徐本玲　周進(jìn)學(xué)　袁龍　陳廣玉　韓露　秦鵬　高全立

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1生物免疫治療中心，2肝膽科，3普外科（鄭州450008）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是人類常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)的病死率中結(jié)直腸癌處于第3位［1］。由于生活方式的轉(zhuǎn)變，近年我國(guó)結(jié)直腸癌總體發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。雖然，CRC的診斷和治療均取得了較快的發(fā)展，CRC的治療仍然以外科手術(shù)為主，然而許多患者因早期癥狀不明顯，就診時(shí)已屬中晚期，預(yù)后較差。研究表明，炎癥相關(guān)的腫瘤微環(huán)境與CRC患者較好的預(yù)后相關(guān)，因此對(duì)于CRC患者來(lái)說(shuō)，免疫治療可能成為一種有效的新的治療方法。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。ROSENBERG等［2］利用TIL聯(lián)合全身放化療治療惡性黑色素瘤，將其臨床反應(yīng)率提高到70%，明顯延長(zhǎng)了患者的生存期，獲得了令人振奮的結(jié)果。研究［2-4］表明，惡性黑色素瘤患者對(duì)TIL的臨床反應(yīng)率與TIL細(xì)胞中記憶細(xì)胞的表達(dá)，及TIL在回輸后能夠在體內(nèi)存在的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。AKT抑制劑能夠增加惡性黑素瘤患者TIL中記憶細(xì)胞的數(shù)量及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的持久性［5］，但AKT抑制劑對(duì)TIL培養(yǎng)過(guò)程中免疫因素的影響尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

鑒于上述原因，本研究通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)AKT抑制劑對(duì)CRC肝轉(zhuǎn)移患者TIL增殖，分化及功能的影響，旨在探討一種有效增強(qiáng)TIL細(xì)胞功能及延長(zhǎng)其在體內(nèi)存在的培養(yǎng)體系，從而為肝癌臨床治療提供新的思路及方法。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2016年1月至2016年12月入住鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科行手術(shù)的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的組織標(biāo)本。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，標(biāo)本采集均征得患者本人同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1試劑重組人IL?2為山東泉港藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，RetroNectin，GT?T551無(wú)血清培養(yǎng)基（人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基），CD3MAb均為北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，抗 PD?1?FITC，抗 CD4?PerCP?cy5.5，抗CD4?FITC，抗Tim?3?PE，抗CD3?PEcy7，抗CD8?PerCP?cy5.5，抗 CD45RA?FITC，抗 CCR7?PEcy7，抗 CD25?APC，抗 FOXP3?PE，抗 Ki?67?PE，購(gòu)自美國(guó)BIOLENG公司，抗IFN?γ?APC為eBiosci?ence產(chǎn)品。Elisa試劑盒（IFN?γ，IL?10，TNF?α）購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.2.2腫瘤組織的收集患者簽署知情同意書后，于手術(shù)當(dāng)中將切下的腫瘤組織放到事先準(zhǔn)備好的含有慶大霉素（900 IU/mL），青霉素（500 IU/mL）和鏈霉素（500 μg/mL）的GTT?551無(wú)血清培養(yǎng)基中，立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.3TIL及腫瘤單細(xì)胞懸液的分離將腫瘤組織剪切成1～2 mm3的組織碎塊，放入事先配好的胰蛋白酶混合液中（含膠原酶Ⅰ1 μg/mL，膠原酶Ⅳ1 μg/mL，DNase 25 μg/mL，含2%的胎牛血清），然后將細(xì)胞放入自動(dòng)旋轉(zhuǎn)儀上，置于37℃培養(yǎng)箱中，每30 min觀察1次，根據(jù)組織的消化情況，終止反應(yīng)（加入胎牛血清，其終濃度為5%）。采用不同percoll密度進(jìn)行梯度離心，收集40%percoll表面的腫瘤細(xì)胞，放入事先準(zhǔn)備好的凍存液中（含80%的DMSO和10%人AB血漿和10%1640培養(yǎng)液），立即放入-80℃低溫冰箱備用。取40%和70%percoll中間白膜層的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，分成IL?2組（6 000 IU/mL）和AKT組（培養(yǎng)過(guò)程中加入1 μmol/mL 的AKT抑制劑和6 000 IU/mL的IL?2）進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)情況，進(jìn)行傳代并計(jì)數(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)至第10天，兩組均加入抗CD3抗體，繼續(xù)原培養(yǎng)液培養(yǎng)20 d。

1.2.4細(xì)胞增殖活性的測(cè)定每3天抽取培養(yǎng)孔中的TIL細(xì)胞1 mL，混勻，用胎盤藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算平均值，根據(jù)細(xì)胞增殖倍數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5細(xì)胞表型測(cè)定流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)AKT抑制劑對(duì)TIL的數(shù)量、組成和比例的影響。每5天每組取2×106的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。分別吸取相應(yīng)的熒光標(biāo)記的特異性抗體各5 μL加入流式管，混合均勻，置于冰上避光孵育20 min。同時(shí)設(shè)各熒光減一同型對(duì)照管做對(duì)照。加2 mL FACS（含5%牛血清白蛋白和0.09%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液）洗滌，離心棄上清后，300 μL的FACS重懸細(xì)胞，渦旋混勻，避光待上機(jī)分析。細(xì)胞中IFN?γ（anti?IFN?γ?APC，eBioscience），F(xiàn)oxp3，Ki?67 的檢測(cè)按照胞內(nèi)染色說(shuō)明書進(jìn)行。應(yīng)用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，記錄陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.2.6細(xì)胞因子的測(cè)定在培養(yǎng)過(guò)程中的第5、10、15、20、25、30天分別取培養(yǎng)兩組的TIL細(xì)胞3 mL，以1 × 106/孔接種24孔板，培養(yǎng)24 h，收集上清檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況。操作嚴(yán)格按Elisa試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.7細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌IFN?γ能力的檢測(cè)取培養(yǎng)第25天的TIL和經(jīng)射線輻照過(guò)的自體腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)6 h，加入自體腫瘤細(xì)胞后2 h加入BFA，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，胞內(nèi)染色法比較兩組分泌IFN?γ細(xì)胞的差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述。組間比較采用t檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1TIL細(xì)胞的增殖活性從結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織中能夠成功培養(yǎng)出TIL細(xì)胞。筆者首先分析了AKT抑制劑對(duì)TIL細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示：IL?2組與AKT抑制劑組（AKTi組）相比，抗CD3抗體刺激前（第5、10天）和刺激后（第15、20、25、30天）各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)均無(wú)明顯差異，見圖1A。

圖1　IL?2組與AKTi組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與PD?1+Tim?3+細(xì)胞的比較Fig.1　The growth curve and the expression of PD?1+Tim?3+on CD8+T cells in group IL?2 and AKTi

2.2TIL細(xì)胞的免疫表型PD?1及Tim?3共表達(dá)是T細(xì)胞耗竭的標(biāo)志。動(dòng)態(tài)檢測(cè)AKT抑制劑對(duì)TIL的免疫表型結(jié)果顯示：PD?1+Tim?3+的細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比例在培養(yǎng)過(guò)程中先降低，在抗CD3抗體刺激后出現(xiàn)短暫上升，進(jìn)而逐漸降低，但兩組間比較并無(wú)明顯差異。筆者的結(jié)果提示在培養(yǎng)過(guò)程中加入AKT抑制劑并沒有增加PD?1+Tim?3+細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比例見圖1B。統(tǒng)計(jì)分析兩組調(diào)節(jié)T細(xì)胞CD4+CD25+Foxp3+占CD3+T細(xì)胞的比例，結(jié)果亦無(wú)明顯差異。

從培養(yǎng)的第5天起，AKT抑制劑組CD8+T細(xì)胞上中心記憶T細(xì)胞（Tcm，CCR7+CD45RA-）的比例明顯增高（13.98%vs.9.14%，P＜0.05），這種趨勢(shì)一直持續(xù)到抗CD3抗體刺激后。培養(yǎng)至第25天（抗CD3抗體刺激后第15天）時(shí)，AKT抑制劑組CD8+T細(xì)胞上中心記憶T細(xì)胞（Tcm）的比例最高，見圖2。

2.3TIL細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的含量分別取各組培養(yǎng)第5、10、15、20、25和30天的培養(yǎng)上清，用Elisa細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒進(jìn)行 IFN?γ，TNF?α和IL?10的檢測(cè)。結(jié)果顯示，IFN?γ和TNF?α隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，分泌量逐漸升高，且AKT抑制劑組IFN?γ的分泌量明顯高于IL?2組。IL?10的分泌量雖亦逐漸增加，但兩組比較無(wú)明顯差異，見圖3。

圖2　IL?2組與AKTi組細(xì)胞Tcm的比較Fig.2　The expression of Tcm on CD8+T cells in group IL?2 and AKTi

圖3　IL?2組與AKTi組不同時(shí)間點(diǎn)IFN?γ,TNF?α及IL?10的分泌情況Fig.3　The secretion profile of IFN?γ,TNF?α and IL?10 on CD8+T cells at different time point in group IL?2 and AKTi

2.4細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌IFN?γ能力的檢測(cè)因?yàn)榕囵B(yǎng)第25天時(shí)，細(xì)胞的數(shù)量及Tcm的含量均較高，進(jìn)而我們?nèi)∨囵B(yǎng)第25天的TIL細(xì)胞用自體腫瘤細(xì)胞檢測(cè)了TIL中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌IFN?γ能力的差異。結(jié)果顯示：AKT抑制劑組分泌IFN?γ的細(xì)胞的比例明顯高于IL?2組（P＜ 0.05），代表性的流式圖見圖4。

圖4　自體腫瘤細(xì)胞刺激兩組TIL中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌IFN?γ能力的代表性的流式圖Fig.4　A representative flow diagram of IFN?gamma stimulated by auto?tumor cells in cytotoxic T lymphocyte of TIL in group IL?2 and AKTi

3　討論

TIL治療的臨床反應(yīng)率與TIL細(xì)胞中記憶細(xì)胞的表達(dá)，及其回輸后在體內(nèi)存在的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。越來(lái)越多的研究結(jié)果提示如果回輸?shù)腡IL中含有較多的記憶細(xì)胞，會(huì)延長(zhǎng)TIL回輸后在體內(nèi)的存活率，進(jìn)而提高其治療效率［6］。這一觀點(diǎn)進(jìn)一步在小鼠動(dòng)物模型中得到證實(shí)，隨著TIL細(xì)胞逐漸分化成終末分化的T細(xì)胞，其抗腫瘤功能及在體內(nèi)持續(xù)存在的能力均減低［7］。因此，如果能夠提高TIL中免疫記憶細(xì)胞的數(shù)量，可能會(huì)增強(qiáng)TIL的抗腫瘤免疫效能，成為進(jìn)展期腫瘤的有效治療手段。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在CD8+T細(xì)胞分化及記憶形成中發(fā)揮重要作用。AKT信號(hào)的丟失或減弱不會(huì)影響T細(xì)胞的增殖及活性，但會(huì)導(dǎo)致已分化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄重排，使效應(yīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成記憶細(xì)胞［8］。本研究結(jié)果也表明從結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中分離的浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程中加入AKT抑制劑，無(wú)論是在抗CD3抗體刺激前還是在抗CD3抗體刺激后，CD8+T淋巴細(xì)胞上的Tcm均高于IL?2組。由于過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的效果，不僅取決于回輸?shù)募?xì)胞的質(zhì)量，而且回輸?shù)募?xì)胞的數(shù)量也非常重要。因此，本研究還對(duì)AKT抑制劑對(duì)TIL的增殖能力的影響進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，兩組TIL的增殖能力并無(wú)明顯差異。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的AKT抑制劑在增加惡性黑色素瘤浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞中記憶細(xì)胞的擴(kuò)增而并不影響其增殖能力的結(jié)果一致［5］。

PD?1不僅是細(xì)胞活化的標(biāo)志，還是細(xì)胞免疫因子，當(dāng)PD?1和Tim?3共表達(dá)時(shí)，往往提示細(xì)胞的功能障礙［10］。筆者進(jìn)一步分析了AKT抑制劑對(duì)TIL細(xì)胞免疫表型的影響，結(jié)果顯示：PD?1+Tim?3+細(xì)胞的比例在抗CD3抗體刺激前逐漸降低，刺激后短暫升高，繼而又逐漸減低，但兩組比較并無(wú)明顯差異。這可能是因?yàn)槟[瘤組織中CD8+T細(xì)胞的PD?1+Tim?3+表達(dá)較高，但由于體外培養(yǎng)過(guò)程中脫離了腫瘤的微環(huán)境，比例逐漸下降，但在抗CD3抗體刺激后出現(xiàn)短暫升高繼而下降的趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程的趨勢(shì)一致［9］。調(diào)節(jié)T細(xì)胞的結(jié)果顯示，AKT抑制劑的加入并未增加抑制性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的數(shù)量。對(duì)比兩組培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌結(jié)果顯示：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，IFN?γ的分泌量逐漸升高，且AKT抑制劑組明顯高于IL?2組。IL?10最初被認(rèn)為是具有免疫抑制作用的抗炎分子，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)IL?10還具有免疫活化作用，可以通過(guò)對(duì)T細(xì)胞的免疫活化作用促進(jìn)腫瘤特異性免疫監(jiān)視并減少致病性炎癥反應(yīng)的發(fā)生［11］。本研究結(jié)果顯示IL?10及TNF?α隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，這與MESIANO等［12］最近報(bào)道的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CIK細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的變化一致。進(jìn)而筆者用自體腫瘤細(xì)胞刺激檢測(cè)TIL中分泌IFN?γ的細(xì)胞，結(jié)果顯示AKT抑制劑組分泌IFN?γ的細(xì)胞明顯高于IL?2組，這與上清中檢測(cè)到的結(jié)果一致。

綜上所述，在傳統(tǒng)培養(yǎng)TIL的體系中加入AKT抑制劑，能夠增加其中心記憶T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)其分泌IFN?γ的能力，且并不影響TIL的增殖，并未增加免疫抑制因子的數(shù)量，為TIL細(xì)胞的臨床安全應(yīng)用提供了很好的借鑒。

［1］ZHOU G，SPRENGERS D，BOOR P P C，et al.Antibodies against immune checkpoint molecules restore functions of tumor?infiltrating T cells in hepatocellular carcinomas［J］.Gastroenter?ology，2017，153（4）：1107-1119.

［2］ROSENBERG S A，YANG J C，SHERRY R M，et al.Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastat?ic melanoma using T?cell transfer immunotherapy［J］.Clin Can?cer Res，2011，17（13）：4550?4557.

［3］RADVANYI L G，BERNATCHEZ C，ZHANG M，et al.Specif?ic lymphocyte subsets predict response to adoptive cell therapy using expanded autologous tumor?infiltrating lymphocytes in metastatic melanoma patients［J］.Clin Cancer Res，2012，18（24）：6758?6770.

［4］CHANDRAN S S，SOMERVILLE R P T，YANG J C，et al.Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour?infiltrating lymphocytes：a single?centre，two?stage，single?arm，phase 2 study［J］.Lancet Oncol，2017，18（6）：792?802.

［5］CROMPTON J G，SUKUMAR M，ROYCHOUDHURI R，et al.Akt inhibition enhances expansion of potent tumor?specific lym?phocytes with memory cell characteristics［J］.Cancer Res，2015，75（2）：296?305.

［6］KLEBANOFF C A，GATTINONI L，PALMER D C，et al.De?terminants of successful CD8+T?cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice［J］.Clin Cancer Res，2011，17（16）：5343?5352.

［7］BAITSCH L，BAUMGAERTNER P，DEVEVRE E，et al.Ex?haustion of tumor?specific CD8 T cells in metastases from mela?noma patients［J］.J Clin Invest，2011，121（6）：2350?2360.

［8］MACINTYRE A N，F(xiàn)INLAY D，PRESTON G，et al.Protein kinase B controls transcriptional programs that direct cytotoxic T cell fate but is dispensable for T cell metabolism［J］.Immu?nity，2011，34（2）：224?236.

［9］ZHANG L，WANG J，WEI F，et al.Profling the dynamic ex?pression of checkpoint molecules on cytokine?induced killer cells from non?small?cell lung cancer patients［J］.Oncotar?get，2016，7（28）：43604?43615.

［10］XU B L，YUAN L，GAO Q L，et al.Circulating and tumor?in?filtrating tim ?3 in patients with colorectal cancer［J］.Oncotar?get，2015，6（24）：20592?20603.

［11］王佳麗，劉麗華.IL?10對(duì)腫瘤免疫雙向調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2016，23（1）：130?134.

［12］MESIANO G，ZINI R，MONTAGNER G，et al.Analytic and Dynamic secretory Profile of Patient?Derived Cytokine?induced Killer Cells［J］.Mol Med，2017，23：235?246.