袁榮霞，李堅，金君，汪毅

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科，2.中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212001）

胸腔積液是多種疾病導(dǎo)致的胸膜腔液體滲出增多或回吸收障礙引起的臨床綜合征［1］，可分為良性和惡性。惡性胸腔積液主要由肺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的胸膜轉(zhuǎn)移或惡性胸膜間皮瘤所致［2－4］。腫瘤發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移形成惡性胸腔積液后，加重患者的臨床癥狀及惡病質(zhì)狀態(tài)，預(yù)后不佳，盡早診斷和治療可改善預(yù)后［5－6］。因此，良性和惡性胸腔積液的早期鑒別診斷極為重要。

惡性胸腔積液診斷的金標(biāo)準(zhǔn)包括胸腔積液脫落細(xì)胞檢查、胸膜活檢和胸腔鏡活檢病理檢查［7］。但胸腔積液脫落細(xì)胞檢查和胸膜活檢的陽性率均較低，為40%～60%［8］。雖然胸腔鏡檢查陽性率高，但創(chuàng)傷性大、費用高，臨床難以廣泛開展應(yīng)用［9］。胸腔積液腫瘤標(biāo)志物檢測用于惡性胸腔積液的診斷一直是人們的關(guān)注點［6，10－11］。與其他腫瘤標(biāo)志物相比，癌胚抗原診斷惡性胸腔積液具有較高的敏感度，但特異度不夠理想［7－8］。因此，探尋新的高敏感度和高特異度的腫瘤標(biāo)志物用于惡性胸腔積液的診斷很有必要。

由于microRNAs存在于血清、尿液、胸腔積液等體液中，易于獲取且具有較好的穩(wěn)定性，近年來被廣泛用于惡性腫瘤的診斷［12］。多項研究表明，miR-21、miR-29c和miR-182在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、直腸癌、胃癌和食管癌等患者的癌組織或血漿中的表達與對應(yīng)的癌旁組織及健康對照者血漿相比有顯著差異［13－18］，故有可能成為新的腫瘤生物標(biāo)志物。上述3種microRNAs在良惡性胸腔積液中的表達尚不清楚，因此，我們通過分析65例惡性胸腔積液標(biāo)本和61例良性胸腔積液標(biāo)本中miR-21、miR-29c和miR-182表達水平的差異，探討其在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的意義。

1　病例與方法

1.1　研究對象

選取2015年4月至2017年6月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、重癥監(jiān)護室和急診科住院治療的惡性胸腔積液患者65例，其中肺腺癌36例，肺鱗癌18例，小細(xì)胞肺癌5例，肺混合細(xì)胞癌1例，惡性胸膜間皮瘤1例，黏液纖維肉瘤、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌各1例。男42例，女23例，年齡38～93歲，平均69歲。所有患者均為初診初治患者，原發(fā)腫瘤均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，胸腔積液的性質(zhì)均由脫落細(xì)胞檢查或胸膜活檢病理檢查明確。另選擇同期住院的良性胸腔積液患者61例，其中結(jié)核性胸膜炎39例，肺炎旁胸腔積液10例，心功能不全8例，膿胸2例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及乳糜胸各1例。男45例，女16例，年齡19～98歲，平均62歲。所有患者亦為初診患者，原發(fā)疾病均符合該疾病最新診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時選取20例健康者的血漿標(biāo)本作為實驗microRNA對照（樣本microRNA校正值），其中男13例，女7例，年齡25～47歲，平均32歲。本研究符合人體試驗倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者在受試前簽署知情同意書。

1.2　實驗方法

1.2.1主要試劑及儀器 Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司；PCR引物購自廣州銳博生物公司；MyCycler PCR儀為美國BioRad公司產(chǎn)品；Mx3000P實時熒光定量PCR儀為美國Stratagene公司產(chǎn)品。

1.2.2標(biāo)本處理 收集入組對象的胸腔積液標(biāo)本200 mL，分裝于含EDTA抗凝劑的試管中，留取10 mL送本院核醫(yī)學(xué)科檢測癌胚抗原；其余標(biāo)本于半小時內(nèi)以1 000×g離心5 min，棄上清液；加入等量紅細(xì)胞裂解液，500×g離心5 min，棄上清液；最后加4 mL PBS，1 000×g離心洗滌5 min，棄上清液；加入1 mL Trizol，于－80℃保存待用。

1.2.3RNA提取 取“1.2.2”處理后的標(biāo)本，解凍后加入200μL氯仿，震蕩，12 000 r／min離心15 min；吸取上層水相至EP管中，加入異丙醇沉淀水相中的總RNA；用75%乙醇洗滌2次，可見羽毛狀沉淀物；完全干燥后加入焦碳酸二乙酯處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的DEPC水溶解。用分光光度計測定RNA純度［D（260 nm）／D（280 nm）］在1.8～2.0之間，濃度在200～300 ng／mL之間。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄 將1μg RNA和2μL反轉(zhuǎn)錄引物工作液混合，加入DEPC水配制成11μL體系，離心混勻；70℃加熱10 min，冰浴2 min。然后加入5×緩沖液5μL、反轉(zhuǎn)錄酶1μL以及無RNA酶的水8 μL，瞬時離心，避免產(chǎn)生氣泡。于反轉(zhuǎn)錄儀設(shè)置如下反應(yīng)程序：42℃60 min，70℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5實時熒光定量 PCR（RT-PCR）檢測 miR-21、miR-29c和miR-182的表達 選取U6作為內(nèi)參基因。加入cDNA 2μL，熒光染料9μL，miRNA正向引物0.8μL，反向引物 0.8μL，熒光校正液Ⅱ0.4 μL，無RNA酶的水7μL配制20μL體系（此步操作在冰上進行）?；靹?，按照95℃預(yù)變性20 s；95℃變性10 s，60℃延伸20 s，進行40個循環(huán)。每個標(biāo)本的每個基因重復(fù)測定3次，并設(shè)置空白對照。收集每個標(biāo)本中U6、miR-21、miR-29c和miR-182的Ct值，用2－△△Ct方法計算各個 microRNA的相對表達量。

1.3　統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或近似t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積（AUC），確定臨界值，進而計算敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確度。

2　結(jié)果

2.1　良惡性胸腔積液中miR-21、miR-29c和miR-182的表達

與良性胸腔積液相比，惡性胸腔積液中miR-21和 miR-182相對表達水平明顯增高（t＝4.231，t′＝3.738，P均 ＜0.05），miR-29c表達水平明顯降低（t′＝4.46，P＜0.05）。見圖1。

2.2　miR-21、miR-29c、miR-182和癌胚抗原診斷惡性胸腔積液的比較

ROC曲線顯示，miR-21、miR-29c和miR-182診斷惡性胸腔積液的 AUC值分別為0.873（SE＝0.033，95%CI：0.808～0.939）、0.856（SE＝0.034，95%CI：0.790～0.920）和 0.841（SE＝0.036，95%CI：0.772～0.911），均高于癌胚抗原診斷惡性胸腔積液的 AUC值（0.822，SE＝0.043，95%CI：0.703～0.873）。聯(lián)合檢測 miR-21、miR-29c和 miR-182診斷惡性胸腔積液的 AUC值為0.949（SE＝0.021，95%CI：0.908～0.989）；聯(lián)合 miR-21、miR-29c、miR-182和癌胚抗原檢測診斷惡性胸腔積液的AUC值為0.986（SE＝0.007，95%CI：0.972～1.000），均高于單獨檢測的AUC值（圖2）。

根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果分別取 0.193、0.036、0.008 96和 6.5作為 miR-21、miR-29c、miR-182和癌胚抗原診斷惡性胸腔積液的臨界值，計算其單獨及聯(lián)合診斷惡性胸腔積液的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度，具體結(jié)果見表1。

圖1　m iR-21、m iR-29c和m iR-182在胸腔積液中的表達

圖2　m iR-21、m iR-29c、m iR-182和癌胚抗原的ROC曲線

3　討論

microRNAs可于翻譯水平抑制靶mRNAs，調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的表達，從而參與腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移。其中，體液microRNAs被外泌體包裹，在低溫、強酸和強堿等惡劣環(huán)境下可穩(wěn)定存在［19］。Erbes等［20］發(fā)現(xiàn)檢測尿液中 miR-155、miR-21、miR-125b、miR-2451的表達水平可作為乳腺癌篩查的非侵入性檢查方法。另發(fā)現(xiàn)，檢測血漿中miR-20a、miR-145、miR-21、miR-223和 miR-221對于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的早期診斷具有較高準(zhǔn)確性［21］。

表1　胸腔積液中m iR-21、m iR-29c、m iR-182和癌胚抗原的檢測對惡性胸腔積液的診斷效果　%

體內(nèi)和體外實驗均顯示Ras癌基因通過兩個下游信號通路上調(diào)細(xì)胞miR-21的表達，表明miR-21在Ras誘導(dǎo)的癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要作用［22］。Le等［23］報道肺癌患者血清miR-21水平明顯高于健康者，并且患者術(shù)后血清miR-21水平明顯低于術(shù)前，提示血清miR-21不僅可用于肺癌的診斷，還可作為監(jiān)測肺癌患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。另有研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血漿中miR-21表達水平明顯高于健康者，且表達水平與腫瘤TNM分期顯著相關(guān)；其中接受含鉑類藥物化療獲得部分緩解的ⅢB和Ⅳ期患者血漿miR-21水平較獲得穩(wěn)定和進展的患者血漿miR-21水平低數(shù)倍之多，提示血漿miR-21既可作為NSCLC診斷的標(biāo)志物，亦可用于預(yù)測NSCLC患者對含鉑類方案的化療療效［24］。沉默miR-182的表達可致轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中SMAD7的表達上調(diào)，從而抑制TGF誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤侵襲，表明miR-182是參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的 TGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要組成部分［25］。Wang等［26］報告胃癌患者血漿中miR-21和miR-182的表達水平明顯高于健康者，且二者高表達與患者的生存時間呈負(fù)相關(guān)，體外實驗證明miR-182高表達可促進胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。上述研究結(jié)果表明，miR-21和miR-182參與腫瘤的發(fā)生、增殖及轉(zhuǎn)移，其在血液中的表達可作為腫瘤診斷的標(biāo)志物。本研究顯示，miR-21和miR-182在惡性胸腔積液中的表達明顯高于良性胸腔積液；此外，miR-21、miR-182診斷惡性胸腔積液的AUC值高于經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原，且敏感度及特異度均優(yōu)于癌胚抗原，與李威等［27］的研究結(jié)果基本吻合。由此表明，miR-21和miR-182可作為診斷惡性胸腔積液的生物標(biāo)志物。

Chen等［28］研究發(fā)現(xiàn)miR-29c是p53的下游靶基因，并證明PH樣結(jié)構(gòu)域家族成員2（PHLDB2）是miR-29c的關(guān)鍵靶基因，p53通過促進miR-29c的表達下調(diào)PHLDB2，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，提示miR-29c在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到抑癌基因的作用。Xu等［29］研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌患者血清miR-29c表達明顯低于健康對照者，表明測定血清miR-29c可作為食管鱗癌的無創(chuàng)篩選工具。然而Zhu等［30］報道，miR-29c在早期 NSCLC患者的腫瘤組織及血清中的表達分別高于對應(yīng)的癌旁組織和健康者的血清，診斷敏感度及特異度高于血清癌胚抗原，提示血清miR-29c有可能作為診斷早期NSCLC的生物標(biāo)志物。本研究顯示miR-29c在惡性胸腔積液中的表達水平明顯低于良性胸腔積液，且其診斷惡性胸腔積液的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度亦優(yōu)于癌胚抗原。本結(jié)果與Xu等研究結(jié)果相似，而與Zhu等結(jié)果相異，其原因尚不清楚，分析可能因素如下：研究對象種族的不同，腫瘤類型的差別，檢測標(biāo)本不同等。由于本研究中NSCLC所致惡性胸腔積液占了入組病例的大多數(shù)，胸腔積液miR-29c測定結(jié)果與Zhu等不同，具體有待進一步研究。

此外，本研究證實聯(lián)合檢測胸腔積液miR-21、miR-29c和miR-182診斷惡性胸腔積液的敏感度和特異度優(yōu)于3項指標(biāo)的單獨檢測，三者與癌胚抗原聯(lián)合測定可進一步提高診斷惡性胸腔積液的效能，表明聯(lián)合檢測胸腔積液中這些腫瘤標(biāo)志物對于鑒別診斷良惡性胸腔積液具有更顯著的價值。這與Zhu等［31］聯(lián)合檢測NSCLC患者血清miR-182和癌胚抗原可提高診斷效果的研究結(jié)果相似。

因此，胸腔積液miR-21、miR-29c和miR-182有可能成為新的腫瘤標(biāo)志物用于惡性胸腔積液的臨床診斷。

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