劉志霞，周 舟，蔡 薇，程 姣，任春梅，2*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128）

PDF1.2基因是一個(gè)廣泛存在于植物中與抗逆相關(guān)的基因［1～4］。由于其參與植物體內(nèi)眾多的防御反應(yīng)，近年來一直受到廣泛的關(guān)注和研究。目前人們已經(jīng)從許多不同的植物中克隆出了該基因，如擬南芥、小麥、棉花等［5～7］。

在植物體內(nèi)，PDF1.2基因主要功能是編碼產(chǎn)生一類名為植物防御素的抗性蛋白。植物防御素不僅能抑制真菌的生長，同時(shí)也能在一定程度上抑制細(xì)菌的生長，抑制酶的活性，這些獨(dú)特的生物學(xué)特性使得植物防御素能有效的幫助植物抵抗來自于各種不利條件如真菌入侵、病毒感染、不良環(huán)境等逆境脅迫的侵害［8～10］。然而目前對于防御素提高植物抗性的作用機(jī)制并不是很明確。因此，利用基因工程技術(shù)研究PDF1.2基因的表達(dá)模式對于了解防御素的作用機(jī)制具有十分重要的意義。

由于具有操作簡單、反應(yīng)快速、檢測準(zhǔn)確、技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，將目的基因的啟動(dòng)子與GUS基因融合并轉(zhuǎn)化植物，對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行GUS染色，通過觀察GUS蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中不同器官及組織的表達(dá)來研究目的基因的表達(dá)模式是基因工程常用的技術(shù)之一。如胡佳等人利用GUS基因作為顯色基因來研究擬南芥葉片中油體含量［11］；張鑫平等人利用GUS染色技術(shù)來分析擬南芥和油菜花藥的特異性表達(dá)［12］。因此，本試驗(yàn)中選擇 GUS基因作為報(bào)告基因來構(gòu)建PDF1.2基因啟動(dòng)子的重組載體。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col－0，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，根癌農(nóng)桿菌 （Agro bacterium tumefactions） GV3101，載 體pCAMBIA1301等都由作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物信號傳導(dǎo)課題組提供。

1.2 植株培養(yǎng)條件

將擬南芥種子置于消毒液（20%bleach＋0.1%Triton100）中浸泡10～15 min，于超凈工作臺上用無菌水沖洗4～5遍，適當(dāng)密度播撒在MS固體培養(yǎng)基上，4℃春化3 d，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室22℃長日照（16 h光照／8 h黑暗）培養(yǎng)。長至7 d時(shí)，將其轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土（東北黑土與蛭石的體積比為1∶1）中，蓋上透明塑料薄蓋1～2 d。

1.3 載體的構(gòu)建

在TAIR網(wǎng)上查詢擬南芥PDF1.2基因并選取上游啟動(dòng)子區(qū)域序列，用在線軟件Plantcare對其進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增引物PDF1.2－F／PDF1.2－R，在引物5′端分別加上PstⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增引物序列為：

用SDS法提取擬南芥總DNA，以此為模板，用引物PDF1.2－F／PDF1.2－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段并純化。將回收純化后的目的片段和pCAMBIA1301載體用PstⅠ和NcoⅠ限制性內(nèi)切酶在37℃下過夜雙酶切，將得到的目的片段和目的載體進(jìn)行回收。用T4連接酶將PDF1.2基因啟動(dòng)子連接至pCAMBIA1301載體的預(yù)期位點(diǎn)。通過熱激法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，正確的進(jìn)行測序鑒定。

1.4 表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化

挑選測序正確的重組質(zhì)粒，通過電擊法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，將轉(zhuǎn)化液置于含有卡那霉素（50 mg／L）、慶大霉素（100 mg／L）、利福平（50 mg／L）的YEB固體培養(yǎng)基上28℃黑暗過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥Col－0野生型。收獲T0代種子播種于含有潮霉素（25 mg／L）的MS固體培養(yǎng)基上，長日照條件下培養(yǎng)2周后將抗性植株移栽至營養(yǎng)土中正常生長。

1.5 GUS染色

GUS染色液配制：將X－gluc溶于磷酸鈉緩沖液中（含100 mmol／L pH 7.0的磷酸鈉緩沖液，10 mmol／L EDTA，5 mmol／L鐵氰化鉀，5 mmol／L亞鐵氰化鉀），終濃度為 1 mmol／L。

挑選長日照條件下生長7 d的抗性植株浸入GUS染色液中，37℃避光過夜。用不同濃度酒精脫色，顯微鏡下觀察染色情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段克隆

在Plantcare網(wǎng)站對PDF1.2基因起始密碼子ATG上游約2000 bp左右的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中包含了大量核心啟動(dòng)子元件TATA－box、CAAT－box，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其還含有部分與生物脅迫相關(guān)的順式調(diào)控原件。這一結(jié)果表明該段PDF1.2基因啟動(dòng)子序列能正常啟動(dòng)該基因的表達(dá)，且PDF1.2基因在植物的抗逆和抗病等方面起到重要作用。

以擬南芥野生型基因組DNA為模板，利用引物PDF1.2－F／PDF1.2－R進(jìn)行擴(kuò)增，并利用電泳檢測擴(kuò)增片段，結(jié)果如圖1所示。所得擴(kuò)增片段大小約2000 bp左右，與預(yù)期大小相符，且沒有非特異性擴(kuò)增條帶。這一結(jié)果表明目的片段克隆成功，PCR產(chǎn)物可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 PDF1.2基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of PDF1.2 promoter

2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建

將擴(kuò)增所得目的片段與帶有報(bào)告基因GUS的pCAMBIA1301載體進(jìn)行酶切并用T4連接酶連接，將pPDF1.2∶∶GUS重組表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。下一步挑選陽性菌進(jìn)行菌落PCR來檢測轉(zhuǎn)化結(jié)果，如圖2所示。2～5號樣本中，轉(zhuǎn)化成功的菌落成功的檢測到目的片段，轉(zhuǎn)化未成功樣本無法檢測到目的片段。進(jìn)一步對檢測成功的菌落樣本進(jìn)行PstⅠ和NcoⅠ雙酶切驗(yàn)證。挑取檢測正確菌落進(jìn)行測序鑒定，通過序列比對保留目的片段大小正確、無移碼突變現(xiàn)象、且連接處與預(yù)期位置相符的樣本進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

圖2 菌落PCR結(jié)果Fig.2 PCR result of recombinant colonies

2.3 pPDF1.2：：GUS重組表達(dá)載體的遺傳轉(zhuǎn)化

通過電擊法將轉(zhuǎn)化正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌細(xì)胞中，利用PCR來檢測轉(zhuǎn)入情況，結(jié)果如圖3所示。在轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的農(nóng)桿菌樣本中成功檢測到大小為2000 bp左右與目的片段大小相似的條帶，證明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中。

挑選轉(zhuǎn)入成功的農(nóng)桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用浸花法將農(nóng)桿菌的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥Col－0野生型植株中。利用載體上的潮霉素抗性標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)基因植株種子進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖4所示。轉(zhuǎn)入成功的植株帶潮霉素抗性，在含25 mg／L潮霉素MS固體培養(yǎng)基上正常生長，未成功轉(zhuǎn)入的植株則在潮霉素培養(yǎng)基上無法正常生長。

圖3 農(nóng)桿菌菌落PCRFig.3 PCR of agro bacterium colony

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選Fig.4 Resistance screening of transgenic plants

2.4 GUS染色檢測轉(zhuǎn)基因植株

為了檢測重組載體是否成功轉(zhuǎn)入擬南芥植株中，將通過PCR鑒定的轉(zhuǎn)基因植株種子鋪種在含有25 mg／L潮霉素的MS培養(yǎng)基上，長日照條件下生長7 d。挑選無菌的幼苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，利用體式顯微鏡觀察染色結(jié)果，如圖5所示。轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301質(zhì)粒（含有35S啟動(dòng)子）的陽性對照幼苗中，GUS基因在根、莖、葉等器官中都高度表達(dá)；未轉(zhuǎn)入GUS基因的陰性對照幼苗中，GUS基因沒有任何表達(dá)；在轉(zhuǎn)入擬南芥PDF1.2基因啟動(dòng)子與GUS融合重組載體的轉(zhuǎn)基因植株中，GUS基因在根中有少量表達(dá)，在下胚軸及子葉中有較強(qiáng)的表達(dá)，在真葉葉柄部位有表達(dá)而在葉片上沒有表達(dá)。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株GUS染色表型Fig.5 The GUS staining phenotype of transgenic plants

3 結(jié)論與討論

本研究成功克隆了PDF1.2基因啟動(dòng)子片段并成功構(gòu)建了PDF1.2基因啟動(dòng)子與GUS重組載體，同時(shí)利用農(nóng)桿菌浸漬轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)入擬南芥植株中并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了GUS染色驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究PDF1.2基因在植物體內(nèi)的表達(dá)以及植物防御素的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，利用高效、天然、無害的殺菌劑來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)殺蟲劑幫助植物抵御外界病蟲害及各種逆境的危害是一種趨勢。植物體內(nèi)PDF1.2基因所編碼的植物防御素由于其具有廣譜的殺菌活性，能抑制多種細(xì)菌及真菌的生長，同時(shí)對動(dòng)植物細(xì)胞無明顯的毒性的特點(diǎn)，使其成為代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)殺蟲劑的選擇之一。研究PDF1.2基因的表達(dá)模式有利于了解植物防御素的作用機(jī)制。基因的表達(dá)受到啟動(dòng)子、終止子等眾多原件的調(diào)控，啟動(dòng)子決定了基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄頻率，對基因的表達(dá)起到了十分重要的作用。因此構(gòu)建PDF1.2基因啟動(dòng)子重組載體對于研究PDF1.2基因的表達(dá)模式以及植物防御素的作用機(jī)制是很有必要的。

GUS染色的結(jié)果顯示，擬南芥PDF1.2啟動(dòng)子與GUS基因的融合重組載體成功的轉(zhuǎn)入了擬南芥野生型中。在轉(zhuǎn)基因植株中，PDF1.2基因在下胚軸及子葉中有較強(qiáng)的表達(dá)，說明PDF1.2基因所參與和介導(dǎo)的防御途徑在下胚軸及子葉中比較活躍；在真葉葉片上沒有表達(dá)，說明PDF1.2基因所參與和介導(dǎo)的防御途徑在這一時(shí)期的真葉葉片中未被激活。PDF1.2基因在根、葉片、下胚軸等部位的表達(dá)差異，說明了植物防御素在擬南芥不同組織和部位存在著特異性的表達(dá)，然而這種特異性的表達(dá)有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 張海文，謝丙炎，盧向陽，等.擬南芥防衛(wèi)基因PDF1.2啟動(dòng)子中GCC盒是應(yīng)答茉莉素反應(yīng)必要的順式作用元件［J］.科學(xué)通報(bào)，2004，49（23）：2444－2448.

［2］ 封功能.水稻穗發(fā)育相關(guān)突變體pla1－5、pdf1和tri1的鑒定、基因定位與克隆研究［D］.揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文，2013.

［3］ 冀瑞琴，董祥柏，馮 輝，等.PDF1.2基因在轉(zhuǎn)草酸氧化酶基因甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2009，45（5）：479－482.

［4］ 邱玲玉.葡萄PDF基因的啟動(dòng)子功能分析及ERF轉(zhuǎn)錄因子對PDF基因表達(dá)的調(diào)控［D］.大連：遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2011.

［5］ 張海文.PDF1.2啟動(dòng)子中茉莉素應(yīng)答的順式作用元件及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2002.

［6］ 史靈敏，張 斌，丁漢鳳，等.三個(gè)小麥防御素基因的克隆及序列分析［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（11）：1－8.

［7］ 鄭云娜.海島棉GbPDF2基因的克隆及功能分析［D］.杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014.

［8］ 何 玲，楊素云，劉 媛，等.植物防御素在抗植物病害方面的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2017，7（3）：147－149.

［9］ 朱立成，羅 輝，任 悍.植物防御素結(jié)構(gòu)與功能及其抗真菌機(jī)制研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2014（3）：9－14.

［10］張 宏，胡春香，張德祿，等.植物防御素研究進(jìn)展［J］.西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，42（5）：112－117.

［11］胡 佳，曾文婕，劉春林.葉片中GUS染色觀測油體含量技術(shù)體系的建立［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2017，53（2）：185－190.

［12］張鑫平.擬南芥和油菜花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆與功能分析［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2015.