李立軍　海米提·阿布都艾尼　宗強(qiáng)　王帥　王亮　倪東馗

1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科（天津 300211）；2濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科（山東濱州 264100）

周圍神經(jīng)損傷的治療到目前為止仍然是困擾醫(yī)學(xué)界的難題，局部應(yīng)用外源性神經(jīng)生長因子（NGF）治療周圍神經(jīng)損傷取得了一定的臨床效果［1-2］，目前多采用局部注射、局部浸潤等方法，但是應(yīng)用外源性的NGF存在局部藥物無法濃集、過早失活、穿透血神經(jīng)屏障［3］困難的缺點。本研究通過制備磁性納米載藥微粒，裝載外源性NGF，在外磁場的引導(dǎo)下應(yīng)用于坐骨神經(jīng)損傷大鼠，利用磁性納米微粒的跨膜特性、磁場下趨向性，探索這一新方法治療周圍神經(jīng)損傷的有效性。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器健康SD大鼠，60只，雌雄不限，體質(zhì)量（280± 10）g，購自天津市奧臣實驗動物銷售有限公司。鼠神經(jīng)生長因子（mNGF，未名生物工程生物醫(yī)藥有限公司），聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，德國贏創(chuàng)集團(tuán)），磁性氧化鐵顆粒，小鼠神經(jīng)生長因子ELISA試劑盒（天津福瑞祥科技有限公司），尼高力Viking Quest肌電誘發(fā)電位儀，1.0T磁場。

1.2磁性納米載NGF粒子的制備、表征采用單乳化溶劑蒸發(fā)法（O/W），取200 mg PLGA室溫下溶于500 μL二氯甲烷（有機(jī)相），加入16 mL鐵磁性鐵顆粒，形成褐色溶液（試管1）。取18 μg的mNGF放在500 μL的水中（水相），用攪拌器攪拌1 min（試管2），在細(xì)胞粉碎機(jī)里將試管1溶液緩慢加到試管2里，并加入到5 mL 0.5%CHA溶液里，凝固納米粒子的表面，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去二氯甲烷，離心30 min（離心轉(zhuǎn)速9 000 r/min），制備的樣品在4℃下冷凍干燥24 h，制成納米粒子凍干粉。激光粒度分析儀測量粒子粒徑。用酶標(biāo)儀繪制產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定包封率（EE，%），測定載藥量（DL，%），由ELISA法計算磁性納米mNGF粒子釋放量，測定釋藥率。

1.3大鼠坐骨神經(jīng)模型制備及分組10%水合氯醛腹腔麻醉（0.30 mL/100 g），大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺，常規(guī)備皮、消毒左下肢，無菌條件下取左大腿后上部切口，顯露坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣1 cm橫行銳性切斷坐骨神經(jīng)，在神經(jīng)斷端的近、遠(yuǎn)端，環(huán)形剝離神經(jīng)外膜并切除1.0 mm長的神經(jīng)束，吻合口神經(jīng)外膜行間斷外翻縫合，使神經(jīng)斷端留有2.0 mm的小間隙。

60只大鼠分3組：A、B組每周尾靜脈注射1次磁性納米NGF微粒懸浮液，A組左下肢外磁場引導(dǎo)2 h，B組不施加外磁場；C組每周僅尾靜脈注射同含量的NGF溶液。

1.4術(shù)后8周坐骨神經(jīng)指數(shù)（SFI）測定大鼠雙后爪涂上碳素墨水，置于自制的大鼠足印行走箱中，得到相應(yīng)足印。測其雙后跟到第3趾尖的距離（PL）、第一趾到第五趾的距離（TS）以及第二趾到第四趾的距離（ITS），根據(jù)公式計算SFI［4］。

1.5術(shù)后8周神經(jīng)電生理檢查大鼠麻醉后，沿原左下肢切口切開，暴露左坐骨神經(jīng)，將記錄電極刺入腓腸肌肌腹，接地電極置于大鼠尾部皮膚表面，依次將刺激電極置于夾傷處近、遠(yuǎn)側(cè)坐骨神經(jīng)干，刺激神經(jīng)，記錄復(fù)合肌動作電位（compound muscle action potentials，CMAPs）。測量CMAPs的傳導(dǎo)速度。

1.6小腿三頭肌濕重比測量、坐骨神經(jīng)組織學(xué)觀察處死大鼠，切取雙側(cè)小腿三頭肌，測重，計算傷肢與健肢小腿三頭肌濕重比。完整切取左側(cè)坐骨神經(jīng)，沿神經(jīng)縱軸切片，HE染色。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，實驗結(jié)果以表示，各組間比較分別采用Kruskai Wallis檢驗、單因素方差分析、卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1磁性納米粒子表征磁性納米粒子粒徑分布在198～210 nm里，平均粒徑為205.9 nm，大小均勻，粒徑集中，具有良好的分散性。封包率為69.43%，載藥量為3.11%。生長因子在溶液中是持續(xù)釋放，108 h內(nèi)釋放率為92%。

2.2SFI測定術(shù)后8周A組SFI值為（-34.91±7.86）；B組SFI值為（-56.97± 10.29）；C組SFI值為（-61.68±9.56），A組分別與B組和C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　術(shù)后2個月坐骨神經(jīng)指數(shù)測定Tab.1　SFI in two months after surgery ±s

表1　術(shù)后2個月坐骨神經(jīng)指數(shù)測定Tab.1　SFI in two months after surgery ±s

注：a，Kruskai Wallis檢驗，兩兩比較，A組與B組P=0.000，A組與C組P=0.000，B組與C組P=0.12

因素A組B組C組均值-34.91±7.86-56.97±10.29-61.68±9.56 χ2值36.62 P值0.000a

2.3神經(jīng)電生理檢測術(shù)后8周，A組大鼠左坐骨神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)速度（31.00±3.30）m/s＞B組（21.30±4.79）m/s和C組（23.15±4.53）m/s。A組分別與B組和C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2　術(shù)后2個月CMAPs傳導(dǎo)速度測定Tab.2　Nerve conduction velocity two months after surgery±s，m/s

表2　術(shù)后2個月CMAPs傳導(dǎo)速度測定Tab.2　Nerve conduction velocity two months after surgery±s，m/s

注：b，單因素方差分析，兩兩比較，A組與B組P=0.000，A組與C組P=0.000，B組與C組P=0.236

因素A組B組C組均值31.0±5.3 23.2±4.5 21.3±4.8 χ2值22.22 P值0.000b

2.4小腿三頭肌濕重比測定術(shù)后8周傷側(cè)小腿三頭肌均發(fā)生不同程度的萎縮，A組肌肉濕重比值為0.51±0.09），B組為0.41±0.06，C組為0.39±0.06。A組分別與B組和C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），B組與C組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3　術(shù)后2個月小腿三頭肌濕重比測定Tab.3　Quality ratio of triceps surae two months after surgery

2.5坐骨神經(jīng)組織學(xué)觀察坐骨神經(jīng)沿神經(jīng)長軸切片HE染色，B、C兩組可以看到神經(jīng)原吻合處再生神經(jīng)纖維排列紊亂、神經(jīng)纖維密度較低，A組再生的神經(jīng)纖維通過吻合處，排列較整齊，神經(jīng)纖維密度高于其他兩組。見圖1。

3　討論

圖1　藥物制備、實驗及組織HE染色圖Fig.1　Drug preparation experimental and tissue HE staining

本研究所制備磁性納米粒子，采用PLGA為包覆材料，包裹Fe3O4和mNGF，采用單乳化溶劑蒸發(fā)法制備殼核式結(jié)構(gòu)的納米微粒［6］，平均粒徑較小，粒徑均勻，性質(zhì)穩(wěn)定。所用PLGA由2種單體——乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料［7-8］。PLGA為外殼的納米微粒具有良好的緩釋作用，起到保護(hù)裝載藥物，避免體內(nèi)過早失活的作用，因而可以實現(xiàn)局部的持續(xù)緩慢釋藥，保證持續(xù)的藥物濃度。此外，PLGA本身具有良好的生物相容性，有一定的跨生物膜屏障作用［9］，因而有助于外源性NGF跨過血-神經(jīng)屏障，到達(dá)神經(jīng)軸突再生處，增加微環(huán)境中的NGF濃度，從而促進(jìn)再生軸突的生長［10］。

實驗動物組每周1次尾靜脈注射磁性納米NGF微粒，通過1.0 T外界磁場引導(dǎo)，術(shù)后8周測得的CAMP及SFI結(jié)果均好于其他兩組。磁性納米粒子在外磁場下具有良好的聚集性，相比未施加外部磁場的實驗組，雖經(jīng)尾靜脈注射相同劑量的納米粒子懸浮液，但施加外部磁場的實驗動物坐骨神經(jīng)損傷周圍納米粒子的濃度更高。經(jīng)過外磁場一定時間的吸引，磁性微球的大量聚集使血流減慢，從而提高了顆粒的滯留，可能使更多的載體血管外滲出發(fā)生。這樣，微球起到了血管外藥物貯存站的作用。通過磁場的引導(dǎo)作用，可以實現(xiàn)靶向控制釋藥，增加局部的藥物濃度，從而改善周圍神經(jīng)損傷微環(huán)境中的NGF濃度，促進(jìn)神經(jīng)再生。也有國外學(xué)者制備微泵向神經(jīng)斷端緩慢釋放的方法提高NGF的療效［11］，但體內(nèi)埋入的微泵易導(dǎo)致感染且操作相對較復(fù)雜，在臨床難以應(yīng)用。

目前，PLGA已廣泛應(yīng)用于制藥工程，載藥制備技術(shù)成熟，PLGA與mNGF結(jié)合，有助于進(jìn)一步提高藥物治療的效果，便于將來進(jìn)一步向臨床推廣。應(yīng)用外部磁場引導(dǎo)磁性納米載NGF微粒實現(xiàn)磁靶向給藥，實際上是借鑒其他疾病的靶向治療方法［12］。采用磁靶向治療的方法來傳遞外源性NGF，磁場既可以準(zhǔn)確引導(dǎo)藥物的聚集，同時適宜的磁場環(huán)境也有助于神經(jīng)恢復(fù)［13］。本實驗開創(chuàng)性的將磁靶向結(jié)合納米載藥技術(shù)應(yīng)用到周圍神經(jīng)損傷的治療，為周圍神經(jīng)損傷的治療提供了一個新思路，但真正要應(yīng)用到周圍神經(jīng)損傷的臨床治療，路還很漫長。

［1］ALOE L.Rita Levi?Montalcini：the discovery of nerve growth factor and modern neurobiology［J］.Trends Cell Biol，2004，14（7）：395?399.

［2］李立軍，時宇博，宗強(qiáng)，等.局部應(yīng)用明膠海綿浸潤鼠神經(jīng)生長因子治療周圍神經(jīng)損傷［J］.中國組織工程研究，2015，19（30）：4827?4831.

［3］KANDA T.Blood?nerve barrier and peripheral nerve regenera?tion［J］.Rinsho Shinkeigaku，2013，53（11）：1120?1122.

［4］QIU T，YIN Y，LI B，et al.PDLLA/PRGD/b?TCP conduits build the neurotrophin?rich microenvironment suppressing the oxidative stress and promoting the sciatic nerve regeneration［J］.J Biomed Mater Res，2014，102（10）：3734?3743.

［5］劉舉，馮世慶，高仕杰，等.外磁場下磁性納米C3轉(zhuǎn)移酶載體在大鼠損傷脊髓中的分布［J］.中國脊柱脊髓雜志，2012，22（3）：265?271.

［6］PANG X，CHU C C.Synthesis，characterization and biodegra?dation of functionalized amino acid?based poly（ester amide）s［J］.Biomaterials，2010，31（14）：3745?3754.

［7］榮子杰，楊聯(lián)軍，張贊杰，等.載ADM?PLGA微球的納米羥基磷灰石／膠原支架修復(fù)兔骨缺損的實驗研究［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（22）：3559?3562.

［8］MYKHAYLYK O，CHERCHENKO A，ILKIN A，et al.Glial brain tumor targeting of magnetite nanoparticles in rats［J］.J Magn Magn Mater，2001，225：241?247.

［9］HOYNG S A，DE WINTER F，GNAVI S，et al.A comparative morphological，electrophysiological and functional analysis of axon regeneration through peripheral nerve autografts genetical?ly modified to overexpress BDNF，CNTF，GDNF，NGF，NT3 or VEGF［J］.Exp Neurol，2014，261：578?593.

［10］MCCALLISTER W V，TANG P，SMITH J，et al.Axonal regen?eration stimulated by the combination of nerve growth factor and ciliary neurotrophic factor in an end?to?side model［J］.J Hand Surg Am，2001，26（3）：478?488.

［11］LIAO Z，WANG H，LV R，et al.Polymeric liposomes?coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles as contrast agent for targeted magnetic resonance imaging of cancer cells［J］.Lang?muir，2011，27（6）：3100?3105.

［12］劉鐘陽，劉靚，黃景輝，等.復(fù)合雪旺細(xì)胞的神經(jīng)組織工程材料聯(lián)合脈沖電磁場促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的再生［J］.中華骨科雜志，2016，36（8）：465?478.