劉　雪 ，曹建全 ，李　霞 ，楊愛華 ，張學(xué)梅

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東景芝 262119； 2.山東省釀造食品生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東景芝 262119）

大曲是我國古老的曲種，根據(jù)大曲在發(fā)酵中的作用也可將其稱為糖化發(fā)酵劑[1]，它巧妙地將野生菌進(jìn)行人工自然培養(yǎng)，選育有益菌種，積蓄酶及發(fā)酵前體物質(zhì)，并為發(fā)酵提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

利用大曲生產(chǎn)的白酒稱為大曲酒，一般來說大曲酒比小曲酒、麩曲酒質(zhì)量好。俗話說“曲乃酒之骨[2]”，這充分說明了曲在白酒中的重要作用。大曲的主要原料是小麥，把小麥制成大曲的過程是一個(gè)培菌的過程，整個(gè)制曲工藝過程中有眾多種類的微生物先后交替、共同作用，關(guān)系極為復(fù)雜。簡(jiǎn)單來說，大曲中的有益微生物將小麥等原料中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸、酚類化合物等香味成分，使其產(chǎn)生曲

香氣味，成為大曲酒微量香味成分的主要來源[3]。大曲除了是重要的糖化發(fā)酵劑和生香劑以外，還能夠富集各種微生物，整個(gè)制曲過程和儲(chǔ)存過程都是在開放性環(huán)境中進(jìn)行的，大曲制作發(fā)酵完成后必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存才能投入生產(chǎn)使用，適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存對(duì)于大曲的質(zhì)量提升有著極其重要的作用。因此，本研究對(duì)不同儲(chǔ)存時(shí)間的中溫大曲和高溫大曲進(jìn)行分析，主要從大曲理化指標(biāo)變化和微生物的種類演變、數(shù)量變化規(guī)律方面進(jìn)行研究，為合理設(shè)定大曲儲(chǔ)存時(shí)間提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料、儀器

樣品：景芝新出房中溫曲、新出房高溫曲、外購高溫曲（儲(chǔ)存3個(gè)月以上），裝袋后儲(chǔ)存，每隔1個(gè)月分析1次。

培養(yǎng)基：細(xì)菌及芽孢桿菌培養(yǎng)基：PCA培養(yǎng)基；霉菌和酵母培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；乳酸菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

儀器設(shè)備：MLS-3751-PC高壓蒸汽滅菌鍋，日本松下公司；DNP型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；厭氧培養(yǎng)盒，日本三菱公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；JY10002電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱，太倉實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2　實(shí)驗(yàn)流程（圖1）

圖1　實(shí)驗(yàn)流程圖

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

（1）大曲理化指標(biāo)分析采用釀酒大曲通用分析方法QB/T 4257—2011。

（2）細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用GB 47892—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定法；其中芽孢桿菌計(jì)數(shù)采用80℃加熱15 min后涂平板，培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)；霉菌和酵母檢測(cè)采用GB4789.15—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)法；乳酸菌檢測(cè)采用GB 4789.35—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)法。

2　結(jié)果與分析

2.1　理化指標(biāo)隨儲(chǔ)存期的變化

2.1.1　大曲水分、酸度的變化情況（表1）

表1中的分析數(shù)據(jù)顯示，在大曲儲(chǔ)存的5個(gè)月期間，水分和酸度兩項(xiàng)理化指標(biāo)未隨儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)而發(fā)生變化。不同的大曲之間，水分差別不大，但高溫曲的酸度比中溫曲高。眾所周知，水分受環(huán)境的影響較大，由于樣品的儲(chǔ)存環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，因此水分未出現(xiàn)明顯變化規(guī)律。據(jù)報(bào)道，大曲中的酸有兩大來源，最主要的是由醋酸菌和乳酸菌代謝產(chǎn)生的醋酸和乳酸，其次就是原料中的脂肪、淀粉和蛋白酶發(fā)生降解而產(chǎn)酸[4]。據(jù)此分析酸度變化不大的原因主要是在制曲過程中微生物繁殖，引起了酸度的增加，制曲結(jié)束后，雖然生酸菌減少，但由微生物代謝產(chǎn)生的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等開始水解淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪產(chǎn)酸，因此使得大曲的酸度維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。

2.1.2　糖化力的變化情況（圖2）

圖2　大曲在不同儲(chǔ)存時(shí)間糖化力的變化情況

糖化力高可以提高出酒率，但不利于酒的質(zhì)量提高，而糖化力太低又不利于發(fā)酵，因此合適的糖化力水平對(duì)于白酒生產(chǎn)十分重要。由圖2可知，隨著儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)，大曲的糖化力均呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。主要是由于進(jìn)入儲(chǔ)存期后溫度降低，霉菌等產(chǎn)糖化酶的微生物開始繁殖，糖化力會(huì)

表1　中高溫大曲的水分和酸度隨儲(chǔ)存期延長(zhǎng)的變化情況

出現(xiàn)一個(gè)短暫的上升期，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)（3個(gè)月后），糖化力便開始下降直到穩(wěn)定，這一點(diǎn)在霉菌的變化規(guī)律中也可以證實(shí)（圖7）。另外還可以看出，中溫大曲的糖化力較高，平均在1015葡萄糖mg/g·h左右，而高溫大曲的糖化力普遍低于中溫曲，平均約820葡萄糖mg/g·h，外購高溫曲1和景芝高溫曲糖化力基本接近，外購高溫曲2糖化力較低，處于300～500葡萄糖mg/g·h之間，是高溫曲較為理想的水平。中溫曲儲(chǔ)存至5個(gè)月時(shí)糖化力為960葡萄糖mg/g·h，仍然較高，因此實(shí)際應(yīng)用時(shí)還要進(jìn)一步延長(zhǎng)儲(chǔ)存期或調(diào)整制曲工藝，將大曲的糖化力降到合適的水平。

2.1.3　液化力的變化情況（圖3）

圖3　大曲在不同儲(chǔ)存時(shí)間液化力的變化情況

糧食中的淀粉首先是轉(zhuǎn)變成糊精，然后再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成糖，這一過程我們稱作液化，而液化力指的是微生物酶將淀粉轉(zhuǎn)化成糖的能力。由圖3可知，大曲儲(chǔ)存0～2個(gè)月時(shí)，液化力處于下降的趨勢(shì)，而3個(gè)月之后液化力開始逐步升高。這說明大曲在儲(chǔ)存過程中微生物酶的含量和活性也在發(fā)生變化，儲(chǔ)存3個(gè)月以上的大曲中微生物酶活力較高，因此液化力會(huì)有所提高。另外還可以看出高溫曲的液化力明顯低于中溫曲。

2.1.4　發(fā)酵力的變化情況（圖4）

圖4　大曲在不同儲(chǔ)存期發(fā)酵力變化情況

大曲的發(fā)酵力是反映大曲產(chǎn)酒能力的重要指標(biāo)之一。發(fā)酵力與大曲中的酵母菌有關(guān)，它可以將酒醅中的糖分轉(zhuǎn)化為乙醇[5]。由圖4可知，大曲儲(chǔ)存前期，發(fā)酵力迅速下降，而3個(gè)月后發(fā)酵力趨于穩(wěn)定。因此一般大曲儲(chǔ)存滿3個(gè)月使用時(shí)，發(fā)酵力已經(jīng)處于較為理想的平穩(wěn)狀態(tài)。

圖5　細(xì)菌總數(shù)隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化情況

2.2　儲(chǔ)存過程中微生物的消長(zhǎng)情況（圖5—圖9）

大曲中的細(xì)菌主要包含芽孢桿菌、乳酸菌、醋酸菌等[6]，種類多，分布廣，生長(zhǎng)快，是大曲產(chǎn)酸、分解蛋白質(zhì)的重要來源[7]，在大曲儲(chǔ)存過程中，細(xì)菌的變化趨勢(shì)如圖5所示，由圖5可知，大曲出房時(shí)細(xì)菌總數(shù)達(dá)到最高值，其中中溫曲為1.45×107cfu/g、高溫曲為3.7×105cfu/g，外購高溫曲1為1.6×105cfu/g，外購高溫曲2為2.8×104cfu/g，進(jìn)入儲(chǔ)存期后,由于儲(chǔ)存環(huán)境干燥，不利于細(xì)菌的富集，菌數(shù)便逐漸下降。儲(chǔ)存至5個(gè)月時(shí)，中溫曲中細(xì)菌總數(shù)下降至2.23×106cfu/g，降低了84.6%，高溫曲由于制曲溫度較高，出房時(shí)細(xì)菌中的芽孢桿菌居多，能適應(yīng)極端環(huán)境而不易死亡，因此儲(chǔ)存時(shí)下降幅度比中溫曲要小一點(diǎn)，儲(chǔ)存至5個(gè)月時(shí)細(xì)菌總數(shù)下降了20.8%，為2.93×105cfu/g。外購高溫曲1和高溫曲2也都有所下降。

圖6　芽孢桿菌總數(shù)隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化情況

圖7　霉菌數(shù)量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化情況

芽孢桿菌在白酒釀造中具有非常重要的作用，能夠產(chǎn)生吡嗪類、揮發(fā)性酸、芳香類以及酚類物質(zhì)[8-9]，還能強(qiáng)化美拉德反應(yīng)[10]，是影響白酒口感的重要菌株。據(jù)報(bào)道[11]，隨著儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)，細(xì)菌的種類趨于單一，芽孢桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌種。由圖6可知，芽孢桿菌數(shù)量隨著儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)而明顯升高，在出房時(shí)中溫大曲芽孢桿菌的數(shù)量為8.97×104cfu/g，儲(chǔ)存3個(gè)月后開始明顯增多，儲(chǔ)存5個(gè)月時(shí)芽孢桿菌數(shù)增加到6.82×105cfu/g；高溫大曲芽孢桿菌數(shù)由剛出房的5.6×103cfu/g，增長(zhǎng)到2.87×104cfu/g，提高了約4倍。結(jié)合細(xì)菌總數(shù)的變化趨勢(shì)（圖5）可以看出，細(xì)菌中芽孢桿菌所占的比例明顯上升，這說明雖然中溫曲儲(chǔ)存過程中細(xì)菌總數(shù)在降低，但芽孢桿菌數(shù)量并未下降，其減少的大部分都是雜菌，因此可以說大曲儲(chǔ)存的過程也是優(yōu)勢(shì)菌群自然篩選富集的過程。

圖8　酵母菌隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化情況

圖9　乳酸菌隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化情況

霉菌是大曲中主要的微生物，含有多種產(chǎn)糖化酶的菌種，與大曲的糖化力和液化力息息相關(guān)[12]。由圖7可知，外購高溫曲1霉菌的數(shù)量在3個(gè)月之后還持續(xù)上升，除此之外，其他大曲霉菌的數(shù)量整體都隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，分析原因可能是由于制曲過程中的溫度較高，不利于霉菌的繁殖，進(jìn)入儲(chǔ)存階段，隨著溫度下降，霉菌便得以繁殖。具體來看，中溫曲中的霉菌先上升后持續(xù)下降，最高時(shí)達(dá)到1.1×106cfu/g，儲(chǔ)存至5個(gè)月時(shí)中溫曲的霉菌數(shù)量降低至5.58×105cfu/g，與糖化力的變化趨勢(shì)（圖2）相吻合，說明儲(chǔ)存期糖化力的高低與霉菌的數(shù)量呈正相關(guān)。高溫曲的霉菌數(shù)量最高為1.35×105cfu/g，經(jīng)過5個(gè)月儲(chǔ)存后降至5.75×104cfu/g。由圖2可知，外購高溫曲2的糖化力處于較為理想水平，據(jù)此可初步將高溫大曲霉菌的數(shù)量定為不超過2.1×105cfu/g即可。

大曲中含有的酵母種類和數(shù)量都很多，其中釀酒酵母是白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌株，是酒精發(fā)酵的主要?jiǎng)恿13]，另外還包括很多產(chǎn)酯酵母、產(chǎn)香酵母等等。大曲在儲(chǔ)存時(shí)期的酵母數(shù)量變化情況如圖8所示，由圖8可知，在大曲儲(chǔ)存的前期酵母數(shù)量有小幅度的上升，在隨后的儲(chǔ)存過程中，隨著儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)，其酵母菌的數(shù)量開始下降，且下降趨勢(shì)越來越明顯，外購高溫曲在儲(chǔ)存期達(dá)到7個(gè)月時(shí)，僅檢測(cè)到少量酵母的存在，結(jié)合大曲發(fā)酵力變化趨勢(shì)（圖4）可以看出，隨著儲(chǔ)存期延長(zhǎng)，大曲的酵母數(shù)量及酶活力均有下降趨勢(shì)，導(dǎo)致發(fā)酵力也隨之下降。

乳酸菌的代謝產(chǎn)物主要是乳酸，乳酸和乙醇進(jìn)一步酯化可生成乳酸乙酯，乳酸乙酯是白酒中四大酯類物質(zhì)之一，因此乳酸菌也是白酒釀造過程中非常重要的一種微生物。白酒釀造過程中存在適宜的乳酸菌有利于維護(hù)釀酒環(huán)境、促進(jìn)釀酒發(fā)酵、促進(jìn)美拉德反應(yīng)等作用[14]，但乳酸菌數(shù)量過多或者過少都對(duì)白酒的釀造不利，影響白酒口感。中高溫大曲在儲(chǔ)存過程中乳酸菌的變化情況如圖9所示，由圖9可知，在大曲的儲(chǔ)存階段，乳酸菌數(shù)量隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，尤其在儲(chǔ)存的前2個(gè)月下降幅度很大。這表明實(shí)際儲(chǔ)存時(shí)，至少要超過2個(gè)月的儲(chǔ)存期，才可獲得相對(duì)穩(wěn)定的乳酸菌數(shù)量。外購高溫大曲1和高溫大曲2由于儲(chǔ)存時(shí)間超過3個(gè)月，前期變化情況無法獲知，且由于檢測(cè)到的菌數(shù)較少，導(dǎo)致誤差較大，但仍能反映出變化規(guī)律，即儲(chǔ)存3個(gè)月后乳酸菌數(shù)量仍有下降趨勢(shì)。

3　結(jié)論

為研究大曲隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)的變化規(guī)律，將新出房的中溫曲和高溫曲進(jìn)行儲(chǔ)存，每月跟蹤分析其理化指標(biāo)和可培養(yǎng)微生物變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，大曲水分酸度變化不大，進(jìn)一步對(duì)可培養(yǎng)微生物種類進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)，細(xì)菌數(shù)量逐漸減少而芽孢桿菌的占有率逐步上升；霉菌、酵母菌、乳酸菌都隨著儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)而下降，糖化力指標(biāo)也呈先升高后緩慢降低趨勢(shì)，液化力在前2個(gè)月時(shí)迅速降低，3個(gè)月后有所升高，然后趨于平穩(wěn)；酵母菌在初期出現(xiàn)小幅上升后也緩慢降低，相應(yīng)的發(fā)酵力在前3個(gè)月時(shí)急劇下降，之后也趨于平穩(wěn)；各類微生物和理化指標(biāo)變化情況在儲(chǔ)存3個(gè)月以后變化緩慢，并逐步趨于平穩(wěn)。

綜合考慮以上各項(xiàng)指標(biāo)在儲(chǔ)存過程中的變化情況，結(jié)合大曲在白酒釀造中的作用，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)當(dāng)注意制曲溫度和糖化力的關(guān)系，不能片面追求高糖化力，而是要求菌系、物系和酶系的平衡與協(xié)調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)大曲從剛出房至儲(chǔ)存的前兩個(gè)月過程中，各項(xiàng)理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)都處在不穩(wěn)定的狀態(tài)，3個(gè)月之后才逐步趨于穩(wěn)定，且儲(chǔ)存期延長(zhǎng)細(xì)菌等生酸菌逐漸減少，芽孢桿菌等有益微生物還在增加，生物酶也在不斷累積，這些都更利于白酒生產(chǎn)。據(jù)報(bào)道[15]，儲(chǔ)存3～4個(gè)月的大曲，其纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、酯化酶的活力均達(dá)到最佳狀態(tài)。綜合考慮所有影響因素，建議大曲最短要儲(chǔ)存3個(gè)月才可投入生產(chǎn)使用，其中中溫曲最好儲(chǔ)存超過5個(gè)月才可使用，這并不意味著大曲儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)越好。眾所周知，儲(chǔ)存期在12個(gè)月之內(nèi)，對(duì)出酒率影響不大，且儲(chǔ)存期長(zhǎng)者，曲香好，酒質(zhì)口感更醇和。超過12個(gè)月以上的陳年老曲，曲蟲會(huì)很多，這會(huì)造成大曲淀粉的流失，甚至破壞大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)和酶系，使大曲質(zhì)量變差，嚴(yán)重影響窖內(nèi)發(fā)酵，出酒率明顯下降。且曲塊儲(chǔ)存期越長(zhǎng)，其損耗越大，加之庫存占用也大，會(huì)擠壓大量資金。所以，從經(jīng)濟(jì)效益、曲塊的微生物數(shù)量及生化性能變化、釀造效果等幾個(gè)方面綜合考慮，并結(jié)合大生產(chǎn)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，建議高溫大曲儲(chǔ)存3個(gè)月以上，中溫大曲儲(chǔ)存期以5個(gè)月以上為好，最長(zhǎng)不宜超過12個(gè)月，特別是一些大曲儲(chǔ)存條件差的酒廠，更不宜久貯。另外，由于大曲貯存過程中各項(xiàng)指標(biāo)（糖化力、液化力、發(fā)酵力、微生物種類及數(shù)量等等）消長(zhǎng)不一致，故可采取不同貯存期的大曲相互搭配調(diào)節(jié)使用的方式。

值得注意的是本研究采用的是傳統(tǒng)的稀釋平板法測(cè)定大曲中微生物的數(shù)量，這種方法受到很多因素的影響，如溫度、濕度，另外還存在樣品均勻度差異和操作人員差異等因素，故計(jì)數(shù)的重復(fù)性較差，雖不能精確反映微生物在大曲中的數(shù)量，但卻可以大致反映大曲儲(chǔ)存過程中微生物的生長(zhǎng)趨勢(shì)和規(guī)律。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們將采用高通量測(cè)序以及熒光定量的方法對(duì)微生物數(shù)量和種類進(jìn)行更準(zhǔn)確的研究，這也是我們今后的研究方向之一。

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