梁家寶　李浪　賀文慨

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟病研究所（南寧 530021）

冠脈微栓塞（coronary microembolization，CME）是由于粥樣斑塊的損傷或破裂引起的一種病理現(xiàn)象，常常出現(xiàn)于急性冠脈綜合征的患者中，也是經(jīng)皮靜脈支架術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）的常見的并發(fā)癥［1-2］。有研究［3］已經(jīng)證明，CME能引發(fā)心功能障礙、惡性心律失常和心梗。同時(shí)現(xiàn)有的研究［4］表明，CME致心肌損傷使心肌凋亡增加。因此，抗凋亡被認(rèn)為是減輕CME致心肌損傷的重要治療手段。大蒜素主要來自于大蒜中，其主要成分為一種有機(jī)化合物——二烯丙基三硫化物（DATS）［5］。公認(rèn)DATS可以用來預(yù)防和治療多種疾病，目前多個(gè)研究［6］證實(shí)了其在抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗糖尿病及抗氧化等方面的作用。但是DATS是否能夠減輕CME所致的心肌凋亡以及相關(guān)機(jī)制仍未闡明。在本次研究中，首次發(fā)現(xiàn)大蒜素預(yù)處理能夠減輕大鼠CME后的心肌細(xì)胞凋亡，并首次探討了大蒜素預(yù)防CME致心肌凋亡的可能分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑42 μm微栓塞球凍干粉（2×107個(gè)/g）（挪威Dynal公司）；DATS（深圳Minn Bolin Biotechnology有限責(zé)任公司）；兔抗鼠Akt、兔抗鼠Caspase?3單克隆抗體、兔抗鼠GAPDH單克隆抗體以及熒光山羊抗兔二抗（CST公司）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（日本Takara公司）；cTnI ELISA試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立本研究于2016年12月開始，至2017年3月結(jié)束。首先取體重量200～250 g的成年SPF級(jí)SD大鼠共30只，雌雄不拘，隨機(jī)分為單純栓塞組（CME組）、大蒜素預(yù)處理組（DATS組）和假手術(shù)組（Sham組），每組各10只大鼠，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物模型的建立參考自以往文獻(xiàn)［7］，簡而言之，首先腹腔注射（10%水合氯醛2.5 mL/kg）麻醉大鼠，經(jīng)口迅速插入氣管導(dǎo)管，將氣管導(dǎo)管連接動(dòng)物呼吸機(jī)，觀察大鼠胸廓起伏，確保氣管導(dǎo)管已正確插入氣管。然后逐層開胸暴露心臟及大血管，血管鉗夾緊主動(dòng)脈根部，經(jīng)注射器由心尖部迅速注射微球0.1 mL（3× 104個(gè)/mL）至左心室，同時(shí)夾閉主動(dòng)脈10 s，呼吸、心率正常后逐層關(guān)胸，待恢復(fù)自主呼吸后拔脫導(dǎo)管。另以等量生理鹽水替代微球行左室注射的10只大鼠為假手術(shù)組（Sham組）。DATS組術(shù)前連續(xù) 7 d 給予 DATS 40 mg/（kg·d）腹腔注射。術(shù)后所有動(dòng)物常規(guī)注射青霉素預(yù)防感染，術(shù)后6 h超聲檢查結(jié)束后處死大鼠并取材。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重和心率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

1.2.2大鼠心功能的檢測(cè)分別于術(shù)后6 h檢測(cè)大鼠心功能（LVEF、CO、FS和LVEDd），使用S12探頭，探頭頻率為12 MHz每只大鼠重復(fù)測(cè)量3次，取其平均值。所有超聲檢查均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的心臟超聲科醫(yī)生完成。

1.2.3切片制備檢測(cè)心功能后，經(jīng)腹腔注入5 mL 10%水合氯醛麻醉大鼠，立即開胸取出心臟，去除心耳、心房，將心室分為左室心肌部和右室心肌部。左室心肌部用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，用于實(shí)時(shí)定量PCR與Western blot；右室心肌部用4%多聚甲醛固定，固定12 h后再予石蠟包埋，而后切片。采用光學(xué)顯微鏡觀察HE染色后CME后心肌細(xì)胞狀態(tài)，并予TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR定量測(cè)定Akt和Caspase?3的mRNA表達(dá)取左心室心肌組織200 mg，按照Trizol試劑盒操作說明書指示操作，提取總RNA，用Nanodrop測(cè)量其濃度，再按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；用SYB?RGREENI法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)的特異性引物均由日本Takara公司合成：Caspase?3：上游：5′?GCAGCAGCCTCAAATTGTTGAC?3′，下游：5′?TGCTCCGGCTCAAACCATC?3′；Akt：上游：5′?TC ATTGAGCGCACCTTCCAT ?3′，下游5′?TTCTGCAG?GACACGGTTCTC?3′；GAPDH：上游：5′?GAGATTA CTGCCCTGGCTCCTA?3′，下游：5′?CATCGTA?CT CCTGCTTGCTGAT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)40次。

1.2.5TUNEL染色染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡按試劑盒說明書操作，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光，則為TUNEL陽性。隨機(jī)選取共10個(gè)非重疊的200高倍鏡視野，計(jì)算凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，使用凋亡率計(jì)算公式：心肌細(xì)胞凋亡率=調(diào)亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%算得心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測(cè)Akt和 Caspase?3 表達(dá)取心室肌組織500 mg，放置于液氮中研磨，移至EP管中，加入蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑的混合液，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液用BCA發(fā)檢測(cè)蛋白濃度，將不同樣本的蛋白濃度調(diào)至統(tǒng)一濃度5 μg/μL。配置10%分離膠和5%濃縮膠，每孔加樣10 μL，聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒流半干法轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉TBST緩沖液封閉1 h，分別置于Akt、Caspase?3的1∶1 000一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后用相應(yīng)的1∶10 000熒光二抗孵育1 h；Odyssey熒光掃膜儀掃膜；最后，用ImageJ v1.36測(cè)量條帶灰度值。

1.2.7ELISA檢測(cè)cTnI水平取術(shù)后6 h大鼠的血清，靜置30 min后5 000 r/min離心15 min，取其上清液并移至EP管中4℃保存，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)大鼠的cTnI水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD?t，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DATS對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈微栓塞心功能的影響與Sham組比較，CME組與DATS組LVEF、CO和FS顯著下降，LVEDd顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與CME組比較，DATS組LVEF、CO和FS顯著上升，LVEDd顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　各組大鼠心功能比較Tab.1　Comparison of cardiac function of rats in each group±s

表1　各組大鼠心功能比較Tab.1　Comparison of cardiac function of rats in each group±s

注：與Sham比較，aP ＜0.05；與CME組比較，bP ＜0.05；LVEF：左心射血分?jǐn)?shù)；FS：左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)；LVEDd：左室舒張末期內(nèi)徑；CO：心排出量

組別Sham組CME組DATS組LVEF（%）85.21±2.52 52.43±1.77a 71.44±3.20ab FS（%）40.32±2.56 35.25±3.20a 41.64±1.57ab LVEDd（mm）5.10±2.33 6.05±1.12a 5.18±1.87ab CO（L/min）0.164±0.005 0.102±0.003a 0.157±0.009ab

2.2HE染色結(jié)果HE染色顯示微球周圍心肌細(xì)胞核溶解或消失，周邊細(xì)胞水腫、變性，周圍炎性細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出。見圖1。

圖1　CME組局部心肌微梗死灶（HE，×200），箭頭示微球Fig.1　CME group of local myocardial micro?infarction（HE，× 200）and the arrow shows microspheres

2.3心肌細(xì)胞凋亡情況凋亡心肌細(xì)胞TUNEL染色細(xì)胞核發(fā)綠色熒光（TUNEL陽性），正常細(xì)胞核不發(fā)綠色熒光。Sham組、CME組及DATS組心肌細(xì)胞凋亡率分別為（0.36± 0.10）%、（8.77±2.03）%及（3.85±1.17）%。與Sham組相比，CME組與DATS組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增高（P＜0.05）；與CME組相比，DATS組心肌細(xì)胞凋亡率顯著減?。≒＜0.05）。見圖2。

圖2　各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡（TUNEL）Fig.2　Apoptosis of rat cardiomyocytes（TUNEL）

2.4各組大鼠心肌Akt和Caspase?3 mRNA表達(dá)水平比較與Sham組比較，CME組與DATS組Akt mRNA表達(dá)水降低，Caspase?3 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與CME組比較，DATS組Akt mRNA表達(dá)水平升高，Caspase?3 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組大鼠心肌Akt、Caspase?3 mRNA表達(dá)水平比較Tab.2　Comparison of expression levels of Akt and Caspase?3 mRNA in myocardium of rats in each group　±s

表2　各組大鼠心肌Akt、Caspase?3 mRNA表達(dá)水平比較Tab.2　Comparison of expression levels of Akt and Caspase?3 mRNA in myocardium of rats in each group　±s

注：與Sham組比較，aP＜0.05；與CME組比較，bP＜0.05

組別Sham組CME組DATS組只數(shù)10 10 10 Akt 0.79±0.07 0.24±0.03a 0.51±0.12ab Caspase?3 0.03±0.01 0.89±0.21a 0.60±0.08ab

2.5各組大鼠心肌Akt和Caspase?3蛋白表達(dá)水平比較與Sham組比較，CME組與DATS組Akt蛋白表達(dá)水降低，Caspase?3蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與CME組比較，DATS組Akt蛋白表達(dá)水平升高，Caspase?3蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、4。

2.6各組大鼠血清cTnI表達(dá)水平比較與Sham組比較，CME組與DATS組血清cTnI［（0.30 ± 0.015）μg/Lvs.（0.06± 0.002）μg/L］表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與CME組比較，DATS組血清cTnI（0.20 ± 0.012 μg/L）表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

CME可見于急性冠脈綜合征的患者中，也是PCI過程中常見的并發(fā)癥。研究［8］表明，CME可引起短暫的“慢血流”或“無血流”，并可伴隨著反應(yīng)性充血和心肌收縮功能障礙的發(fā)生。CME被認(rèn)為是急性心肌梗死患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良和病死率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

圖3　各組大鼠心肌Caspase?3蛋白表達(dá)水平比較Fig.3　Comparison of expression of Caspase?3 protein in myocardium of rats in each group

圖4　各組大鼠心肌Akt蛋白表達(dá)水平比較Fig.4　Comparison of Akt protein expression in myocardium of rats in each group

CME發(fā)生后，局部心肌會(huì)出現(xiàn)微梗死灶，心肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)壞死和凋亡，心功能呈進(jìn)行性下降［9］。已有研究［10］證明，凋亡是CME致心肌損傷中重要的病理過程，而抗凋亡治療能夠明顯地改善大鼠心功能。在筆者的前期實(shí)驗(yàn)中，在6 h內(nèi)CME后心肌凋亡達(dá)到高峰［11］。因此，本研究觀察時(shí)間點(diǎn)選取為CME后6 h。

大蒜素是一種具有多種生物活性的二烯丙基三硫化物，是從大蒜中提取出來的復(fù)合物，已經(jīng)用于治療細(xì)菌感染、糖尿病和心血管疾病多年［12］。CHEN等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能夠保護(hù)乙醇所致的氧化應(yīng)激，并且可以通過抑制凋亡因子Bax和上調(diào)抗凋亡因子Bcl2從而減輕硫化氫介導(dǎo)的凋亡。XU等［14］發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠清除神經(jīng)細(xì)胞的氧自由基，并且通過激活Nrf2/HO?1通路抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。在缺血再灌注方面，有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠激活沉默信號(hào)調(diào)節(jié)因子1，從而減輕糖尿病小鼠的心肌缺血再灌注損傷［15］。本研究證實(shí)，與Sham組相比，CME 6 h后心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，心功能下降，與之相反的是，腹腔注射大蒜素則可顯著改善心功能，同時(shí)減輕CME所致心肌細(xì)胞凋亡。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷，這可能是大蒜素改善CME預(yù)后的重要機(jī)制之一。

Akt在抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用［16］。磷酸化的Akt不僅能使糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，而喪失誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；而且還能夠抑制促凋亡相關(guān)蛋白Caspases的合成，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用［17］。Caspases家族的激活是凋亡過程中的不可或缺的重要步驟［18］。Caspases家族中的Caspase?3則是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)的反應(yīng)的必經(jīng)步驟，同時(shí)是細(xì)胞凋亡的最重要的蛋白酶［19］。其中，Caspase?9 也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到應(yīng)激時(shí)，上游Caspase?9發(fā)生蛋白酶水解反應(yīng)，激活下游Caspase?3，最終引起細(xì)胞的凋亡［20-21］。筆者在早期研究中發(fā)現(xiàn)，CME后Caspase?9介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑顯著激活，并參與CME后的心肌損傷［9］。大量研究證實(shí)，Caspase?3與心肌梗死密切相關(guān)，抑制Caspase?3的表達(dá)可以明顯降低缺血所致的心肌凋亡和顯著地改善心功能。本研究結(jié)果顯示，與CME組比較，DATS組可顯著抑制CME后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡的激活，其主要的表現(xiàn)是激活A(yù)kt的磷酸化活性，減少Caspase?3蛋白的活化，心臟超聲參數(shù)FS、CO、LVEF和LVEDd和心肌酶cTnI相比于CME組得到明顯改善。提示大蒜素能夠減少CME后的心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能的作用，與Akt的激活有關(guān)。當(dāng)然大蒜素減輕CME致心肌凋亡的更多的信號(hào)通路仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究完善。

綜上所述，大蒜素預(yù)處理可明顯減少CME后心肌細(xì)胞凋亡并改善心功能，其機(jī)制可能是通過激活A(yù)kt從而阻斷心肌細(xì)胞Caspase?3介導(dǎo)的死亡受體凋亡途徑的激活。PCI術(shù)前預(yù)防性應(yīng)用大蒜素，可能可以改善患者預(yù)后。

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