林在楷，周琨，陸霽，董冰，韓肖驊，馬保金，孫強(qiáng)

上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院（上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院）普外科，上海2000400

甲狀腺癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，組織學(xué)可將其分為濾泡細(xì)胞癌和濾泡旁細(xì)胞癌。濾泡細(xì)胞癌又分為乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌四類[1]。PTC是甲狀腺癌中最常見的亞型，占內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的70%～80%[2]。研究發(fā)現(xiàn)，PTC的發(fā)生、發(fā)展不僅與基因的重排/突變有關(guān)，也與微小RNA（microRNA，miRNA）的調(diào)控密切相關(guān)[3]。miRNA靶向目標(biāo)基因調(diào)控不同亞型甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲成為近年研究的熱點(diǎn)。迄今為止，只有少數(shù)的miRNA被證明與分化型甲狀腺癌相關(guān)，其中，包括上調(diào)的miRNA‐146b‐5p、miRNA‐21、miRNA‐2861、miRNA‐221/222、miRNA‐451以及下調(diào)的miRNA‐16、miRNA‐613等[4]。但是，關(guān)于miR‐NA與甲狀腺乳頭狀癌浸潤進(jìn)展的相關(guān)性卻鮮有報(bào)道。因此，本研究通過檢測87例PTC患者腫瘤組織中miRNA‐221/222的表達(dá)水平，并結(jié)合PTC患者的臨床病理特征，評估m(xù)iRNA‐221/222在甲狀腺乳頭狀癌診斷和判斷是否腺外浸潤中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2010年1月至2016年12月首診于上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院普外科的PTC患者87例，組織病理類型的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committeeon Cancer，AJCC）甲狀腺腫瘤的病理學(xué)分類。PTC納入標(biāo)準(zhǔn)：①腺外浸潤（invasion‐PTC，Ⅰ‐PTC），腫瘤浸潤、突破包膜或伴有淋巴管、氣道、食管、頸前肌群侵犯；②腺內(nèi)浸潤（localization‐PTC，L‐PTC），腫瘤局限包膜內(nèi)、單發(fā)不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和鄰近器官受累。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（mutinodular goiter，MNG）納入標(biāo)準(zhǔn)：組織病理學(xué)檢查證實(shí)；病灶呈單發(fā)或多發(fā)；伴或不伴包膜浸潤；局部淋巴細(xì)胞增生。PTC患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①放射性物質(zhì)接觸者；②合并甲狀腺功能異常、甲狀腺炎、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及甲狀腺腺瘤疾病者；③既往有甲狀腺惡性腫瘤手術(shù)史；④合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、傳染病及內(nèi)科慢性病者。MNG排除標(biāo)準(zhǔn)同上，外加術(shù)中冰凍證實(shí)合并甲狀腺癌者。臨床病理資料中，47例患者經(jīng)病理檢查確診為腫瘤侵出甲狀腺包膜外，侵犯甲狀腺鄰近組織或器官，為腺外浸潤；40例患者腫瘤局限于包膜內(nèi)，無腺外浸潤。再選取同期27例MNG患者和18例正常甲狀腺（normal thyroid，NT）患者的甲狀腺組織，其中，18例NT患者的甲狀腺組織由病理科提供，系咽喉部腫瘤手術(shù)切除的正常甲狀腺組織。PTC患者中，男35例，女52例；年齡為16～74歲，平均（46.37±10.88）歲；MNG組中，男8例，女19例；年齡為19～52歲，平均（43.24±6.94）歲；NT組中，男5例，女13例；年齡為39～77歲，平均（50.12±11.07）歲。按照隨機(jī)化、對照分組原則，將研究對象分為4組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 標(biāo)本處置

留取新鮮標(biāo)本組織腫瘤外2.5 cm處正常甲狀腺組織1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，在保證病理取材需要后，留取待測含包膜癌組織1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，置標(biāo)本于無RNase的凍存管并密封保存于液氮中，取材全程無菌操作。病理切片由兩位病理學(xué)教授獨(dú)立閱片。

1.3 熒光定量PCR分析檢測

標(biāo)本總RNA抽提參照miRcute miRNA提取分離試劑盒（購自上海生物科技有限公司）步驟進(jìn)行。引物序列miRNA‐221上游引物為5'‐CGAGACTGT‐GAGAATTACTTGCAAGCTG‐3'，下游引物為5'‐CC‐GCTCGAGCATTGGTGAGACAGCCAATG‐3'；miR‐NA‐222上游引物為5'‐CGCAGATCTTTT‐CTTCCA‐CAGA‐3'，下游引物為 5'‐GGGGAT‐CCTCTCAG‐GACACT‐GAAGC‐3'；U6上游引物為5'‐CTC‐GCTTCGGCAGCACA‐3'，下游引物為5'‐AAA‐AATATGGAACGCTTCACGAA‐3'。引物序列經(jīng)Genebank驗(yàn)證。去除基因組DNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），再經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法（quantitative real‐time PCR，qRT‐PCR）特異性擴(kuò)增，獲單一熔解曲線峰，軟件分析得到Ct值（PCR反應(yīng)中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK‐q檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)。以2‐ΔΔCt標(biāo)準(zhǔn)化miR‐NA表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建ROC曲線，分別計(jì)算miRNA‐221和miRNA‐222在診斷甲狀腺乳頭狀癌和判斷是否腺外浸潤中的特異度和靈敏度。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織中miRNA-221/222表達(dá)情況的比較

4組患者甲狀腺組織中miRNA‐221/222表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=200.024、167.939，P＜0.01）。兩兩比較可以看出，MNG組與NT組miR‐NA‐221/222的表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余任意兩組間的miRNA‐221/222表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miRNA‐221和miRNA‐222在PTC中表達(dá)上調(diào)，高于MNG組和NT組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同甲狀腺組織中miRNA‐221/222表達(dá)情況的比較（ 2‐ΔΔCt）

2.2 miRNA-221/222表達(dá)與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和（或）腺外浸潤患者miRNA‐221/222的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和（或）無腺外浸潤患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期及是否為多灶性腫瘤患者miRNA‐221/222的表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 miRNA‐221/222表達(dá)與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系（ 2‐ΔΔCt）

2.3 miRNA-221/222表達(dá)的ROC分析

以miRNA‐221/222的表達(dá)水平診斷甲狀腺腫瘤良惡性（圖1A），miRNA‐221的曲線下面積（area un‐der curve，AUC）為 0.803（95%CⅠ：0.735～0.871），miRNA‐222的AUC為0.802（95%CⅠ：0.737～0.868）。miRNA‐221的截?cái)嘀禐?.487時(shí)，診斷靈敏度為80.7%，特異度為74.8%；miRNA‐222的截?cái)嘀禐?.502時(shí)，診斷靈敏度為78.3%，特異度為73.2%。以miRNA‐221/222的表達(dá)水平診斷甲狀腺腫瘤侵襲性（圖1B），miRNA‐221的 AUC為 0.660（95%CⅠ：0.524～0.797），miRNA‐222的AUC為0.653（95%CⅠ：0.512～0.794）。miRNA‐221的截?cái)嘀禐?0.846時(shí)，診斷靈敏度為63.6%，特異度為52.5%；miRNA‐222的截?cái)嘀禐?.851時(shí)，診斷靈敏度為63.6%，特異度為73.8%。

圖1 miRNA‐221/222表達(dá)的ROC分析

3 討論

本研究通過總結(jié)大量的甲狀腺癌手術(shù)發(fā)現(xiàn)，高度侵襲性PTC常侵犯氣管、食管，甚至包繞喉返神經(jīng)。雖然術(shù)前超聲、CT及細(xì)針穿刺可以為診斷提供幫助，但在甲狀腺腫瘤是否存在腺外浸潤、是否有轉(zhuǎn)移及預(yù)后預(yù)判上仍存在一定困難。

近年關(guān)于miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌中，多種miRNA表達(dá)上調(diào)，如miRNA‐146b、miRNA‐222、miRNA‐221、miRNA‐10b、miRNA‐187等；一些miR‐NA 表達(dá)下調(diào)，如 miRNA‐199a、miRNA‐204、miR‐NA‐218、miRNA‐300等[5‐6]。利用這些分子病理學(xué)的改變，使得甲狀腺癌的早期診斷和侵襲性有望更快實(shí)現(xiàn)。本研究得到類似結(jié)果，miRNA‐221和miRNA‐222在PTC中表達(dá)上調(diào)，高于MNG組和NT組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

有學(xué)者構(gòu)建BRAF基因突變小鼠模型發(fā)現(xiàn)，PTC進(jìn)展到低分化癌[7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，miRNA‐126可靶向抑制BRAF突變的未分化甲狀腺癌細(xì)胞增殖[8‐10]，提示PTC發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，其進(jìn)展時(shí)腫瘤直徑增大，腺外侵襲增強(qiáng)，甲狀腺乳頭狀癌隨著腫瘤細(xì)胞的增殖，其侵襲性增強(qiáng)，可逐步進(jìn)展為低分化甲狀腺癌[11‐12]。因此，高度侵襲性PTC是否因BRAF基因融合了PI3KR2基因突變而致分化程度降低，呈現(xiàn)為惡性程度激增，有待進(jìn)一步深入研究。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，存在腺外浸潤的PTC患者組織中miRNA‐221/222的表達(dá)水平高于無腺外浸潤的PTC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示侵襲性PTC與局限性PTC在分子病理上可能有更多差異，而miRNA‐221/222有望成為判斷PTC是否腺外浸潤的生物標(biāo)志物。

研究顯示，miRNA‐221和miRNA‐222可能通過下調(diào)MMP抑制劑增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[13‐14]。有研究表明，miRNA‐221可抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白p27kip1的表達(dá)，p27Kip1在G1/S細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控中具有關(guān)鍵作用，強(qiáng)制表達(dá)miRNA‐221和miRNA‐222可以刺激甲狀腺癌細(xì)胞打破G1/S周期停滯，從而持續(xù)增殖[15‐16]。本研究結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腺外浸潤的PTC患者miRNA‐221/222的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無腺外浸潤患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示PTC患者腺外浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與miRNA‐221/222表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

本研究以miRNA‐221/222的表達(dá)水平診斷甲狀腺腫瘤良惡性的效果較好，其AUC分別為0.803和0.802。Zhu等[17]研究指出，miRNA‐221通過抑制PTEN和TⅠMP3的表達(dá)，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。ROC曲線結(jié)果顯示，miRNA‐221的截?cái)嘀禐?.846時(shí)，判斷PTC侵襲性的診斷靈敏度為63.6%，特異度為52.5%；miRNA‐222的截?cái)嘀禐?.851時(shí)，診斷靈敏度為63.6%，特異度為73.8%，提示miR‐NA‐221/222在判斷甲狀腺癌侵襲性方面有一定的價(jià)值，但靈敏度和特異度還不夠。因此，研究認(rèn)為，后續(xù)研究可嘗試引入更多相關(guān)的miRNA進(jìn)行聯(lián)合診斷，以達(dá)到臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，miRNA‐221/222在PTC患者組織中表達(dá)上調(diào)，與PTC侵襲程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，支持其作為侵襲性PTC潛在的生物標(biāo)志物，但利用特異度miRNA判斷甲狀腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)性，仍有待進(jìn)一步深入研究。

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