宋嬌嬌，楊　勇，譚洪弟，李　喆，余美麗

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800）

核苷類物質(zhì)包括腺苷、腺嘌呤、3-脫氧腺苷、尿嘧啶、鳥苷、鳥嘌呤、胸嘧啶、胞苷、次黃嘌呤等[1]。核苷類物質(zhì)對人體免疫、代謝以及肝臟、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮著重要的生理作用，且具有抗菌和抗病毒等生理活性[2]，如腺苷具有改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性等[3]。洋河酒廠以釀造環(huán)境中篩選出1株產(chǎn)核苷類物質(zhì)的菌株為研究基礎(chǔ)，通過固態(tài)發(fā)酵形成固態(tài)發(fā)酵物。本研究以核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物為研究對象，優(yōu)化超聲波提取核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物中總核苷工藝，為核苷類物質(zhì)的更廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑及儀器

實驗菌種：洋河酒廠技術(shù)中心功能微生物實驗室保藏。

核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物：以核苷功能菌為實驗菌株，麩皮為培養(yǎng)基進行固態(tài)培養(yǎng)形成的發(fā)酵產(chǎn)物。

腺苷對照品：美國sigma公司生產(chǎn)。

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KH-500DB型數(shù)控超聲清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UV-240可見紫外分光光度計，日本島津。

1.2　試驗方法

1.2.1　核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物制備

以麩皮為培養(yǎng)基質(zhì)，添加一定比例營養(yǎng)液，接種核苷功能菌，30℃培養(yǎng)4～5 d，形成富含核苷類物質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.2　提取液制備

將核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物進一步粉碎成粉狀，稱取1 g粉碎后樣品置于500 mL三角瓶中，按一定的料液比添加蒸餾水，在一定提取溫度、超聲頻率條件下提取一定時間后，過濾，取濾液備用。

1.2.3　提取液中總核苷提取量測定[4]

（1）最大吸收波長的確定

將核苷對照品于200～400 nm處作全程掃描,其最大吸收波長在259 nm左右，所以選擇259 nm為檢測波長。

（2）腺苷對照品儲備液的配制

精密稱取腺苷對照品1.74 mg，用蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配制成17.4 μg/mL的水溶液作為對照品儲備液，避光冷藏。

（3）腺苷標準曲線的繪制

精密吸取腺苷對照品儲備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL于10 mL容量瓶中，分別用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，配制成不同濃度的對照品溶液。以去離子水作為空白，用紫外分光光度法在259 nm處分別測定對照品溶液的吸光度(ABS)，以吸光度為橫坐標，腺苷對照品溶液濃度(μg/mL)為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果腺苷對照品在5.208～13.913 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=8.6311X-0.0042，r=0.9998（其中X為吸光值，Y為腺苷濃度，μg/mL）。

（4）樣品提取量測定

取核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物提取液，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾，適當稀釋至標準曲線濃度范圍，搖勻。以去離子水作為空白，用島津UV-240可見-紫外分光光度計在波長259 nm處測定其吸光度，計算出總核苷類物質(zhì)的含量。

1.2.4　單因素試驗

固定料液比100∶1，提取溫度50℃，超聲頻率70 Hz，分別選取提取時間15 min、30 min、45 min、60 min、75 min進行超聲提取，平行提取3次，考察提取時間對總核苷提取量的影響。

固定提取時間30 min，超聲頻率70 Hz，提取溫度50 ℃，料液比（ mL/g）分別按照50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1、300∶1加入蒸餾水進行超聲提取，平行提取3次，考察料液比對總核苷提取量的影響。

固定料液比100∶1，提取時間45 min，超聲頻率70 Hz，分別選取提取溫度35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃進行超聲提取，平行提取3次，考察提取溫度對總核苷提取量的影響。

固定料液比100∶1，提取時間45 min，提取溫度50 ℃，分別選取超聲頻率40 Hz、50 Hz、60 Hz、70 Hz、80 Hz、90 Hz進行超聲提取，平行提取3次，考察超聲頻率對總核苷提取量的影響。

1.2.5　響應(yīng)面試驗設(shè)計[5-6]

通過對影響總核苷提取量的單因素分析，選取對總核苷提取量影響顯著的單因素提取時間、料液比、提取溫度以及超聲頻率為考察因素，以總核苷提取量為目標值，運用Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面分析試驗。

1.2.6　數(shù)據(jù)處理及分析

利用SPSS 21軟件進行方差分析，Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗結(jié)果

2.1.1　提取時間對總核苷提取量的影響（圖1）

由圖1可知，提取時間15～30 min時，總核苷提取量無顯著差異，提取時間45 min時，總核苷提取量顯著增加，提取時間超過45 min時，總核苷提取量趨于穩(wěn)定，無顯著變化。說明超聲提取時間的延長有助于總核苷提取量的增加，提取時間過短則核苷類物質(zhì)未充分提取進入溶液，但隨著提取時間進一步增加，溶解度達到飽和，總核苷提取量達到最大限度，不再增加[7]?？紤]到總核苷提取量、降低能耗等多方面因素，選擇最佳提取時間45 min。

圖1　提取時間對總核苷提取量的影響

2.1.2　料液比對總核苷提取量的影響（圖2）

圖2　料液比對總核苷提取量的影響

由圖2可知，料液比在100∶1時總核苷提取量達到最大值，再增大提取劑用量，總核苷提取量降低，且繼續(xù)增大提取劑用量總核苷提取量無顯著變化?？赡艿脑颍毫弦罕瘸^一定范圍，會增加超聲波破碎細胞的阻力，使細胞破碎程度下降[8]，從而降低核苷類物質(zhì)的溶出效率。綜合考慮選擇最佳料液比為100∶1。

2.1.3　提取溫度對總核苷提取量的影響（圖3）

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，總核苷提取量呈先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，可能的原因是溫度低于50℃時，隨著溫度的升高，加強了分子間的相對運動，進一步破壞細胞結(jié)構(gòu)[9]，增強了核苷類物質(zhì)的溶出；提取溫度超過50℃時，溫度對核苷類物質(zhì)的影響不顯著。綜合考慮提取溫度選取50℃。

2.1.4　超聲頻率對總核苷提取量的影響（圖4）

圖3　提取溫度對總核苷提取量的影響

圖4　超聲頻率對總核苷提取量的影響

由圖4可知，在超聲頻率40～50 Hz范圍內(nèi)，總核苷提取量隨著超聲頻率的增加顯著提升，但超聲頻率超過50 Hz時，總核苷提取量顯著下降，再增加超聲頻率對總核苷提取量無顯著影響。說明一定頻率的超聲處理有利于提升核苷類物質(zhì)溶出效果，總核苷提取量顯著提升，但超聲頻率過高，可能導(dǎo)致核苷類物質(zhì)被破壞，總核苷提取量不增反降[10]。因此選擇最佳超聲頻率為50 Hz。

2.2　響應(yīng)面分析法優(yōu)化總核苷的超聲提取工藝

2.2.1　響應(yīng)面BOX-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

依據(jù)Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，結(jié)合超聲提取單因素試驗結(jié)果，選取對總核苷提取量影響顯著的提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）以及超聲頻率（D）為考察因素，用-1、0、+1分別表示低、中、高3水平，以總核苷提取量為響應(yīng)值（Y），進行4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，因素水平編碼見表1，響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。

2.2.2　方差分析和二元回歸方程擬合

利用Design Expert 8.0.6.1軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，對各因素進行回歸擬合后，得到總核苷提取量（Y）與提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）以及超聲頻率（D）之間的四元二次回歸方程：

表1　響應(yīng)面試驗設(shè)計因素及水平編碼

表2　響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

Y=3.59+0.070×A-0.21×B+0.30×C-0.058×D+0.02×A×B-0.04×A×C+5.00E-003×A×D+0.033×B×C-0.018×B×D+0.16×C×D-0.042×A2-0.40×B2-0.36×C2-0.090×D2，對該模型進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

由表3可知，該回歸模型的P＜0.0001，說明所選擇的回歸方程具有極顯著性，試驗設(shè)計可靠。失擬項P=0.2157＞0.05，說明失擬項差異不顯著，表明無失擬因素存在，對模型是有利的，證明該回歸方程能夠較顯著擬合提取時間、料液比、提取溫度、超聲頻率對總核苷提取量的影響，該模型能夠代替試驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。本試驗中模型校正系數(shù)（R2Adj）為0.8848，說明總核苷提取量與模型回歸有著良好的一致性，該模型能夠解釋88.48%的響應(yīng)值變化。因此，該模型是顯著且可靠的，可以用來預(yù)測超聲提取條件對總核苷提取量的影響。

回歸方程各項的方差分析結(jié)果表明，料液比（B）一次項及其二次項、提取溫度（C）一次項及其二次項的P＜0.01，具有極顯著性。提取溫度（C）和超聲頻率（D）的交互項P＜0.05，具有顯著性。提取時間（A）一次項和二次項、超聲頻率（D）一次項和二次型、交互項（AB、AC、AD、BC、BD）P＞0.05，對結(jié)果影響不顯著，剔除不顯著項，得到的模型方程為：

總核苷提取量=3.59-0.21×B+0.30×C+0.16×C×D-0.40×B2－0.36×C2。

由F值可知，各因素對總核苷提取量影響大小依次為：C（提取溫度）＞B（料液比）＞A（提取時間）＞D（超聲頻率）。

2.2.3　響應(yīng)面交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，所得響應(yīng)面及等高線見圖5和圖6，該圖組可直觀地反映各個因素及其交互作用對總核苷提取量的影響。其中，等高線的形狀可以反映出各因素間交互作用的強弱，如果等高線為鞍型或橢圓形，則表示兩者交互作用顯著；如果等高線為圓形，則表示兩者交互作用不顯著[11]。

圖5顯示了提取時間和超聲頻率在中心水平下，料液比與提取溫度交互作用對總核苷提取量的影響。由圖5可知，等高線圖為接近圓形，表明提取溫度與料液比交互作用不顯著。圖6顯示了提取時間和料液比在中心水平下，超聲頻率與提取溫度交互作用對總核苷提取量的影響。由圖6可知，等高線為橢圓形，表明提取溫度與超聲頻率的交互作用是顯著的。這與表3中兩個交互項的p值0.6051、0.0225相比較，確定交互項中只有提取溫度與超聲頻率的交互作用是顯著的。

表3　回歸模型方差分析表

圖5　料液比與提取溫度交互作用影響總核苷提取量的響應(yīng)面圖與等高線圖

2.2.4　最佳提取條件的預(yù)測與驗證

對優(yōu)化后的回歸方程求解，在試驗的因素水平范圍內(nèi)預(yù)測總核苷提取的最佳條件為：提取時間53.87 min，料液比88.70∶1，提取溫度55.96 ℃，超聲頻率50.63 Hz，在此條件下總核苷提取量為3.69 mg/g?？紤]到實際試驗操作的可行性，將超聲總核苷提取的最佳條件修正為：提取時間54 min，料液比90∶1，提取溫度56℃，超聲頻率50 Hz，在此條件下進行3組驗證性試驗，測得總核苷提取量為3.79 mg/g,與預(yù)測理論值的相對誤差在5%以內(nèi)，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取總核苷工藝的方法可行且快速。

圖6　超聲頻率與提取溫度交互作用影響總核苷提取量的響應(yīng)面圖與等高線圖

3　結(jié)論

本研究考察超聲提取條件：提取時間、料液比、提取溫度、超聲頻率4個單因素對總核苷提取量的影響，確定條件優(yōu)化的范圍，然后經(jīng)響應(yīng)面法設(shè)計并對提取條件進行優(yōu)化。最優(yōu)總核苷提取條件為：提取時間53.87 min，料液比88.70∶1，提取溫度55.96℃，超聲頻率50.63 Hz，在此條件下總核苷提取量為3.69 mg/g。最終調(diào)整為提取時間54 min，料液比90∶1，提取溫度56℃，超聲頻率50 Hz，在此最佳條件下，總核苷的提取量為3.79 mg/g,與預(yù)測理論值的相對誤差在5%以內(nèi)，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化超提取總核苷工藝的方法可行且快速。

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