楊雪梅　傅曉冬

1西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院（四川瀘州 611230）；2四川崇州市婦幼保健院（四川崇州 611280）

在全球范圍內，宮頸癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其致死率高居所有婦科系統(tǒng)腫瘤首位［1-3］。隨著早期診斷技術的發(fā)展及綜合治理手段的應用，宮頸癌的預后得到了顯著的改善［4-6］。然而，目前對于宮頸癌發(fā)生及進展的病理生理機制我們仍知之甚少。根據(jù)分子標志物的表達情況，實施有針對性的靶向治療也是極具潛力的治療方式。因此，進一步尋找宮頸癌中潛在的治療靶點，對于改善宮頸癌患者預后具有著極高的現(xiàn)實意義。

泛素羧基末端水解酶37（UCH37）是去泛素化酶家族成員，可與多種蛋白復合物相連，通過與蛋白酶體的相互作用，而去除與靶蛋白結合的泛素［7-8］。近年來，研究顯示UCH37在多種腫瘤中表達水平異常升高，并可作為診斷和預后的分子標注物［9-10］。然而，宮頸癌組織中UCH37的表達及其對宮頸癌細胞增殖的影響，尚無研究報道。本研究擬通過qRT?PCR技術檢測宮頸癌組織及癌旁組織中UCH37在的表達情況，并分析其臨床相關性。本研究首次證明了UCH37在宮頸癌組織中表達異常升高，并與宮頸癌患者FIGO分期密切相關。更為重要的是，UCH37可促進宮頸癌HeLa細胞增殖，抑制其凋亡，是潛在的治療靶點。

1　資料與方法

1.1一般資料收集在2013年1月至2015年12月期間西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產科接受宮頸癌根治術的67例患者腫瘤組織及配對癌旁組織標本。標本收取后凍于液氮中供后續(xù)提取RNA使用。入組患者在術后3個月后開始進行隨訪，隨訪截止時間點設定為患者因腫瘤復發(fā)死亡或至2016年12月31日。入組患者詳細臨床病理資料見表1。本研究已經西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核并批準，所有入組患者均親自簽署知情同意書，授權課題組使用其組織標本進行本項科學研究。

1.2方法

1.2.1RNA提取及反轉錄將液氮冷凍過的組織研磨成粉末狀，加入1 mL美國Sigma公司Trizol繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。12 000 r/min 4℃離心5 min，上清轉移至一新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。12 000 r/min 4℃離心15 min。吸上清液至一新的離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒15次，靜置10 min。12 000 r/min 4℃離心15 min。棄上清，75%的乙醇1 mL，12 000 r/min 4℃離心5 min。沉淀加入20 μL去離子水，即為所需RNA。反轉錄采用10 μL體系，RNA定量后，取1 μL RNA，加入2 μL日本TaKaRa公司5× PrimeScript RT master，7 μL去離子水。輕柔混勻后，進行反轉錄反應。反應條件為：37℃15 min，85℃ 5 s，4℃。

1.2.2qRT?PCR采用TaKaRa公司SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒進行實時定量PCR，首先配置PCR反應液，PCR反應采用25 μL體系，組分如下：12.5 μL SYBR premix Ex TaqⅡ，1 μL UCH37或β?actin正義鏈引物，1 μL UCH37或β?actin反義鏈引物，2 μL反轉錄產物，8.5 μL去離子水。PCR反應條件為：預變性 95℃ 30 s；擴增95℃ 15 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。反應結束后樣品保存于4℃。UCH37引物序列如下：正義鏈 5′?TGTCTCATG?GAAAGCGACCC?3′，反義鏈 5′?ACCACAACGGA?AACACG?3′；β?actin 引物序列如下：正義鏈 5′?CGTCTTCCCCTCCATCGT?3′？，反義鏈5′?GAAGGT?GTGGTGCCAGATTT?3′。 計算公式為：UCH37 相對表達量：2-ΔΔCt=2-（（CTUCH37-CTβ?actin）待測樣本–（CTUCH37-CTβ?actin）校準樣本）。

1.2.3細胞增殖轉染UCH37及UCH37 siRNAs 48 h至HeLa細胞，將轉染UCH37 NC的HeLa細胞命名為UCH37?NC組，將轉染UCH37 siRNA1的HeLa細胞命名為UCH37?siRNA1組，將轉染UCH37 siRNA2的HeLa細胞命名為UCH37?siRNA2組。各組細胞接種于96孔板中，每組細胞設置8個復孔。培養(yǎng) 24、48、72、96、120 h后取 96孔板加入CCK?8試劑，37℃孵育45 min后，將96孔板置于酶標儀450 nm波長檢測吸光度值，繪制細胞增殖曲線。

1.2.4細胞凋亡分組同1.2.3，制備細胞懸液，用5 mL PBS，1 000 r/min離心 5 min，反復洗滌3次后，棄上清；加入100 μL流式洗液和FITC標記的Annexin?V（20 μg/mL）10 μL，及PI（50 μg/mL）5 μL，避光反應20 min后，加入400 μL流式洗液，同時以加入FITC標記的Annexin?V及PI的同型對照抗體細胞作為同型對照。利用FACScan流式細胞儀檢測。

1.2.5細胞周期取分組同1.2.3。制備細胞懸液，用5 mL PBS，1 000 r/min離心5 min，反復洗滌3次后，棄上清；加入100 μL流式洗液及PI（50 μg/mL）5 μL，避光反應20 min后，加入400 μL流式洗液，同時以加入PI的同型對照抗體細胞作為同型對照。利用FACScan流式細胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學方法本研究均采用IBM SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以表示，利用t檢驗分析67例宮頸癌患者癌組織及癌旁組織中UCH37的表達差異，利用Spearman秩相關分析UCH37與宮頸癌患者臨床病理特征的相關性，利用方差分析及t檢驗分析UCH37?NC組與UCH37?siRNAs組增殖、凋亡和周期的差異，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1UCH37 mRNA在宮頸癌及癌旁組織中的表達差異qRT?PCR結果顯示，宮頸癌組織中UCH37表達水平為7.237±1.452，癌旁組織UCH37的表達水平為1.514±0.275。利用t檢驗分析67例宮頸癌患者癌組織及癌旁組織UCH37表達情況，發(fā)現(xiàn)兩者之間UCH37 mRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學意義（圖1，t=6.328，P=0.007），宮頸癌組織中UCH37 mRNA的表達水平高于癌旁組織。

2.2UCH37的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系以UCH37 mRNA表達水平的均數(shù)4.52為界限，將宮頸癌患者分為UCH37高表達組及UCH37低表達組，其中，UCH37高表達組患者例數(shù)為37例，UCH37低表達組例數(shù)為30例。利用Spearman秩相關分析UCH37表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的相關性。結果顯示：UCH37的表達水平與宮頸癌患者FIGO分期（P=0.032，表1）呈正相關，而與其他病理特征無顯著相關性（表1）。

表1　宮頸癌臨床病理特征與USP表達水平的關系Tab.1　The association between clinical features of cervical cancer and UCH37 mRNA expression 例

2.3UCH37對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響qRT?PCR結果顯示，轉染UCH?siRNAs的HeLa細胞中，UCH37的表達水平較轉染UCH?NC者顯著下調，兩條針對UCH37的siRNA均可顯著抑制HeLa細胞中UCH37的表達（圖2A，P＜0.05）。CCK?8實驗顯示，轉染UCH37?siRNAs的HeLa細胞增殖能力較轉染UCH37?NC組增殖能力顯著降低（圖2B，t=4.143，P=0.035）。以上結果提示，UCH37可促進宮頸癌HeLa細胞的增殖。

圖2　UCH37對HeLa細胞增殖的影響Fig.2　Effects of UCH37 on the proliferation of HeLa cells

2.4UCH37對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響轉染UCH37?siRNAs的HeLa細胞凋亡細胞（第2象限+第4象限）比例顯著高于轉染UCH37?NC組（圖3，t=5.768，P=0.014）。以上結果提示，沉默HeLa細胞中UCH37的表達可促進細胞凋亡。

2.5UCH37對宮頸癌HeLa細胞周期的影響轉染UCH37?siRNAs的HeLa細胞G1期細胞比例顯著高于轉染UCH37?NC組（圖3，P＜ 0.05），而S期細胞比例則顯著低于轉染UCH37?NC組（圖3，t=3.134，P=0.041），兩組G2期細胞比例無顯著差異。以上結果提示，沉默HeLa細胞中UCH37的表達可阻滯細胞周期于G1期。

3　討論

UCH37是去泛素化酶家族成員，可與多種蛋白復合物相結合而進一步發(fā)揮功能。其主要機制為通過與蛋白酶體相互作用，移除靶蛋白的泛素，使靶蛋白免于被泛素酶水解［7-8］。近年來，蛋白酶體的去泛素化酶已成為新興的抗癌靶點［11-12］。UCH37也被證實在多種腫瘤中表達異常上調，如卵巢上皮癌、肝細胞癌［9］和食管鱗狀上皮癌［10］。在這些腫瘤中，異常高表達的UCH37與腫瘤的惡性病理特征及不良預后密切相關。與這些研究相符，本研究結果顯示，UCH37在宮頸癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織。更為重要的是，UCH37表達水平與宮頸癌FIGO分期呈正相關，提示其可能參與宮頸癌的進展。

圖3　UCH37對HeLa細胞凋亡的影響Fig.3　Effects of UCH37 on the apoptosis of HeLa cells

圖4　UCH37對HeLa細胞周期的影響Fig.4　Effects of UCH37 on cell cycle of HeLa cells

UCH在腫瘤中發(fā)揮功能的方式主要通過與腫瘤發(fā)生及進展中的關鍵分子結合并移除其表面的泛素。如在肝細胞癌中，UCH37通過與RNA剪切的關鍵分子PRP19相結合，并使其去泛素化，從而促進肝細胞癌的侵襲及轉移［9］。另有研究表明，UCH37可移除E2啟動子區(qū)結合分子1（E2 promoter binding factor 1，E2F1）表面的賴氨酸-63連接的泛素，而促進其轉錄活化。此外，沉默UCH37的表達后，E2F1增殖相關的靶分子的表達水平亦相應降低，腫瘤的生長也受到顯著抑制。此外，沉默UCH37的表達后，可活化Caspase?9和Capase?3的表達，從而促進細胞凋亡。本研究結果顯示，沉默宮頸癌HeLa細胞中UCH37的表達后細胞增殖受到明顯抑制，而凋亡細胞比率則明顯增多，細胞周期被阻滯于G1期。以上研究及本研究結果提示，UCH37在腫瘤的增殖與凋亡中發(fā)揮著總要的調控作用。

綜上所述，本研究通過檢測宮頸癌組織及癌旁組織中UCH37 mRNA的表達水平及相關統(tǒng)計分析，初步證實了UCH37在宮頸癌組織中表達異常升高，并與宮頸癌患者FIGO分期密切相關。更為重要的是，UCH37可促進宮頸癌HeLa細胞增殖，抑制其凋亡。本研究結果提示UCH37在宮頸癌為潛在的致癌分子，是潛在的治療靶點。

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