于延申　任梓銘　王隆洋　王　月

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院　130033）

食用菌和其它農(nóng)作物一樣，種子是保證高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病等的關(guān)鍵。而影響菌種質(zhì)量關(guān)鍵因素：一是菌源；二是制種技術(shù)。大球蓋菇作為一種珍稀食用菌，其菌種質(zhì)量的優(yōu)劣是關(guān)系到球蓋菇栽培的命脈，育菌技術(shù)程度直接影響到育菌成品率，是決定產(chǎn)量大小、菇體品質(zhì)好壞、商品價(jià)值高低的重要關(guān)鍵因素。

大球蓋菇目前生產(chǎn)上應(yīng)用的品種主要是從國外引入的菌株，品種較少，各地由于氣候條件不同，也選育分離出一些的民間種源。如：黑龍江省倪淑君老師培育出“黑農(nóng)球蓋菇1號(hào)”是比較適于北方寒地栽培的優(yōu)良品種。吉林省到目前為止還沒有自己的品種。選擇了優(yōu)良菌株只是走完了第一步，更關(guān)鍵的是掌握制種技術(shù)，嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作，才能生產(chǎn)出優(yōu)良的菌種，獲得好的栽培效果。

1　菌種制作設(shè)備

大球蓋菇菌種制作要有必需的設(shè)備，其中有接種、滅菌、培養(yǎng)、保藏等設(shè)備。這些設(shè)備必須達(dá)到設(shè)計(jì)的要求，以保證使用效果。

1.1接種設(shè)備

1.1.1接種箱：又稱無菌操作箱，是菌種擴(kuò)繁轉(zhuǎn)接的設(shè)備。要求密閉性好，是對(duì)稱雙斜面箱式結(jié)構(gòu)，斜面可以門式開啟，其上安裝透明玻璃，玻璃門平面同人的視線成135度夾角。接種箱兩側(cè)面各有兩個(gè)直徑15厘米的圓洞，兩洞中心距離40厘米，每個(gè)洞口裝有40厘米長的雙層布套袖，袖口有松緊帶，接種操作時(shí)，雙手經(jīng)兩布套袖伸入箱內(nèi)。箱內(nèi)頂上安裝有40瓦紫外燈和日光燈各一個(gè)。

1.1.2接種室：又稱無菌操作室，面積一般6～8平方米，高2米，墻壁光滑，多為玻璃，地面平整光滑，有利于平整和消毒。接種室內(nèi)有操作臺(tái)，臺(tái)上放置接種工具。接種室進(jìn)口設(shè)一緩沖間，避免接種人員出入時(shí)門直接向外開，防止未經(jīng)消毒的空氣將細(xì)菌帶入室內(nèi)。緩沖間規(guī)格為1米×2米，緩沖間內(nèi)備有已消毒的工作服、拖鞋、帽子和口罩等。接種室和緩沖間均為推拉門，可減緩開關(guān)門引起的空氣流動(dòng)。接種室頂端安裝一空氣過濾機(jī)，可以抽出二氧化碳，并補(bǔ)充所需氧氣，降低室內(nèi)溫度。接種室和緩沖間頂部各安裝一紫外燈，在接種前30分鐘開啟，對(duì)空氣中的懸浮微生物進(jìn)行消毒和滅菌。

1.1.3超凈工作臺(tái)：最現(xiàn)代的接種設(shè)備。

1.2滅菌設(shè)備

滅菌設(shè)備主要包括高壓蒸汽滅菌鍋和常壓滅菌鍋，根據(jù)結(jié)構(gòu)分為立式和臥式兩種。高壓蒸汽滅菌鍋滅菌溫度可達(dá)121℃（1.1千克/平方厘米）或126℃（1.5千克/平方厘米）左右，滅菌時(shí)間根據(jù)滅菌材料而定30分鐘到3小時(shí)不等。常壓滅菌鍋內(nèi)溫度100～105℃，滅菌時(shí)間一般8～10小時(shí)。常壓滅菌注意事項(xiàng)如下：①菌種瓶或袋在鍋內(nèi)擺放要合理，疊放最多5層，盡可能放入周轉(zhuǎn)筐內(nèi)，滅菌效果好。②冷空氣一定要排放干凈后開始計(jì)時(shí)滅菌時(shí)間。③滅菌結(jié)束后，要趁熱及時(shí)搬出滅菌物。

1.3恒溫培養(yǎng)箱和培養(yǎng)室

1.3.1恒溫培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱是大球蓋菇母種和少量原種培養(yǎng)時(shí)必需的設(shè)備，箱內(nèi)的溫度升降是由電子自動(dòng)控溫儀器調(diào)節(jié)的。價(jià)格每臺(tái)3000元左右。

1.3.2培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是用來培養(yǎng)大球蓋菇原種和栽培種的恒溫室，每個(gè)培養(yǎng)室面積20～50平方米。要求空氣流通、避光、入口處有緩沖間。

1.4菌種保藏室和化驗(yàn)室

1.4.1菌種保藏室：菌種已經(jīng)生產(chǎn)好不能及時(shí)投入生產(chǎn)時(shí)，要移出培養(yǎng)室入保藏室，要求保藏室通風(fēng)干燥，有通風(fēng)和降溫設(shè)備，避光，大球蓋菇在15～20℃的溫度下可以保藏25～30天，不會(huì)影響菌種的質(zhì)量。

1.4.2化驗(yàn)室：又稱準(zhǔn)備室或工作室，是進(jìn)行菌絲體顯微觀察、鑒定、孢子收集、組織分離、母種培養(yǎng)基制作等技術(shù)性較強(qiáng)的工作的地方，內(nèi)有工作臺(tái)及恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡等儀器、設(shè)備。

冰箱：存放母種，溫度0～5℃，保藏時(shí)間3個(gè)月，3個(gè)月后轉(zhuǎn)管培養(yǎng)后再繼續(xù)保藏。

顯微鏡：用來觀測和鑒定擔(dān)孢子和菌絲體的質(zhì)量。

天平：用來稱量配制母種培養(yǎng)基中微量元素或配制基礎(chǔ)溶液的各種化學(xué)物質(zhì)的儀器。按常用的天平分度值，應(yīng)有1/100、1/1000和1/10000天平各一臺(tái)。

玻璃器皿：試管、培養(yǎng)皿、菌種瓶。試管主要用來培養(yǎng)母種，常用規(guī)格18毫米×180毫米、20毫米×200毫米；培養(yǎng)皿又稱玻璃平板，用作分離孢子和母種菌絲，常用的直徑規(guī)格10～12厘米；菌種瓶是用作培養(yǎng)原種、栽培種的容器，顏色可以白色和淺綠色，容量750毫升為佳。

其它用品：接種工具（接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種鋤、接種鏟、接種匙、接種刀、解剖刀、剪刀、鋼鉤、鑷子、彈簧接種槍、接種槍）、酒精燈、吸管、量筒、漏斗、鐘罩、鍋、電爐或者電磁爐等。

1.5配料設(shè)備

主要指用于制作大球蓋菇原種和栽培種配料時(shí)所使用的基本設(shè)備，包括鍘草機(jī)、拌料機(jī)等。

鍘草機(jī)：用于粉碎大球蓋菇的草料，鍘草機(jī)切草長度可在2～10厘米范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，大球蓋菇一般要求草料長度3～5厘米。

拌料機(jī)：將大球蓋菇的母種和栽培種的培養(yǎng)料主料和輔料進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，最后達(dá)到均勻的機(jī)器。

1.6分裝設(shè)備

用于把培養(yǎng)基裝入瓶子或袋子中的設(shè)備。主要有：裝瓶機(jī)、裝袋機(jī)和裝瓶裝袋兩用機(jī)。

2　菌種培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)及其制作

2.1培養(yǎng)基

國內(nèi)食用菌一般采取三級(jí)菌種生產(chǎn)體系，即母種-原種-栽培種；也有直接用母種接種栽培種的二級(jí)菌種生產(chǎn)體系。不管幾級(jí)菌種繁育體系，培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)和制作都是必須的。培養(yǎng)基是大球蓋菇菌絲生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，不同的菌種所需要的培養(yǎng)基也不一樣。其培養(yǎng)基可分為以下幾種。

2.1.1第一種：天然培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基是指自然界中的動(dòng)植物體或者其中一部分直接用來配制培養(yǎng)基。如麥粒、玉米粒、小米粒、馬鈴薯、胡蘿卜等均可直接利用。植物的副產(chǎn)品，如麩皮、米糠、豆餅、玉米粉、秸稈、糠殼等或者動(dòng)植物體的加工品，如麥芽汁、酵母膏、牛肉膏等均屬于天然培養(yǎng)基，天然培養(yǎng)基資源豐富，價(jià)格低廉。

2.1.2第二種：合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是由成分已知的有機(jī)物或無機(jī)物按一定比例配制而成的，如用作碳源的葡萄糖、蔗糖、淀粉等有機(jī)物；用作氮源的蛋白胨、酵母膏等有機(jī)物；用做礦物質(zhì)的氯化鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等這些物質(zhì)的成分結(jié)構(gòu)都是已知的。按照科學(xué)的配方配制的培養(yǎng)基主要用作菌絲的鑒定及定向選育。

2.1.3第三種：半合成培養(yǎng)基。是在天然培養(yǎng)基中加入成分已經(jīng)確定的物質(zhì)配制而成，如在馬鈴薯培養(yǎng)基中加入葡萄糖、磷酸二氫鉀等物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基在大球蓋菇生產(chǎn)中應(yīng)用最為普遍，取材容易還能通過添加已知成分的物質(zhì)起到專用作用。既能用于菇類生產(chǎn)，還可用于菌種篩選。

2.2母種培養(yǎng)基配方和制作

配方：①馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18～20克、水1000毫升、pH值自然。②馬鈴薯200克、蔗糖20克、瓊脂20克、磷酸二氫鉀3克、硫酸鎂2克、水1000毫升、pH值自然。③馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、蛋白胨5克、磷酸二氫鉀3克、硫酸鎂2克、水1000毫升、pH值自然。④麥芽糖酵母瓊脂培養(yǎng)基（MAY）麥芽糖20克、蛋白胨1克、酵母1克、瓊脂18克、加水定容到1升。⑤馬鈴薯葡萄糖酵母瓊脂培養(yǎng)基（PDYA）馬鈴薯300克（加水1.5升，煮20分鐘，用濾汁）、豆胨1克、酵母2克、瓊脂18克、葡萄糖10克、加水定容至1升。⑥麥芽粉麥芽糖酵母瓊脂培養(yǎng)基（DMYA）麥芽糖10克、麥芽粉85克、酵母1克、瓊脂18克加水定容至1升。

制作:

①煮制：將馬鈴薯去皮稱取300克—切成小丁或者條狀—放入不銹鋼鍋中或者鋁鍋中—加水1500毫升—煮沸15～20分鐘—馬鈴薯熟而不爛—用4～6層紗布過濾—濾液補(bǔ)水至1升—加熱至沸—將瓊脂加入不斷攪動(dòng)—待瓊脂溶化后再依次加入酵母、豆胨、葡萄糖等，保持煮成的容量為1升。

②分裝和滅菌：煮成的培養(yǎng)基趁熱倒入漏斗并分裝于試管，培養(yǎng)基占試管容積1/4～1/5，塞好棉花塞或者硅膠塞，塞2/3入試管內(nèi)，1/3留在試管外。如果用棉塞要用普通棉花，不要用脫脂棉，因?yàn)槊撝奕菀孜?，污染率高。塞好棉塞后的試管?～5個(gè)捆一捆，用報(bào)紙或者牛皮紙包好有塞的一頭，豎立于滅菌鍋中在1.1千克/平方厘米（121℃）的壓力下，滅菌30～40分鐘

③擺斜面：滅菌后趁熱將試管取出，擺成斜面，斜面長是試管長的1/2。擺完斜面后要檢查滅菌是否徹底，隨機(jī)抽取幾支試管，放入25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2～3天，如果未發(fā)現(xiàn)雜菌，說明滅菌是徹底的。

2.3原種和栽培種的培養(yǎng)基配方和制作

2.3.1谷粒培養(yǎng)基。小麥（大麥）粒培養(yǎng)基：小麥粒87%、米糠5%、稻殼5%、石膏粉2%、生石灰粉1%。優(yōu)點(diǎn)：省工、速度快；用量小、播種面積大，經(jīng)濟(jì)；體積小節(jié)約運(yùn)輸成本；發(fā)菌快。

制作方法：新鮮麥粒篩選干凈—浸泡24～48小時(shí)—放入鍋中煮至沒有硬心兒—撈出冷卻—拌入輔料—裝瓶或者袋—滅菌2.5～3小時(shí)—出鍋冷卻至20℃以下—接種（每只試管母種可接種原種或栽培種4～6瓶或袋）—移入培養(yǎng)室（24～28℃黑暗條件下）培養(yǎng)15～20天即可長滿瓶或袋。

玉米粒培養(yǎng)基：90%新鮮玉米粒、7%的麥麩、2%的石膏、1%生石灰。

制作方法：新鮮玉米粒浸泡10～12小時(shí)，上鍋煮至玉米粒沒有硬心兒，撈出冷卻，拌入輔料，裝瓶或袋入滅菌鍋滅菌。

2.3.2木屑培養(yǎng)。木屑78%，稻殼10%，麩皮10%，石膏1%,生石灰1%，含水量65%；木屑82%，麩皮15%，黃豆粉2%，石膏0.5%，石灰0.5%，含水量65%；木屑77%，稻殼20%，黃豆粉2%，石灰0.5%，石膏0.5%，含水量65%；木屑40%，玉米芯30%，稻殼10%，米糠17%，過磷酸鈣1%，石灰1%，石膏1%，含水量65%。拌料、測水分、調(diào)pH值、裝袋、滅菌。

2.3.3糞草培養(yǎng)基：干稻草63%，玉米粉4%，干牛糞25%，大豆粉3%，過磷酸鈣3%，硫酸鎂2%；干稻草80%，麥麩20%，石膏1%。

制作方法：稻草切成3厘米長的段，浸透水后撈起瀝水至不滴，拌入輔料，含水量65%左右。按常規(guī)裝瓶、滅菌、培養(yǎng)。

干羊糞88%，碳酸鈣12%。

制作方法：先將干羊糞浸濕，堆積12小時(shí)，使水分均勻滲入糞內(nèi)，然后拌入碳酸鈣即可。

3　消毒和滅菌

消毒和滅菌作為一個(gè)獨(dú)立的節(jié)點(diǎn)單獨(dú)提出是因?yàn)樗鶝Q定制種的成敗，它貫穿于菌種制作過程的始終，國內(nèi)一些菌種企業(yè)和廠家往往制種失敗，多數(shù)原因是制種過程中不能嚴(yán)格按照操作規(guī)程操作，消毒和滅菌不徹底，從而不能保質(zhì)、保量按時(shí)生產(chǎn)出菌種。

3.1消毒和滅菌的概念

消毒：是指用物理化學(xué)方法，殺滅培養(yǎng)料、物體表面及環(huán)境中的一部分微生物，只能殺死營養(yǎng)體，不能殺死休眠體和芽孢。

滅菌：是指在一定范圍內(nèi)用物理化學(xué)方法，徹底殺滅培養(yǎng)料內(nèi)外、容器、用具和空氣中的所有微生物營養(yǎng)體、休眠體和芽孢。

3.2消毒和滅菌的方法

（1）紫外線殺菌：用30～40W紫外線管燈照射20～30分鐘。

（2）甲醛和高錳酸鉀混合熏蒸：一般每立方米需40%甲醛10毫升、高錳酸鉀7～8克，進(jìn)行熏蒸。

（3）使用消毒劑：用0.1%升汞水浸過的紗布或海綿進(jìn)行揩擦，或用噴霧器噴霧消毒，噴霧后20～30分鐘，箱內(nèi)的雜菌和霧滴一起落到箱底被殺死。

4　食用菌菌種分離的方法

4.1概念：子實(shí)體組織分離法：是指采用食用菌子實(shí)體或菌核、菌索的任何一部分組織培養(yǎng)成純菌絲體的方法。

4.2操作技術(shù)要點(diǎn)：①選擇種菇；②種菇消毒；③菇肉接種；④培養(yǎng)；⑤檢查菌種分離情況；⑥提純。

純化培養(yǎng)：待平板中菌絲萌發(fā)，長到1.5～2.5厘米時(shí)進(jìn)行菌種純化，將長好的菌絲尖端培養(yǎng)基迅速轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的試管中進(jìn)行培養(yǎng)。特別注意：組織分離后得到的母種，必須經(jīng)過出菇試驗(yàn)才能在生產(chǎn)中使用。

5　食用菌菌種的保藏方法

5.1保存目的：防止退化，確保菌種純一，防止雜菌感染。

5.2保存原理：主要是通過采用低溫、干燥與缺氧的條件，以中止菌種的繁殖，降低其新陳代謝，使之處于休眠狀態(tài)。

5.3菌種保藏的方法：①斜面低溫保存法：將斜面菌種，置于4℃冰箱保存，以后每隔2～3個(gè)月轉(zhuǎn)管移接一次。②液體石蠟保存法：注入一層已滅過菌的液體石蠟，使菌種與空氣隔絕，降低其新陳代謝的活動(dòng)，然后在棉塞外包以塑料薄膜，一般可保存一年以上。③木屑試管菌種保存法：用雜木屑按原種的培養(yǎng)基配制裝入大號(hào)試管，容量為管高的2/3，擦凈管口塞緊棉塞，用牛皮紙包扎管口后高壓滅菌，然后移入母種，在25～28℃下培養(yǎng)，待長滿菌絲后，立即移到低溫干燥環(huán)境保存、或埋于尿素、硝酸銨或地洞中保存，效果更好，并能延長保存時(shí)間。④冷凍干燥保藏法：這種方法采用真空、干燥、低溫等手段，使菌種新陳代謝活動(dòng)處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，在低溫下快速冷凍，又在低溫下真空干燥，而使菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與成分保持原來狀態(tài)而保存菌種。

此外，還有沙土保存法、液氮超低溫保藏法、濾紙片保存法、菌絲球生理鹽水保藏法、麥粒保藏法、干孢子真空保藏法等。

6　食用菌菌種的質(zhì)量鑒定

6.1母種：①母種概念：是具有結(jié)實(shí)性的菌絲體純培養(yǎng)物，也稱一級(jí)菌種或試管種。②母種鑒定：潔白，健壯，無蟲害，有蘑菇香味。

6.2原種：①原種概念：是由母種轉(zhuǎn)接到木屑、谷粒等為主的培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物，也稱二級(jí)菌種。②原種鑒定：潔白，健壯，有凝水，不干燥。

6.3栽培種：①栽培種概念：是由原種轉(zhuǎn)接、擴(kuò)大到相同或相似的培養(yǎng)基上培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物，直接應(yīng)用于生產(chǎn)，也稱三級(jí)菌種。②栽培種鑒定：潔白，健壯，有凝水，不干燥，一般不超過35～40天。

7　液體菌種的生產(chǎn)與應(yīng)用

7.1液體菌種的概念：是指采用液體培養(yǎng)基生產(chǎn)的菌絲體純培養(yǎng)物。菌絲體在培養(yǎng)基中呈絮狀或球狀。

7.2液體菌種的特點(diǎn)：①優(yōu)點(diǎn)：周期短、產(chǎn)量高。菌齡整齊、菌絲繁殖快；產(chǎn)生的活性物質(zhì)多：蛋白質(zhì)、粗多糖、氨基酸；菌體污染少；便于進(jìn)行機(jī)械化接種，在工業(yè)化、機(jī)械化程度高的部門具有明顯優(yōu)勢。②缺點(diǎn)：特殊的設(shè)備，消毒滅菌要求嚴(yán)格；菌絲老化快；不易貯運(yùn)；掌握不好技術(shù)，危險(xiǎn)性大。③液體菌種制種設(shè)備：搖床、攪拌罐、液體菌種培養(yǎng)罐。④液體菌種發(fā)酵工藝：采用逐級(jí)擴(kuò)大的模式，一般為試管斜面菌種→一級(jí)搖瓶培養(yǎng)菌種→二級(jí)培養(yǎng)小型發(fā)酵堆→大型發(fā)酵罐。液體菌種制作過程中消毒、滅菌更加重要。

8　如何防止食用菌菌種退化

8.1菌種退化的危害：菌種退化會(huì)導(dǎo)致菌絲體生長緩慢；對(duì)環(huán)境、雜菌等的抵抗力變?nèi)?，子?shí)體形成期提前或推后；出菇潮次不明顯等現(xiàn)象。

8.2引起菌種退化的原因：菌種不純和基因突變是主要原因；另外溫度過高、不同菌株的混合栽培等都會(huì)引起菌種退化。

8.3防止菌種退化的措施：①保證菌種的純培養(yǎng)，不要用被雜菌污染的菌種；②嚴(yán)格控制菌種傳代次數(shù)，減少機(jī)械損傷，保證菌種活力；③適當(dāng)?shù)蜏乇４婢N；④避免在單一培養(yǎng)基中多次傳代；⑤菌種不宜過長時(shí)間使用；⑥菌種要定期進(jìn)行復(fù)壯；⑦每年進(jìn)行孢子分離，以有性繁殖來發(fā)現(xiàn)優(yōu)良菌株，以組織分離來鞏固優(yōu)良菌株，保持遺傳特性。