的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號為AT1G73830.1的基因(BEE3)編碼的氨基酸序列最為相似，而編號為AT1G73830.1的基因對應的轉錄因子調控植物的生長發(fā)育，促進下胚軸的伸長[34]。此外，編號為comp58250的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號為AT1G10120.1的基因編碼的氨基酸序列的相似度為42%，編號為comp65919的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號為AT4G34530.1的基因(CIB1)編碼的氨基酸序列的相似度為55%。擬南芥中編號為AT1G10120.1和AT4G34530.1的基因對應的轉錄因子均參與藍光信號響應過程，調控花周期開放[35-36]。而與編號為comp38040的基因對應的轉錄因子最為相似的擬南芥中編號為AT4G37850.1的基因對應的轉錄因子參與乙烯和生長素的響應過程[37]，從而調控逆境脅迫的響應。編號為comp64918.1和comp64918.2的基因編碼的氨基酸序列與擬南芥中編號為AT3G43790.3的基因(ZIFL2)和編號為AT5G13750.1的基因(ZIFL1)編碼的氨基酸序列的相似度最高，編號為AT3G43790.3和AT5G13750.1的基因與擬南芥體內鉀離子的平衡相關，參與調節(jié)氣孔運動，從而增強擬南芥的抗旱性能[38-39]。

本研究結果可為沙冬青干旱脅迫調控機制研究提供龐大的轉錄因子基因資源，然而，大多數(shù)轉錄因子基因在干旱脅迫響應中的功能還未明確，其調控的下游基因及其結合位點，以及對下游靶基因的調控機制尚不清楚，仍需進一步深入研究。

4　結　　論

對沙冬青轉錄組的分析結果表明：沙冬青中存在49個轉錄因子基因家族，共有1 575個轉錄因子基因。當受到質量體積分數(shù)18%聚乙二醇6000模擬的干旱脅迫處理6 h后，沙冬青地上部有44個轉錄因子基因差異表達，地下部有57個轉錄因子基因差異表達。bHLH基因家族中6個差異表達的轉錄因子基因對干旱脅迫以及NaCl脅迫有不同程度的響應，說明其在逆境脅迫調控網(wǎng)絡中具有重要作用。

參考文獻：

[1]張黨權， 宋志丹， 田曄林， 等. 抗逆模式灌木沙冬青的研究進展[J]. 中南林業(yè)科技大學學報， 2012， 32(2)： 16-22.

[2]LI W R， FENG J C， JIANG T R， et al. Seasonal changes in photosynthetic characteristics ofAmmopiptanthusmongolicus[J]. 植物學報， 1999， 41(2)： 190-193.

[3]LIU R， LIU M， LIU J， et al. Heterologous expression of aAmmopiptanthusmongolicuslate embryogenesis abundant protein gene (AmLEA) enhancesEscherichiacoliviability under cold and heat stress[J]. Plant Growth Regulation， 2010， 60： 163-168.

[4]SUN J， NIE L， SUN G， et al. Cloning and characterization of dehydrin gene fromAmmopiptanthusmongolicus[J]. Molecular Biology Reports， 2013， 40： 2281-2291.

[5]SONG J， LIU J， WENG M， et al. Cloning of galactinol synthase gene fromAmmopiptanthusmongolicusand its expression in transgenicPhotiniaserrulataplants[J]. Gene， 2013， 513： 118-127.

[6]岳光振， 金曼， 李俊林， 等. 沙冬青脯氨酸轉運體基因的克隆及表達分析[J]. 生物技術通報， 2015， 31(5)： 106-112.

[7]SHI J， LIU M， SHI J， et al. Reference gene selection for qPCR inAmmopiptanthusmongolicusunder abiotic stresses and expression analysis of seven ROS-scavenging enzyme genes[J]. Plant Cell Reports， 2012， 31： 1245-1254.

[8]CHEN J H， SUN Y， SUN F， et al. Tobacco plants ectopically expressing theAmmopiptanthusmongolicusAmCBL1 gene display enhanced tolerance to multiple abiotic stresses[J]. Plant Growth Regulation， 2011， 63： 259-269.

[9]李章磊， 高飛， 曹玉震， 等. 蒙古沙冬青AmDREB2.1基因的克隆及表達分析[J]. 生物技術通報， 2015， 31(3)： 108-114.

[10]肖自華， 高飛， 孫會改， 等. 蒙古沙冬青AmMYB4-like基因的克隆與表達分析[J]. 生物技術通報， 2017， 33(5)： 108-116.

[11]馬進， 鄭鋼， 裴翠明， 等. 南方型紫花苜蓿根系鹽脅迫應答轉錄因子鑒定與分析[J]. 浙江農林大學學報， 2016， 33(2)： 201-208.

[12]MORTAZAVI A， WILLIANMS B A， MCCUE K， et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq[J]. Nature Methods， 2008， 5： 621-628.

[13]LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J]. Methods， 2001， 25： 402-408.

[14]PURANIK S， SAHU P P， SRIVASTAVA P S， et al. NAC proteins： regulation and role in stress tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2012， 17： 369-381.

[15]NAKASHIMA K， TAKASAKI H， MIZOI J， et al. NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1819： 97-103.

[16]COMINELLI E， TONELLI C. A new role for plant R2R3-MYB transcription factors in cell cycle regulation[J]. Cell Research， 2009， 19： 1231-1232.

[17]ALLAN A C， HELLENS R P， LAING W A. MYB transcription factors that colour our fruit[J]. Trends in Plant Science， 2008， 13： 99-102.

[18]王慶靈， 劉文鑫， 趙嘉平. 山海關楊PdERF-18轉錄因子的表達特征分析[J]. 浙江農林大學學報， 2014， 31(5)： 716-723.

[19]HUSSAIN S S， KAYANI M A， AMJAD M. Transcription factors as tools to engineer enhanced drought stress tolerance in plants[J]. Biotechnology Progress， 2011， 27： 297-306.

[20]CHEN L， SONG Y， LI S， et al. The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012， 1819： 120-128.

[21]YAN H， JIA H， CHEN X， et al. The cotton WRKY transcription factor GhWRKY17 functions in drought and salt stress in transgenicNicotianabenthamianathrough ABA signaling and the modulation of reactive oxygen species production[J]. Plant and Cell Physiology， 2014， 55： 2060-2076.

[22]TAO Z， KOU Y， LIU H， et al.OsWRKY45 alleles play different roles in abscisic acid signalling and salt stress tolerance but similar roles in drought and cold tolerance in rice[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62： 4863-4874.

[23]NESI N， DEBEAUJON I， JOND C， et al. TheTT8 gene encodes a basic helix-loop-helix domain protein required for expression ofDFRandBANgenes in Arabidopsis siliques[J]. The Plant Cell， 2000， 12： 1863-1878.

[24]GROSZMANN M， PAICU T， SMYTH D R. Functional domains of SPATULA， a bHLH transcription factor involved in carpel and fruit development in Arabidopsis[J]. The Plant Journal， 2008， 55： 40-52.

[25]FUJISAWA M， NAKANO T， SHIMA Y， et al. A large-scale identification of direct targets of the tomato MADS box transcription factor RIPENING INHIBITOR reveals the regulation of fruit ripening[J]. The Plant Cell， 2013， 25： 371-386.

[26]KIRIBUCHI K， JIKUMARU Y， KAKU H， et al. Involvement of the basic helix-loop-helix transcription factor RERJ1 in wounding and drought stress responses in rice plants[J]. Bioscience Biotechnology， and Biochemistry， 2005， 69： 1042-1044.

[27]SEO J S， JOO J， KIM M J， et al. OsbHLH148， a basic helix-loop-helix protein， interacts with OsJAZ proteins in a jasmonate signaling pathway leading to drought tolerance in rice[J]. The Plant Journal， 2011， 65： 907-921.

[28]ZHOU J， LI F， WANG J L， et al. Basic helix-loop-helix transcription factor from wild rice (OrbHLH2) improves tolerance to salt- and osmotic stress inArabidopsis[J]. Journal of Plant Physiology， 2009， 166： 1296-1306.

[29]陳李淼， 沙愛華， 張嬋娟， 等. 一個大豆脫水脅迫響應的bHLH類轉錄因子的克隆及功能分析[J]. 中國油料作物學報， 2013， 35(6)： 630-636.

[30]ABE H， URAO T， ITO T， et al. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. The Plant Cell， 2003， 15： 63-78.

[31]CHINNUSAMY V， OHTA M， KANRAR S， et al. ICE1： a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance inArabidopsis[J]. Gene and Development， 2003， 17： 1043-1054.

[32]ZHANG J， LIU B， LI M， et al. The bHLH transcription factor bHLH104 interacts with IAA-LEUCINE RESISTANT3 and modulates iron homeostasis in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2015， 27： 787-805.

[33]YI K， WU Z， ZHOU J， et al.OsPTF1， a novel transcription factor involved in tolerance to phosphate starvation in rice[J]. Plant Physiology， 2005， 138： 2087-2096.

[34]CIFUENTES-ESQUIVEL N， BOU-TORRENT J， GALSTYAN A， et al. The bHLH proteins BEE and BIM positively modulate the shade avoidance syndrome in Arabidopsis seedlings[J]. The Plant Journal， 2013， 75： 989-1002.

[35]LIU Y， LI X， LI K， et al. Multiple bHLH proteins form heterodimers to mediate CRY2-dependent regulation of flowering-time inArabidopsis[J]. PLoS Genetics， 2013， 9： e1003861.

[36]LIU H T， WANG Q， LIU Y， et al.ArabidopsisCRY2 and ZTL mediate blue-light regulation of the transcription factor CIB1 by distinct mechanisms[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America， 2013， 110： 17582-17587.

[37]STEPANOVA A N， YUN J， LIKHACHEVA A V， et al. Multilevel interactions between ethylene and auxin inArabidopsisroots[J]. The Plant Cell， 2007， 19： 2169-2185.

[38]REMY E， CABRITO T R， BATISTA R A， et al. The major facilitator superfamily transporter ZIFL2 modulates cesium and potassium homeostasis in Arabidopsis[J]. Plant and Cell Physiology， 2015， 56： 148-162.

[39]REMY E， CABRITO T R， BASTER P， et al. A major facilitator superfamily transporter plays a dual role in polar auxin transport and drought dtress tolerance inArabidopsis[J]. The Plant Cell， 2013， 25： 901-926.