凌銳，周玲，周月鵬，毛朝明，陳德玉

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.腫瘤研究中心，2.核醫(yī)學(xué)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001）

食管鱗癌易早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5年生存率僅為 20% ～40%［1－2］。我們早前實驗證實［3］，食管鱗癌進(jìn)程與異?；罨腤nt信號密切相關(guān)。Wnt信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子Wnt1誘導(dǎo)分泌蛋白-1（Wnt1 induced secreted protein-1，WISP-1）通過αvβ3／FAK／c-Src、Ras和 NF-κB等信號通路，活化VEGF、MMP2及MMP9等蛋白表達(dá)，調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)程［3－5］。本研究探討在食管鱗癌中WISP-1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力獲得之間的聯(lián)系以及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　細(xì)胞、試劑與儀器

人食管癌Eca109、TE-8細(xì)胞株購于上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所細(xì)胞庫；食管正常上皮細(xì)胞Het-1a購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco公司）；兔抗人 MMP2、MMP9、VEGF-A、VEGF-C、WISP-1抗體（武漢博士德公司），鼠抗人β-肌動蛋白、HRP標(biāo)記的 IgG、兔抗人 NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα（Cell Signaling Technology公司）；脂質(zhì)體 Lipo2000（上海英駿生物技術(shù)有限公司）；WISP-1 siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒（大連TaKaRa公司）；WISP-1和GAPDH引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司）；核酸測定儀 Biomate 3s及 Pierce ECL plus Substrate（Thermo Fisher Scientific公司）；Mx3000p實時定量PCR擴(kuò)增儀（Stratagene公司）。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Eca109、TE-8和 Het-1a細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期再進(jìn)行傳代或者后續(xù)實驗。

1.2.2熒光實時定量PCR檢測WISP-1表達(dá)水平提取RNA后通過核酸測定儀確認(rèn)其D（260 nm）／D（280 nm）在1.8～2.0之間，隨后設(shè)置反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 s，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA。引物序列如下：WISP-1上游引物 5′-CTCAGCAGCTTGGGGACAAC-3′，下游引物 5′-GATGCCTCTGGCTGGTACAC-3′；GAPDH上游引物 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物 5′-TCCACCACCCTGTTGC TGTA-3′。反應(yīng)條件：95℃2 min預(yù)變性；95℃15 s變性，60℃20 s退火／延伸，共40個循環(huán)。最終采用2－△△Ct法計算WISP-1的mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3轉(zhuǎn)染實驗 轉(zhuǎn)染前1天，接種5×105個細(xì)胞／孔至60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞達(dá)到50%～70%后分別設(shè)置空白對照組、陰性對照組（空載體組）以及WISP-1 siRNA組。WISP-1 siRNA序列為5′-GACAUCCAUACACUCAUUATT-3′， 5′-UAAUGAGUG UAUGGAUGUCTT-3′；空載體序列為5′-UUCTCCGAACGUGCUCACGUTT-3′，5′-ACCUGACACGUUC GGAGAATT-3′。將1 mL Lipo2000混合不同siRNA或者等體積緩沖液加入預(yù)留的2 mL純RPMI-1640培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h。之后更換含有血清的普通培養(yǎng)基，分別轉(zhuǎn)染24 h、48 h后提取RNA或者蛋白質(zhì)以進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測WISP-1 siRNA處理后食管癌細(xì)胞株的凋亡取轉(zhuǎn)染后Eca109和TE-8細(xì)胞，消化離心種于60 mm皿中，調(diào)整細(xì)胞密度為4.5×105個／皿。0.25%胰蛋白酶（不含 EDTA）消化、收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×105個／管，先加入5 μL的Annexin V-FITC避光孵育15 min，上機(jī)前加入10μL的PI混合，每管加入400μL的PBS通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡比例。

1.2.5CCK-8實驗檢測WISP-1 siRNA處理后細(xì)胞增殖能力 取轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長的食管鱗癌Eca109和TE-8細(xì)胞，消化離心后以6 000個／孔種入96孔板內(nèi)，設(shè)定WISP-1 siRNA處理組、空白對照組和陰性對照組（每組5個復(fù)孔）。置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h、48 h和72 h，于每孔加入10μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，450 nm檢測各組樣品的光密度，并計算抑制率。

1.2.6Transwell實驗檢測 WISP-1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力 用WISP-1 siRNA轉(zhuǎn)染Eca109和TE-8細(xì)胞24 h后，消化離心重懸將2×105個細(xì)胞用無胎牛血清的培養(yǎng)基重懸接種在24孔板的Transwell（孔徑為8μm）上室中，下室中加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基。48 h后，將Transwell小室取出，用0.1%的結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行拍攝（200倍），統(tǒng)計每個視野的平均細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞 WISP-1、MMP、VEGF及NF-κB相關(guān)蛋白 上述不同處理組的細(xì)胞于48 h后提取總蛋白，測定蛋白質(zhì)濃度以確保每個加樣孔中加入基本等量的總蛋白。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%BSA封閉 1 h，分別加MMP2抗體（1∶200）、MMP9抗體（1∶500）、VEGF-A抗體（1∶500）、VEGF-C抗體（1∶400）、WISP-1抗體（1∶400），β-肌動蛋白、NF-κB、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα均為1∶1 000，置于4℃中孵育過夜；TBST洗膜8 min×5次后，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。TBST再次洗膜8 min×5次，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，于成像系統(tǒng)曝光并記錄結(jié)果；相關(guān)實驗至少重復(fù)3次。

1.2.8ELISA實驗檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF-C及MMP9的含量 分別收集空白對照組、陰性對照組和WISP-1 siRNA處理組Eca109和TE-8細(xì)胞培養(yǎng)上清液各2 mL，1 000 r／min離心 20 min，隨后根據(jù)ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）操作說明，分別使用酶標(biāo)儀在450 nm和490 nm處測量VEGF-C及MMP9的濃度。

1.3　統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　WISP-1在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)

實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，與食管正常上皮細(xì)胞Het-1a比較，食管鱗癌Eca109及TE-8細(xì)胞中WISP-1的 mRNA顯著上調(diào)（P＜0.05，圖1），經(jīng)WISP-1 siRNA干擾后，WISP-1的mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)（圖2）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果進(jìn)一步驗證了WISP-1蛋白表達(dá)的變化。

圖1　W ISP-1在食管鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)

圖2　熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測W ISP-1 siRNA干擾效果

2.2　下調(diào)WISP-1抑制食管鱗癌細(xì)胞的活性

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在食管鱗癌Eca109、TE-8細(xì)胞中下調(diào)WISP-1均未引起顯著的凋亡率上升，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）；CCK8檢測發(fā)現(xiàn)，下調(diào)WISP-1可顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖活性（P＜0.05或 P＜0.01，圖4）。

圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測食管癌細(xì)胞株早期凋亡結(jié)果

圖4　CCK 8檢測各組食管癌細(xì)胞增殖能力

2.3　下調(diào)WISP-1抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲能力

Transwell實驗顯示，下調(diào)WISP-1可以顯著地抑制Eca109和TE-8細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.05，圖5）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證實，下調(diào)WISP-1可明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞 VEGF-C、MMP9蛋白的表達(dá)，而VEGF-A和MMP2蛋白與對照組差異不明顯（圖6）；ELISA結(jié)果表明，下調(diào) WISP-1后，Eca109、TE-8細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF-C、MMP9外泌量較對照組出現(xiàn)了明顯下降（P＜0.05，圖7）。

圖5　Transwell法檢測各組食管癌細(xì)胞侵襲能力

圖6　蛋白質(zhì)印跡檢測食管癌細(xì)胞中VEGF-A、VEGF-C、MMP2和MMP9的表達(dá)

2.4　下調(diào)WISP-1抑制NF-κB信號通路的活化

與空白對照組細(xì)胞相比，下調(diào)WISP-1表達(dá)均可以抑制食管鱗癌Eca109及TE-8細(xì)胞NF-κB-p65的磷酸化并促進(jìn) IκBα蛋白的磷酸化進(jìn)程；對總的NF-κB-p65和 IκBα蛋白表達(dá)無明顯影響（圖8）。

3　討論

在我國，食管癌以鱗狀細(xì)胞癌為主，其發(fā)病率位居全部腫瘤類型的第5位。目前認(rèn)為，食管鱗癌的發(fā)展多涉及部分關(guān)鍵信號通路的過度活化和MMPs、VEGF蛋白的異常表達(dá)，探討食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移過程及其分子機(jī)制具有重要的臨床意義。目前的研究主要集中在 Wnt、Notch、PI3K／Akt和 NF-κB通路，其中，NF-κB信號通路的異?；罨c多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，例如調(diào)控包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、VEGF、MMP2、MMP9等基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、脈管新生、侵襲和轉(zhuǎn)移，因此對影響NF-κB信號異?；罨嚓P(guān)因素的研究顯得十分必要［6－9］。

圖7　酶聯(lián)免疫吸附法測定各組食管癌細(xì)胞中VEGF-C、MMP9分泌量

圖8　蛋白質(zhì)印跡檢測食管癌細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

近來研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路存在著受其他通路的調(diào)控因子作用而活化的機(jī)制，從而形成復(fù)雜的共刺激信號網(wǎng)絡(luò)，例如Wnt通路中的WISP-1［5］。WIPS-1屬于結(jié)締組織生長因子（CTGF）家族，參與許多細(xì)胞過程，包括增殖、分化、凋亡、遷移等。研究證實在口腔鱗狀細(xì)胞癌［4］、前列腺癌［10］、骨肉瘤［5］等中均有WISP-1的高表達(dá)，并且其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等存在著密切聯(lián)系。

本研究證實，在食管鱗癌細(xì)胞中WISP-1蛋白的表達(dá)明顯高于正常的食管上皮細(xì)胞；干擾Eca109和TE-8細(xì)胞的WISP-1表達(dá)后，抑制了食管鱗癌細(xì)胞持續(xù)增殖的能力，而對早期凋亡發(fā)生沒有顯著的影響。食管鱗癌組織中異常表達(dá)的WISP-1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生緊密相關(guān)［11－12］。本研究中，下調(diào)WISP-1后，Transwell實驗結(jié)果證實食管鱗癌細(xì)胞的侵襲能力受到了顯著抑制，同時與侵襲、淋巴管新生能力直接相關(guān)的MMP9和VEGF-C蛋白生成及外泌量均明顯下降。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，下調(diào)WISP-1表達(dá)可以抑制NF-κB-p65的磷酸化進(jìn)程同時促進(jìn)p-IκBα形成，進(jìn)而阻止NF-κB信號的持續(xù)異常激活，初步證實了食管鱗癌中WISP-1可能參與NF-κB信號的活化。

綜上所述，WISP-1可通過影響NF-κB通路活化，促進(jìn)增殖、侵襲相關(guān)蛋白及因子的表達(dá)和分泌，在食管鱗癌信號通路共刺激調(diào)控、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

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