徐新彪 ，劉雙平 ，，4，鄒慧君 ，周志磊 ，3，韓　笑 ，5，姬中偉 ，3，毛　健 ，3，5

（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室食品學(xué)院，江蘇無錫 214122； 2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000； 3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興 312000； 4.江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院食品生物技術(shù)研究所（如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司），江蘇南通 226500； 5.江南大學(xué)（如皋）食品生物技術(shù)研究所，江蘇南通 226500）

β-苯乙醇天然存在于玫瑰花、康乃馨等植物及精油中，是具有玫瑰花香的芳香醇，同時作為一種重要的香精香料成分，廣泛應(yīng)用于食品、煙草和日化用品中[1-2]。β-苯乙醇在發(fā)酵酒中廣泛存在，在啤酒中含量為15～20 mg/L；在清酒中含量為40～60 mg/L，在黃酒中含量可以達(dá)到100 mg/L左右，雖然濃度已經(jīng)較高，但是進一步提高β-苯乙醇含量有利于提升黃酒風(fēng)味[3-4]。β-苯乙醇是黃酒中重要的芳香化合物，賦予黃酒優(yōu)雅的香氣，在黃酒國標(biāo)GB/T 13662—2008中，對不同類型黃酒中β-苯乙醇最低含量有要求[5]。

黃酒中β-苯乙醇主要由黃酒酵母（釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）代謝產(chǎn)生，黃酒酵母合成β-苯乙醇主要有Ehrlich途徑和從頭合成途徑（見圖1），其中有兩個關(guān)鍵反饋抑制，DAHP合成酶分別受到L-苯丙氨酸和酪氨酸的反饋抑制。在含有一定濃度L-苯丙氨酸結(jié)構(gòu)類似物即對氟苯丙氨酸（PFP）的篩選培養(yǎng)基上，低產(chǎn)DAHP合成酶的菌株容易被殺死或抑制生長，經(jīng)誘變后產(chǎn)酶量高的菌株可以先與底物類似物結(jié)合以消除其抑制作用，從而篩選出高產(chǎn)β-苯乙醇的正突變菌株[6-7]。雖然目前基因工程技術(shù)已成熟運用于微生物優(yōu)良性狀定向改造，但是基因工程菌株在傳統(tǒng)發(fā)酵黃酒中應(yīng)用仍存在爭議與市場風(fēng)險，為避免此問題，本研究選用傳統(tǒng)紫外誘變結(jié)合底物類似物抗性選育，所選育出的黃酒酵母完全可以在黃酒發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用。

圖1　釀酒酵母β-苯乙醇合成途徑

釀酒酵母作為雙倍體菌株，誘變后正突變菌株可能會存在遺傳不穩(wěn)定的問題，雙倍體營養(yǎng)體可以通過產(chǎn)生子囊孢子生成單倍體孢子，而在HO基因未敲除的情況下單倍體自身會轉(zhuǎn)化為雙倍體。

目前釀酒酵母發(fā)酵法提高β-苯乙醇產(chǎn)量分為兩類，一類是選育釀酒酵母并在發(fā)酵體系中外源添加前體化合物L(fēng)-苯丙氨酸，通過Ehrlich途徑提高β-苯乙醇產(chǎn)量，如崔志峰等紫外誘變獲得了1株在L-苯丙氨酸為5 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中β-苯乙醇產(chǎn)量為3.6 g/L，比出發(fā)菌株提高了9.1%的菌株，以及黃筱萍等篩選出1株在L-苯丙氨酸含量為8 g/L的發(fā)酵體系下，β-苯乙醇質(zhì)量濃度達(dá)4.3l g/L的釀酒酵母菌株,但是在發(fā)酵工業(yè)中外源添加氨基酸的成本較高；另一類是選育的釀酒酵母直接利用碳源從頭合成β-苯乙醇，如李記明等報道釀酒酵母在干紅葡萄酒中產(chǎn)量達(dá)169.38 mg/L，但是并未對酒精發(fā)酵能力做具體報道[8-10]。由于β-苯乙醇對酵母的脅迫能力高于乙醇，高產(chǎn)β-苯乙醇釀酒酵母產(chǎn)乙醇能力通常會有降低，所以在不外源添加前體化合物下，選育高產(chǎn)β-苯乙醇并且酒精發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母在釀造工業(yè)中具有較高應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑及儀器

1.1.1　菌株與主要試劑

釀酒酵母出發(fā)菌株Y1615：資源平臺號S.cerevisiaeRWBL Y1615 ZC，從紹興地區(qū)酒廠篩選并在實驗室菌種庫保藏；對氟苯丙氨酸（PFP）：上海百靈威公司；無氨基酵母氮源（YNB）培養(yǎng)基：美國BD公司。

1.1.2　主要儀器

e2695高效液相色譜系統(tǒng)(配有2489UV/Vis Detector檢測器)，美國沃特世公司；5805CL臺式高速冷凍離心機，德國艾本德公司；Thermo Micro CL17高速離心機，美國賽默飛世爾科技公司；紫外可見分光光度計，優(yōu)尼柯（上海）儀器有限公司；CX31RTSF顯微鏡，日本OLYMPUS公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；恒溫?fù)u床，上海合恒儀器設(shè)備有限公司。

1.2　培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L、魚粉蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。

YNBP培養(yǎng)基：6.7 g/L的YNB、20 g/L的葡萄糖，瓊脂粉20 g/L，額外的分別加入0、0.04 g/L、0.05 g/L、0.06 g/L、0.07 g/L、0.08 g/L、0.09 g/L、0.1 g/L的對氟苯丙氨酸（PFP）。

酒精篩選培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基額外加入10%vol乙醇。

McClary生孢培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/L，KCl 1.8 g/L，NaAc 8.2 g/L，酵母提取物2.5 g/L，瓊脂20 g/L。

黃酒模擬液篩選培養(yǎng)基：1 kg蒸熟米飯（含水率為70%）中加入水1 L、麥曲0.05 kg，攪拌均勻，60℃保溫8 h，以4500 r/min離心5 min，取上清液以115℃滅菌15 min。

黃酒發(fā)酵培養(yǎng)基：蒸熟米飯（含水率為70%）50%，水40%，酒母5%，麥曲5%，攪拌均勻。

1.3　實驗方法

1.3.1　出發(fā)菌株生長曲線的確定

取200 μL甘油保藏釀酒酵母Y1615涂布YPD平板純化，再經(jīng)YPD平板和YPD搖瓶傳代復(fù)壯。

取5mL菌液接種100mLYPD搖瓶，以200r/min、30℃培養(yǎng)，每隔1 h測定OD600，確定出發(fā)菌株指數(shù)增長中期時間即是紫外誘變開始時間，做3個平行。

1.3.2　紫外照射時間的確定

按1.3.1方法獲得指數(shù)增長中期的誘變出發(fā)菌株菌液，取10 mL菌液以6000 r/min離心5 min，棄上清液，無菌生理鹽水洗滌后加50 mL無菌生理鹽水得菌懸液。

紫外燈開20 min以穩(wěn)定光波，取5 mL上述菌懸液到無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入滅菌大頭針。培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，垂直放置于紫外燈（15 W）以下20 cm處，黑暗條件下打開皿蓋，照射時間為40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s。

照射完畢后，在紅光燈下或者黑暗條件下，將誘變后菌懸液以10倍稀釋法稀釋4次，未經(jīng)紫外照射的菌懸液以10倍稀釋法稀釋5次，各取200 μL稀釋液涂布YPD平板，用錫紙包好，30℃倒置培養(yǎng)48 h，每組3個平行。

觀察記錄平板菌落數(shù)，計算致死率，繪制紫外照射致死率曲線，確定致死率為90%～100%的紫外照射時間。致死率=(對照菌落數(shù)-誘變菌落數(shù))/對照菌落數(shù)。

1.3.3　PFP對出發(fā)菌株最低全致死濃度確定

如1.3.1獲得出發(fā)菌株菌懸液，用10倍稀釋法稀釋4次，分別涂布200 μL到不同PFP濃度的YNBP平板上，每個梯度做3個平行。

30℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌落數(shù)后繪制PFP對出發(fā)菌株致死率曲線。

1.3.4　紫外誘變與PFP抗性、酒精耐受性篩選

如1.3.2中步驟獲得紫外誘變出發(fā)菌株并對其進行紫外照射，照射時間為140 s。取紫外誘變后菌懸液200 μL涂布到PFP濃度為0.12 g/L的YNBP平板，用錫紙包好以避光，10倍稀釋法每個稀釋梯度下3個平板，30℃培養(yǎng)72 h。

酒精耐受性篩選：挑取PFP抗性篩選后突變菌株，先在96孔板的YPD液體培養(yǎng)基上擴培，再接入96孔板的酒精篩選培養(yǎng)基，每株菌株接種量為5%，30℃培養(yǎng)，分別在12 h和24 h用酶標(biāo)儀測定OD600并篩選OD600數(shù)值相對較高的突變菌株。

1.3.5　黃酒模擬液發(fā)酵篩選

對氟苯丙氨酸抗性、酒精耐受性篩選后菌株經(jīng)YPD平板和YPD搖瓶復(fù)壯擴培，按5%接種量接到50 mL黃酒模擬液，30℃靜置發(fā)酵7 d，每株菌做3個平行。高效液相色譜法測定黃酒模擬液中β-苯乙醇含量，篩選β-苯乙醇含量相對較高的菌株。

1.3.6　雙倍體正菌株生孢純化

對數(shù)生長中期正突變菌株用生理鹽水重懸，菌懸液適度稀釋后涂布于McClary生孢培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)1～2 d。單菌落劃線到生孢培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～7 d，每隔24 h取樣用石炭酸復(fù)紅染色法觀察產(chǎn)孢情況，每次取3個視野，計算生孢率，生孢率達(dá)到90%時進行下一步實驗。

滅活雙倍體營養(yǎng)體：用pH7的磷酸鈉緩沖液洗滌含有子囊孢子和部分雙倍體菌體，65℃水浴加熱10 min，取樣涂布YPD平板以驗證雙倍體營養(yǎng)菌株是否完全滅活。

取滅活后菌液離心收集沉淀，加入1 mL的1.5%蝸牛酶和無菌玻璃珠，28℃下振蕩0.5～1 h，酶解子囊壁使單倍體分離。以5000 r/min離心5 min收集菌體，磷酸鈉緩沖液洗滌后混懸，梯度稀釋至10-1到10-5，每梯度取100 μL涂布YPD平板，30℃下培養(yǎng)1～2 d。

黃酒發(fā)酵篩選：取YPD平板上菌落較大的菌株進行黃酒發(fā)酵實驗，篩選正突變基因可穩(wěn)定遺傳的純合雙倍體菌株。黃酒前發(fā)酵5 d，后發(fā)酵15 d，結(jié)束后測定苯乙醇含量及其他理化指標(biāo)。

1.3.7　菌株傳代穩(wěn)定性實驗

將所篩選的生孢純化后純合雙倍體菌株在YPD培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)5代，每代進行黃酒發(fā)酵，測定β-苯乙醇含量及酒精產(chǎn)量。

1.3.8　高效液相色譜條件

取2 mL樣品12000 r/min離心1 min，取上清液1 mL過0.22 μm水系膜。XbridgeTM Amide 5μm(4.6×0.25 mm)色譜柱，流動相為甲醇∶水=1∶1，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1　野生菌株生長曲線和紫外照射致死率曲線（圖2、圖3）

圖2　出發(fā)菌株生長曲線

由圖2可知，野生酵母菌株200 r/min培養(yǎng)3 h后酵母OD600值明顯升高，酵母繁殖進入指數(shù)生長期，培養(yǎng)4 h時野生酵母菌株處于指數(shù)生長中期，因此以200 r/min培養(yǎng)4 h的酵母菌液作為誘變出發(fā)菌株進行紫外誘變。

圖3　紫外照射致死率曲線

由圖3可知，隨著紫外照射時間的增加，誘變出發(fā)菌株的致死率不斷增加，一般認(rèn)為致死率達(dá)到90%左右可篩選到變異幅度較大的正突變菌株[12]。照射時間為140 s時，致死率為90%以上，因此選擇紫外照射140 s作為紫外誘變照射時間。

2.2　對氟苯丙氨酸致死率曲線（圖4）

據(jù)Rafael報道，培養(yǎng)基中對氟苯丙氨酸濃度為5 mmol/L所篩選面包酵母的最低全部致死濃度[13]。據(jù)Akita報道，在含有0.5 mg/mL對氟苯丙氨酸的培養(yǎng)基中，正突變菌株分離效率為2.2×10-7，正突變菌株苯乙醇產(chǎn)量是野生菌株的12倍，達(dá)479 mg/L，因此選擇合適的底物類似物及合適篩選濃度對篩選效果至關(guān)重要[14]。

圖4　對氟苯丙氨酸對出發(fā)菌株致死率曲線

如圖4所示，將出發(fā)菌株涂布到PFP濃度為0.09 g/L的YNBP平板，幾乎沒有酵母菌株生長。紫外誘變后正突變菌株在0.09 g/L的YNBP平板上生長，為了保證篩選到高產(chǎn)β-苯乙醇的正突變菌株，將紫外誘變后菌懸液涂布到PFP濃度為0.2 g/L的YNBP平板。

表1　突變菌株酒精耐受性篩選

2.3　紫外誘變與對氟苯丙氨酸抗性、酒精耐受性篩選

紫外誘變后的菌懸液涂布到Y(jié)PD平板，經(jīng)對氟苯丙氨酸抗性篩選到526株菌株，在96孔板上酒精耐受性篩選，12 h和24 h時OD600數(shù)值相對較高的51株突變菌株，結(jié)果如表1所示，將51株突變菌株用于下一步黃酒模擬液篩選。

2.4　黃酒模擬液發(fā)酵篩選

將對氟苯丙氨酸抗性、酒精耐受性篩選后51株菌株經(jīng)黃酒模擬液發(fā)酵后測定β-苯乙醇含量。為提高篩選效率及保證篩選培養(yǎng)基的一致性，選用黃酒模擬液作為篩選培養(yǎng)基，以β-苯乙醇產(chǎn)量和酒精產(chǎn)量為篩選指標(biāo)（圖5）。如圖5所示，1-E4、4-C7、5-F5正突變菌株β-苯乙醇產(chǎn)量明顯高于出發(fā)菌株，其中5-F5菌株β-苯乙醇產(chǎn)量為237.16 mg/L，3株菌株酒精發(fā)酵能力未受明顯影響，釀酒酵母仍可良好進行酒精發(fā)酵，因此選擇β-苯乙醇產(chǎn)量較高的5-F5正突變菌株進行下一步生孢純化實驗。

2.5　雙倍體正菌株生孢純化（圖6、圖7）

本研究對紫外誘變后雙倍體菌株進行產(chǎn)孢處理，雙倍體細(xì)胞中同源染色體中突變基因會轉(zhuǎn)到單倍體孢子中，單倍體孢子再經(jīng)培養(yǎng)后成純合雙倍體菌株，正突變基因得以穩(wěn)定遺傳，正突變菌株遺傳穩(wěn)定性增強。

將正突變菌株5-F5產(chǎn)孢處理，圖6為子囊孢子和部分二倍體營養(yǎng)體形態(tài)。在平板上挑選菌落形態(tài)較大的8株菌株在黃酒發(fā)酵培養(yǎng)基中進行黃酒發(fā)酵實驗。為探究正突變菌株在黃酒雙邊發(fā)酵和復(fù)雜微生物環(huán)境中的β-苯乙醇產(chǎn)量和酒精發(fā)酵特性，相比于黃酒模擬液篩選培養(yǎng)基在黃酒發(fā)酵培養(yǎng)基中添加麥曲，也因此正突變菌株在兩種發(fā)酵體系下β-苯乙醇產(chǎn)量和酒精產(chǎn)量略顯不同。黃酒發(fā)酵結(jié)果顯示BYC-3菌株的β-苯乙醇產(chǎn)量是出發(fā)釀酒酵母的2.67倍，達(dá)到238.12 mg/L，產(chǎn)酒精能力均達(dá)到16%vol以上，酒精發(fā)酵性能與出發(fā)菌株相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.6　菌株傳代穩(wěn)定性實驗（表2）

將BYC-3菌株在YPD培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)5次，每代酵母菌株作為酒母進行黃酒發(fā)酵檢測β-苯乙醇和酒精含量變化，結(jié)果表明，傳代后菌株的酒精產(chǎn)量沒有顯著性差異（p＞0.05），β-苯乙醇產(chǎn)量穩(wěn)定，沒有顯著下降（p＞0.05），這為BYC-3菌株在工業(yè)中穩(wěn)定生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3　結(jié)論

圖5　突變菌株發(fā)酵模擬液中β-苯乙醇和酒精含量

圖6　正突變菌株子囊孢子和部分二倍體營養(yǎng)體顯微圖

圖7　產(chǎn)孢純化后雙倍體菌株β-苯乙醇和酒精產(chǎn)量

本研究以實驗室保藏菌株S.cerevisiaeRWBL Y1615 ZC為誘變出發(fā)菌株，由于菌株用于黃酒釀造工業(yè)，選用安全有效的紫外誘變，再進行底物類似物即對氟苯丙氨酸抗性篩選，紫外照射誘變時間為140 s，對氟苯丙氨酸對出發(fā)菌株的最低全致死濃度為0.09 g/L，為保證篩選效果以含有0.2 g/L對氟苯丙氨酸的YNBP平板為篩選平板，將篩選的526株菌株進行酒精耐受性篩選，最后將51株菌株進行黃酒模擬液篩選，得到β-苯乙醇產(chǎn)量明顯提高的3株正突變菌株；再將其中β-苯乙醇最高的正突變菌株5-F5進行產(chǎn)孢純化和篩選，正突變菌株遺傳穩(wěn)定性得以增強，正突變菌株BYC-3菌株β-苯乙醇產(chǎn)量達(dá)238.12 mg/L，是出發(fā)菌株的2.67倍，并且產(chǎn)酒精性能和出發(fā)菌株相比無顯著性差異，菌株傳代穩(wěn)定性好。

表2　傳代穩(wěn)定性實驗酒精和β-苯乙醇產(chǎn)量

本研究在不外源添加前體化合物情況下，篩選得到高產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)β-苯乙醇且酒精發(fā)酵性能優(yōu)良黃酒酵母BYC-3，對于發(fā)酵法提升黃酒風(fēng)味有重要意義，在釀酒工業(yè)特別是黃酒釀造工業(yè)中具有較高應(yīng)用價值。

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