李美琪　曾偉靈　陶婉卿　孫玉紅

(1.西南醫(yī)科大學(xué)2014級(jí)臨床藥學(xué)專業(yè)； 2.西南醫(yī)科大學(xué)2014級(jí)藥學(xué)專業(yè)； 3.西南醫(yī)科大學(xué)2016級(jí)影像學(xué)專業(yè)； 4.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川 瀘州　646000)

腦出血具有極高的致死率及致殘率，在老年患者中尤為常見(jiàn)。腦水腫是腦出血后血腫周圍組織繼發(fā)性損傷，與血腫占位、繼發(fā)性缺血、自由基連鎖反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、凋亡等病理生理變化可能有關(guān)[1]。水通道蛋白尤其是水通道蛋白4(Aquaporin4，AQP4)參與了腦水腫的形成和消退過(guò)程，起著調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡期間水穿過(guò)細(xì)胞膜的作用[2-3]。Rosenberg等研究發(fā)現(xiàn)AQP4在顱內(nèi)出血后腦水腫的表達(dá)為一動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，腦出血后6 h血腫周圍組織AQP4蛋白明顯增加，出血后3 d達(dá)到高峰，以后逐漸下降[4]。腦出血組織損傷導(dǎo)致腦水腫與壞死和凋亡有關(guān)，Caspase-3以及Bcl-2作為主要的凋亡蛋白參與了腦出血的繼發(fā)性損傷[5]。在腦出血患者血腫周圍組織中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Caspase-3蛋白表達(dá)增加。但目前對(duì)AQP-4在腦水腫繼發(fā)性損傷中的作用與凋亡蛋白表達(dá)間有無(wú)關(guān)系目前尚不清楚，據(jù)此本研究提出能否通過(guò)干擾AQP4表達(dá)，影響腦組織周圍參與凋亡的蛋白表達(dá)，從而產(chǎn)生保護(hù)腦血腫周圍組織，減輕腦水腫與繼發(fā)性損害作用，為腦出血患者治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1　材料

靶向AQP4的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，引物(上海生工生物工程有限公司)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；雄性SD大鼠(購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-17)；β-actin，Caspase-3，Bcl-2兔抗大鼠單克隆抗體(abcam公司)；凝血酶Ⅶ(sigma公司)。

1.2　方法

1.2.1 大鼠分組及腦出血模型制備

將40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、AQP4 siRNA組、空載質(zhì)粒組，每組10只。通過(guò)腦立體定位后腦室內(nèi)注射凝血酶Ⅶ0.5 U注射誘發(fā)尾殼核腦出血建立腦出血模型，注射部位為前囟后1 mm，矢狀線右側(cè)3 mm；進(jìn)針深度約6 mm；凝血酶Ⅶ 0.5 U，勻速推注約5 min，留針10 min，出針5 min，總計(jì)20 min。模型組只建立模型，AQP4 siRNA組與空載質(zhì)粒組分別在造模后同時(shí)注射siAQP410 μl(0.1μg)或siNC10 μl(0.1 μg)，質(zhì)粒處理方法為1 μg與lipofectamine2000 100 μl混勻靜置20 min。

1.2.2 模型神經(jīng)功能評(píng)定

術(shù)后1 d和3 d采用Longa分級(jí)法[6]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定。0分：無(wú)神經(jīng)缺陷癥狀；1分：不能伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前肢；2分：手術(shù)對(duì)側(cè)前肢屈曲；3分：輕度向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分：嚴(yán)重向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；5分：向手術(shù)對(duì)側(cè)跌倒。2分以上表示實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒Α?/p>

1.2.3 腦組織含水量測(cè)定

術(shù)后第3 d處死大鼠，采用干濕重法測(cè)定腦出血灶周圍腦組織含水量：去除額極后，取病變側(cè)2 mm×2 mm厚腦組織測(cè)定含水量。腦組織濕重結(jié)果表示為A；將腦組織用錫紙包裹，放入烤箱內(nèi)100℃烘干24 h后取出稱重為干重，表示為B；腦組織含水量=(A -B)/A×100%。

1.2.4RT-PCR法檢測(cè)血腫周圍腦組織AQP4 mRNA表達(dá)

AQP4引物序列為：上游5’-CCAGCTGTGATTCCAAAACGGAACAT-3’下游 TCTAGTCATACTGAAGACAA TACCTC-3’，產(chǎn)物大小305 bp。內(nèi)參照β-actin引物序列為：上游5’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’；下游：5’-GAACCGCTCATT GCCGATAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為375 bp。取血腫周圍腦組織50 mg冰上勻漿，Trizol裂解研磨，200 μL氯仿劇烈震搖30 s，4℃、12000 g低溫離心20 min，加等體積的異丙醇混勻，-20℃過(guò)夜，4℃、12000 g低溫離心20 min，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析。AQP4 PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 min，72℃延伸1 min，經(jīng)32個(gè)循環(huán)后于72℃延伸10 min。β-actin PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃2 min，變性95℃30 s，退火52℃30 s，延伸72℃40 s；35個(gè)循環(huán)后，最后延伸72℃5 min。

1.2.5Western blotting檢測(cè)血腫周圍腦組織Caspase-3以及Bcl-2蛋白表達(dá)

取血腫周圍腦組織100 mg，加入含有蛋白酶抑制的的細(xì)胞裂解液200 μl冰上裂解10min，4℃、12000 g離心10 min。BCA法測(cè)蛋白濃度后，采用8%分離膠和4%的濃縮膠分離蛋白，電泳時(shí)間120 min，之后加入Caspase-3或Bcl-2兔抗大鼠單克隆抗體(1∶500)，β-actin兔抗大鼠單克隆抗體(1∶2000)，4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入1∶1000羊抗兔多克隆抗體，37℃孵育2 h，洗膜，顯影，Image pro-plus 6.0軟件分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用SNK法，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　各組大鼠模型神經(jīng)功能評(píng)定

對(duì)照組為正常大鼠，因此神經(jīng)功能評(píng)分為0。造模后1 d，與對(duì)照組比較，模型組和空載質(zhì)粒組神經(jīng)功能評(píng)分較高(P<0.01)，與模型組比較，AQP4 siRNA干預(yù)組評(píng)分較低，但比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后3 d，與對(duì)照組比較，模型組和空載質(zhì)粒組神經(jīng)功能評(píng)分較高(P<0.01)，與模型組比較，AQP4 siRNA干預(yù)組評(píng)分明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1　造模后1 d、3 d大鼠神經(jīng)功能評(píng)分注：與模型組比較，**P<0.01；與對(duì)照組比較，##P<0.01。

2.2　AQP4 siRNA干預(yù)后腦組織含水量測(cè)定

造模后3 d，大鼠腦組織出血明顯，腦組織出血周圍組織形成明顯腦組織水腫。模型組與空載質(zhì)粒組含水量分別為79.9%和79.8%左右。與對(duì)照組比較，模型組與空載質(zhì)粒組含水量較高(P<0.01)；與模型組比較，對(duì)照組與AQP4 siRNA干預(yù)組含水量明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.3　AQP4 siRNA干預(yù)后血腫周圍腦組織AQP4 mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組與空白質(zhì)粒組大鼠腦組織出血周圍組織AQP4 RNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，AQP4 siRNA干預(yù)組與對(duì)照組AQP4 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2　AQP4 siRNA干預(yù)后腦組織含水量注：與模型組比較，**P<0.01；與對(duì)照組比較，##P<0.01。

圖3　AQP4 siRNA干預(yù)后大鼠血腫周圍腦組織AQP4 mRNA表達(dá)注：與模型組比較，**P<0.01；與對(duì)照組比較，##P<0.01。

2.4　AQP4 siRNA干預(yù)后血腫周圍腦組織Caspase-3以及Bcl-2蛋白水平

與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織出血周圍組織Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，AQP4 siRNA干預(yù)組Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4　AQP4 siRNA干預(yù)后大鼠血腫周圍腦組織Caspase-3以及Bcl-2蛋白水平注：與模型組比較，**P<0.01；與對(duì)照組比較，##P<0.01。

3　討論

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是目前死亡率較高的疾病之一，然而機(jī)制未明[7]。通過(guò)腦內(nèi)注射凝血酶Ⅶ誘發(fā)尾殼核腦的出血模型是經(jīng)典的腦出血模型，具有出血時(shí)間快，出血點(diǎn)周圍水腫明顯，大鼠死亡率低等優(yōu)點(diǎn)，因此較適合于研究腦出血后腦水腫的病理生理、生化改變及評(píng)價(jià)腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)狀況和藥物的治療效果的研究[8]。本研究通過(guò)腦立體定位儀定位，腦內(nèi)注射凝血酶Ⅶ 0.5 U，結(jié)果顯示在注射后3天，腦出血較為明顯，大鼠神經(jīng)功能出現(xiàn)明顯下降，造模較為成功。

水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一類形成所有生命形式的細(xì)胞屏障中膜轉(zhuǎn)移通道的蛋白質(zhì)，是水的分子通道，它們?nèi)菰S水在細(xì)胞和它的周圍環(huán)境間運(yùn)動(dòng)。迄今在哺乳動(dòng)物組織中已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白(AQP0～AQP12)，其中水通道蛋白4在腦組織中含量豐富，主要分布于面向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟腦膜和腦室室管膜側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜或足突上，參與了腦水腫的形成和消退過(guò)程，在維持大腦水平衡，細(xì)胞凋亡期間水穿過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)等方面起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[9]。腦出血損傷水腫可致AQP4表達(dá)增加，同時(shí)可能引起神經(jīng)細(xì)胞及血腫周圍細(xì)胞損傷[10]。本研究通過(guò)購(gòu)買AQP4siRNA質(zhì)粒，干擾AQP4基因表達(dá)，結(jié)果顯示大鼠腦出血水腫較模型組和空質(zhì)粒組大鼠均明顯減輕，提示AQP4參與了腦出血水腫過(guò)程。

細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2與促凋亡因子，如Caspase家族都參與了腦出血患者細(xì)胞損傷。在腦出血患者血腫周圍組織中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，機(jī)制可能為位于線粒體外膜的Bcl-2蛋白調(diào)節(jié)線粒體功能，抑制線粒體釋放促凋亡蛋白有關(guān)。腦出血患者Caspase表達(dá)增加，可激活特定信號(hào)系統(tǒng)，產(chǎn)生核皺縮、 DNA片段形成等凋亡現(xiàn)象，最終控制著細(xì)胞損傷的發(fā)生和發(fā)展[11]。

本研究結(jié)果顯示，siAQP4干預(yù)后，Caspase-3表達(dá)明顯降低而B(niǎo)cl-2表達(dá)明顯升高，模型組與空白質(zhì)粒組Caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，提示在抑制了AQP4表達(dá)后，促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)降低而抗凋亡因子蛋白Bcl-2表達(dá)增加，表明AQP4在腦出血導(dǎo)致的腦水腫和腦組織損傷中發(fā)揮的重要作用與凋亡蛋白的表達(dá)存在相關(guān)性。

綜上所述，在腦出血大鼠模型中抑制AQP4表達(dá)能抑制腦水腫，減輕腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷，可能與減少Caspase-3和增加Bcl-2表達(dá)有關(guān)，提示AQP4在腦出血水腫中的重要作用。

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