，　，，　，，　

[1.陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第一附屬醫(yī)院老年科，重慶 400038；2.陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科，重慶 400038]

肺癌是最常見的惡性腫瘤，也是我國高發(fā)的惡性腫瘤。在2017年出版的世界衛(wèi)生組織公布的《全球癌癥報告》中，全球范圍內(nèi)的肺癌發(fā)病率和病死率迅速增長，位居惡性腫瘤的首位[1]。在所有類型肺癌中非小細胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占80%，其5年生存率僅為13%[2-3]。盡管在過去幾十年間隨著我國醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，新輔助化療和個體化綜合治療的推廣應用，肺癌的早期預防和治療已經(jīng)取得明顯療效，但是非小細胞肺癌的預后仍然很差，仍然為最常見的和病死率最高的癌癥[4-5]。NSCLC主要致死原因之一是殘余肺癌腫瘤細胞的異常增殖和遠處轉(zhuǎn)移，因此深入研究肺癌的異常增殖和遠處侵襲轉(zhuǎn)移的分子作用機制對于改善肺癌的臨床治療和患者預后具有重要的臨床意義。在實體瘤迅速生長的過程中，短時間內(nèi)腫瘤細胞的快速增殖和腫瘤細胞周圍血管生長滯后二者間形成一對矛盾體，由于無法為腫瘤細胞提供足夠的營養(yǎng)和氧氣，導致腫瘤局部組織中形成缺血缺氧微環(huán)境[6-8]。低氧微環(huán)境能夠進一步對腫瘤細胞的增殖、血管生成以及侵襲轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生影響[9-11]。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤細胞的增殖、分化以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。但有關(guān)Wnt/β-catenin信號通路對缺氧條件下的非小細胞肺癌A549細胞增殖活性和侵襲轉(zhuǎn)移的作用,目前尚未見報道。本研究旨在通過研究體外低氧微環(huán)境對非小細胞肺癌A549細胞增殖和侵襲的影響，并探討Wnt/β-catenin信號通路在這一過程中的可能作用機制。

1　材料與方法

1.1　材料

人非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；TRIzol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；HIF-1α及β-catenin引物均委托北京天一輝遠生物科技公司設(shè)計合成；多克隆兔抗人HIF-1α及β-catenin購自美國Santa Cruz公司，單克隆兔抗人β-actin購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根酶標記羊抗兔IgG購自武漢博士德生物科技公司；中分子量Protein marker 購自Thermo Fisher公司；ECL 超敏化學發(fā)光試劑盒購自武漢碧云天生物科技公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；含酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HYCLONE公司；細胞裂解液(RIPA)及BCA蛋白定量試劑盒均購自武漢碧云天生物科技公司；6孔、96孔培養(yǎng)板、25 cm2塑料培養(yǎng)瓶以及24孔Transwell小室(孔徑8 μm)均購自美國Corning Costar公司；侵襲實驗所用基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國BD公司；Co170R-230-0200三氣細胞培養(yǎng)箱(用于模擬缺氧細胞培養(yǎng)環(huán)境)購自德國Eppendorf公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽均購自北京六一電子儀器公司。

1.2　方法

1.2.1細胞培養(yǎng)非小細胞肺癌細胞A549在細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件)下用含10%小牛血清、100 u/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素、含酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代。細胞培養(yǎng)至融合70%～80%后，用無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，再置入低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后對A549細胞進行相應指標的檢測。常氧培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、20%O2；低氧培養(yǎng)條件為1%O2。

1.2.2CCK-8測定不同培養(yǎng)條件下的生長曲線取對數(shù)生長期的第3代肺癌A549細胞系常規(guī)消化后，按1×104/mL的細胞密度接種于96孔板中，每孔200 μL，并設(shè)空白孔(只加入200 μL培養(yǎng)基)，共接種2塊板。分別置于低氧培養(yǎng)箱及常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于3、6、12、24 h共4個時間點取5個細胞孔及1個空白孔行CCK-8檢測，每孔加入20 μL CCK-8試劑，孵育2 h后取出在酶標儀450 nm處測定其吸光值(A)，以時間(h)為橫坐標，A為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3RNA提取和Real-time PCR檢測RT-PCR檢測Wnt/β-catenin的表達，將已經(jīng)過處理的各組細胞用冰上預冷PBS洗滌3次，每孔中加入1 mL Trizol RNA提取液，按照產(chǎn)品說明書操作步驟提取細胞總RNA，紫外分光光度法測定A260/A280比值，測算RNA 濃度，重復3次。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR 循環(huán)擴增。PCR所用引物由上海擎科生物科技公司上海分公司合成，引物序列如下：β-actin上游引物5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’，下游引物5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’；HIF-1α上游引物5’-CGUACUGCACUCCAAAUATT’，下游引物5’-UAUUUGGAGUGCAGUAGCGTT-3’；β-catenin上游引物5’-GCTGCTGTTTTGTTCCGAATGT-3’，下游引物5’-GCCATTGGCTCTGTTCTGAAGA-3’。實時熒光定量PCR：反應體系20 μL，mixture 10 μL，探針引物1 μL，cDNA 2 μL。反應條件均為：95 ℃，3 min 預變性；94 ℃，30 s；48 ℃，30 s，72 ℃，1 min，擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像掃描系統(tǒng)成像并進行灰度掃描，重復3 次。

1.2.4Western blot檢測非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549經(jīng)過常氧及缺氧培養(yǎng)之后，將6孔板中的貼壁細胞用冰上預冷的PBS洗滌3次后加入RIPA細胞蛋白裂解液，并使用細胞刮將細胞裂解液收集轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，冰上靜置裂解30 min，隨后于12 000 rpm離心10 min，棄去細胞沉淀，取上清液-20 ℃儲存。采用BCA 法測定蛋白濃度，加入5×loading buffer 將蛋白混勻后，置于95 ℃金屬水浴鍋中進行蛋白變性。配制12%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白樣品上樣，80 V電泳積聚蛋白，100 V電壓使蛋白分離并使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束采用5%脫脂牛奶封閉1 h。用多克隆兔抗人的HIF-1α(1∶800)β-catenin、(1∶1 000)、單克隆小鼠抗人的β-actin(1∶3 000)分別與膜接觸4 ℃孵育過夜后，用TBST在脫色搖床下洗膜3次，每次5 min，在加辣根酶標記羊抗小鼠或抗兔IgG，室溫下孵育1 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL化學發(fā)光顯示劑在室溫下反應1 min后，進行曝光。

1.2.5Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力實驗前所有試劑及器材均于冰上預冷，將Transwell小室置于6孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹0.2 μg/μL的Matrigel 膠(matrigel與無血清培養(yǎng)基之比為1∶250 μL，37 ℃孵育20 min，使膠凝固,并放入培養(yǎng)箱中4 h凝固備用。次日將處于對數(shù)生長期肺癌A549細胞系在無血清DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后,使用0.25%EDTA胰蛋白酶消化，接著無血清DMEM培養(yǎng)基懸浮成單細胞懸液，將細胞密度調(diào)整至至4×105/mL，臺盼藍染色檢測細胞活力95%以上。每個侵襲小室上室中加入無血清細胞懸液200 μL，在侵襲小室的下室加入含10%小牛血清的細胞培養(yǎng)液DMEM，每孔600 μL，分別置于常氧和低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出小室，用PBS分3次洗滌去除培養(yǎng)基。使用濕棉簽輕柔擦去小室上層未穿過細胞后置于4%多聚甲醛中固定20 min。隨后將小室置于室溫下晾干并進一步使用結(jié)晶紫染色20 min。染色完后在倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細胞數(shù)，計數(shù)中間及四周5個高倍(400倍)鏡下視野細胞數(shù)，計算平均數(shù)。

1.3　統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.1　低氧對肺癌A549細胞增殖能力的影響

非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549經(jīng)過常氧和低氧培養(yǎng)24 h后采用CCK8法進行細胞增殖能力檢測。結(jié)果顯示：與常氧組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549的增殖能力顯著增強，而且隨著低氧培養(yǎng)時間的延長增殖效應越顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1　低氧促進非小細胞肺癌細胞系的增殖

2.2　低氧對肺癌A549細胞侵襲能力的影響

非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549經(jīng)過常氧和低氧培養(yǎng)24 h后采用Transwell侵襲實驗對細胞侵襲能力進行檢測。結(jié)果顯示，與常氧對照組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后的非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549的侵襲能力顯著增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3　低氧對Wnt/β-catenin信號通路的影響

在常氧和低氧環(huán)境下培養(yǎng)非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549 24 h后，分別采用RT-PCR和Western blot檢測β-catenin的mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組A549的β-catenin mRNA和蛋白表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明低氧能夠激活Wnt/β-catenin信號通路(圖3)。

2.4　靶向沉默β-catenin對Wnt/β-catenin信號通路的影響

轉(zhuǎn)染β-catenin特異性siRNA及β-catenin-NC于非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549 48 h后，分別采用RT-PCR和Western blot檢測β-catenin mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示與β-catenin NC組和空白對照組相比，β-catenin siRNA組的β-catenin明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

2.5　β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對低氧介導的非小細胞肺癌細胞增殖能力

對分別進行常氧培養(yǎng)和低氧培養(yǎng)的非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549進行細胞增殖能力檢測。CCK8結(jié)果顯示，與常氧組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的A549細胞系隨著培養(yǎng)時間的延長其增殖能力顯著增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染了β-catenin siRNA的細胞其增殖能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

2.6　β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對低氧介導的非小細胞肺癌細胞侵襲能力的影響

在Transwell小室遷移實驗中，我們發(fā)現(xiàn)低氧處理24 h后，與常氧對照組相比低氧轉(zhuǎn)染NC處理組中A549細胞的侵襲能力顯著增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA組的細胞侵襲能力被顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

a:RT-PCR檢測HIF-1α水平;b:RT-PCR檢測β-catenin mRNA水平;c:Westtern blot檢測HIF-1α和β-catenin蛋白表達水平;d、e:Westtern blot結(jié)果定量分析*:P<0.01；#:P<0.001

圖3低氧激活非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549的Wnt/β-catenin信號通路

a：β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染熒光圖(× 200)；b：RT-PCR檢測β-catenin mRNA表達；c：Western blot檢測β-catenin 蛋白表達；d：Western blot結(jié)果定量分析*：P<0.001；#：P<0.01

圖4β-cateninsiRNA在非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549中有效沉默β-catenin

圖5　β-catenin siRNA抑制低氧誘導的細胞增殖

3　討論

肺癌是目前危害人類健康最嚴重的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位居全球第一，探討其發(fā)生機制以及尋找有效的治療手段一直是受到廣泛關(guān)注的研究熱點之一[14-15]。在正常機體中，氧濃度的變化對組織細胞的代謝、增殖、分化具有重要的調(diào)節(jié)作用[16]。為了適應低氧代謝應激條件，腫瘤細胞能夠通過激活一系列信號調(diào)控機制，如促進周邊新生血管生成、增強細胞新陳代謝、遷移等，促進了細胞的異常增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等[17-18]。低氧環(huán)境下這一系列生物學事件的發(fā)生不僅改變了腫瘤細胞的生物學特性，引起腫瘤細胞的基因組不穩(wěn)定性，導致腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至遠處侵襲轉(zhuǎn)移。作為最常見的實體瘤，肺癌病灶生長過程中隨著腫瘤細胞的快速異常增殖，使得局部血供無法進一步支持腫瘤細胞的快速生長，不可避免地經(jīng)歷局部缺血缺氧微環(huán)境。而在這一過程中適應環(huán)境生存下來的腫瘤細胞的增殖又會繼續(xù)加劇微環(huán)境的缺氧狀況。在這樣的缺血缺氧條件下，腫瘤細胞往往會通過自分泌或旁分泌作用改變自身周圍生存和發(fā)展的環(huán)境，促進腫瘤繼續(xù)生長和發(fā)展。腫瘤細胞本身的一些特征也會隨之改變，例如具有更強的局部浸潤和遠處侵襲能力，使其更有利于脫離目前的惡劣環(huán)境，轉(zhuǎn)移到新的部位重新定植。

Wnt/β-catenin 信號通路廣泛參與生物體內(nèi)細胞信息調(diào)控，其在細胞增殖、組織修復、胚胎發(fā)育及腫瘤(包括肺癌)的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[19]。β-catenin是細胞內(nèi)的一種多功能蛋白，其作為Wnt信號通路中的核心調(diào)控蛋白主要參與細胞之間粘附的調(diào)控。正常情況下，正常成熟的組織細胞中，胞漿內(nèi)β-catenin與細胞膜上的E-cadherin相互結(jié)合起到促進細胞間粘附的作用。此時，胞漿內(nèi)游離狀態(tài)的β-catenin濃度維持在較低水平，無法進入胞核激活其下游靶基因。當細胞受到各種因素的刺激，使得Wnt信號通路激活時，Wnt配體與細胞膜表面的Frizzled/LRP受體結(jié)合從而磷酸化激活下游分子Dsh，使β-catenin從APC/Ax-in/GSK-3β組成的復合物中解離出來，使其在細胞內(nèi)不斷蓄積，并隨后進入細胞核與TCF/LEF復合體結(jié)合，最終激活其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮對細胞增殖、調(diào)亡、運動、分化等一系列生物學事件的調(diào)控[20-21]。研究表明，β-catenin與多種不同的腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要包括肝癌、胃癌以及肺癌等[22-24]，這些研究均顯示β-catenin在這些腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達。在肝癌細胞中，Wnt/β-catenin通過增強低氧誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進細胞侵襲轉(zhuǎn)移,同時β-catenin表達水平與肝癌術(shù)后存活時間呈負相關(guān)[25-26]。在結(jié)腸癌細胞中，低氧通過激活Nur77-β-catenin環(huán)路促進細胞的生長和侵襲[27]。然而，目前尚未有文獻報道Wnt/β-catenin信號通路在低氧微環(huán)境下調(diào)控非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲能力中的調(diào)控機制。

在本實驗中，我們首先驗證了體外低氧微環(huán)境對非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549的增殖與侵襲能力的影響。結(jié)果表明，與常氧對照組相比，A549細胞經(jīng)過低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，其增殖速率顯著高于常氧對照組，同時細胞侵襲能力的顯著增強。接下來我們進一步研究低氧環(huán)境下這一現(xiàn)象的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，與常氧對照組相比，低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后A549中β-catenin信號通路顯著激活，提示其可能參與低氧環(huán)境下肺癌的異常增殖和侵襲過程。為了明確Wnt/β-catenin信號通路在其中的作用機制。我們采用特異性β-catenin siRNA來阻斷其表達，并進一步檢測其對細胞增殖和侵襲的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在靶向沉默Wnt/β-catenin信號通路之后，低氧介導的細胞增殖和侵襲現(xiàn)象被阻斷，表明Wnt/β-catenin信號通路在這一過程中起著關(guān)鍵作用?；谝陨涎芯?，我們推測低氧通過激活Wnt/β-catenin信號通路來調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活，從而促進非小細胞肺癌細胞的異常增殖和遠處侵襲轉(zhuǎn)移，最終促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。

a：Tanswell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色 ×200)；b：統(tǒng)計分析　*：P<0.001

綜上所述，本文初步證實在肺癌A549細胞系中低氧微環(huán)境能夠通過激活Wnt/β-catenin信號通路來促進腫瘤細胞的異常增殖和遠處侵襲轉(zhuǎn)移，這將有助于進一步認識肺癌的發(fā)病機制。因此，深入研究Wnt/β-catenin信號通路在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其調(diào)節(jié)機制，通過靶向阻斷Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子，從而抑制腫瘤細胞的異常增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，這將為肺癌的特異性治療提供新的思路和依據(jù)，具有廣泛的臨床意義和良好的應用前景。

[參考文獻]

[1] Hong QY,Wu GM,Qian GS,et al.Prevention and management of lung cancer in China[J].Cancer,2015,121 (Suppl 17):3080-3088.doi:10.1002/cncr.29584.

[2] Pastorkova Z,Skarda J,Andel J.The role of microRNA in metastatic processes of non-small cell lung carcinoma[J].Biochim Biophys Acta,2016,160(3):343-357.doi:10.5507/bp.2016.021.

[3] Kumarakulasinghe NB,van Zanwijk N,Soo RA.Molecular targeted therapy in the treatment of advanced stage non-small cell lung cancer(NSCLC)[J].Respirology(Carlton,Vic),2015,20(3):370-378.doi:10.1111/resp.12490.

[4] Rafei H,El-Bahesh E,Finianos A,et al.Immune-based therapies for non-small cell lung cancer[J].Anticancer Res,2017,37(2):377-387.doi:10.21873/anticanres.11330.

[5] Durm G,Hanna N.Second-Line chemotherapy and beyond for non-small cell lung cancer[J].Hematol Oncol Clin North Am,2017,31(1):71-81.doi:10.1016/j.hoc.2016.08.002.

[6] Parks K,Cormerais Y,Marchiq I,et al.Hypoxia optimises tumour growth by controlling nutrient import and acidic metabolite export[J].Mol Aspects Med,2016:3-14.doi:10.1016/j.mam.2015.12.001.

[7] Harris BH,Barberis A,West CM,et al.Gene expression signatures as biomarkers of tumour hypoxia[J].Clin Oncol(R Coll Radiol),2015,27(10):547-560.doi:10.1016/j.clon.2015.07.004.

[8] Gilkes DM,Semenza GL,Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix:drivers of tumour metastasis[J].Nat Rev Cancer,2014,14(6):430-439.doi:10.1038/nrc3726.

[9] Hubbi ME,Semenza GL.Regulation of cell proliferation by hypoxia-inducible factors[J].Am J Physiol Cell Physiol,2015,309(12):775-782.doi:10.1152/ajpcell.00279.2015.

[10] Madaneckip P,Kapoor N,Bebok Z,et al.Regulation of angiogenesis by hypoxia:the role of microRNA[J].Cell Mol Biol Lett,2013,18(1):47-57.doi:10.2478/s11658-012-0037-0.

[11] Yuen A,Díaz B.The impact of hypoxia in pancreatic cancer invasion and metastasis[J].Hypoxia(Auckl),2014,2:91-106.doi:10.2147/HP.S52636.

[12] Vilchez V,Turcios L,Marti F,et al.Targeting Wnt/beta-catenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment[J].World J Gastroenterol,2016,22(2):823-832.doi:10.3748/wjg.v22.i2.823.

[13] Yang Y,Yang JJ,Tao H,et al.New perspectives on beta-catenin control of cell fate and proliferation in colon cancer[J].Food Chem Toxicol,2014,74:14-19.doi:10.1016/j.fct.2014.08.013.

[14] Yand J,Chen J,He J,et al.Wnt signaling as potential therapeutic target in lung cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2016,20(8):999-1015.2016,20(8):999-1015.doi:10.1517/14728222.2016.1154945.

[15] Sihoe AD,Van Schil P.Non-small cell lung cancer:when to offer sublobar resection[J].Lung cancer(Amsterdam,Netherlands),2014,86(2):115-120.doi:10.1016/j.lungcan.2014.09.004.

[16] Eskandani M,Vandghanooni S,Barar J,et al.Cell physiology regulation by hypoxia inducible factor-1:targeting oxygen-related nanomachineries of hypoxic cells[J].Int J Biol Macromol,2017,99:46-62.doi:10.1016/j.ijbiomac.2016.10.113.

[17] Marchiq I,Pouysségur J.Hypoxia,cancer metabolism and the therapeutic benefit of targeting lactate/H(+) symporters[J].J Mol Med(Berl),2016,94(2):155-171.doi:10.1007/s00109-015-1307-x.

[18] Manoochehri Khoshinani H,Afshar S,Najafi R.Hypoxia:a double-edged sword in cancer therapy[J].Cancer Invest,2016,34(10):536-545.doi:10.1080/07357907.2016.1245317.

[19] Yao H,Ashihara E,Maekawa T.Targeting the Wnt/beta-catenin signaling pathway in human cancers[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(7):873-887.doi:10.1517/14728222.2011.577418.

[20] Zhang K,Zhang J,Han L,et al.Wnt/beta-catenin signaling in glioma[J].J Neuroimmune Pharmacol,2012,7(4):740-749.doi:10.1007/s11481-012-9359-y.

[21] Guo Y,XiaoL,Sun L,et al.Wnt/beta-catenin signaling:a promising new target for fibrosis diseases[J].Physiol Res,2012,61(4):337-346.

[22] Monga SP.Role of Wnt/beta-catenin signaling in liver metabolism and cancer[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(7):1021-1029.doi:10.1016/j.biocel.2009.09.001.

[23] Cai J,Feng D,Hu L,et al.FAT4 functions as a tumour suppressor in gastric cancer by modulating Wnt/beta-catenin signalling[J].Br J Cancer,2015,113(12):1720-1729.doi:10.1038/bjc.2015.367.

[24] Chen X,Song X,Yue W,et al.Fibulin-5 inhibits Wnt/beta-catenin signaling in lung cancer[J].Oncotarget,2015,6(17):15022-15034.doi:10.18632/oncotarget.3609.

[25] Zhang Q,Bai X,Chen W,et al.Wnt/beta-catenin signaling enhances hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via crosstalk with hif-1alpha signaling[J].Carcinogenesis,2013,34(5):962-973.doi:10.1093/carcin/bgt027.

[26] Liu L,Zhu X D,Wang WQ,et al.Activation of beta-catenin by hypoxia in hepatocellular carcinoma contributes to enhanced metastatic potential and poor prognosis[J].Clin Cancer Res,2010,16(10):2740-2750.doi:10.1158/1078-0432.CCR-09-2610.

[27] To SK,Zeng WJ,Zeng JZ,et al.Hypoxia triggers a Nur77-beta-catenin feed-forward loop to promote the invasive growth of colon cancer cells[J].Br J Cancer,2014,110(4):935-945.doi:10.1038/bjc.2013.816.