王曉麗，金躍，劉鷺，張凱，楊乃全

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第二人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.心臟內(nèi)科，江蘇淮安223002）

下肢動(dòng)脈疾?。╬eripheral arterial disease，PAD）在2型糖尿病患者常見，常常是預(yù)后不好的標(biāo)志［1－2］。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）功能受損在小鼠血管新生功能降低中發(fā)揮重要作用［3］。人參具有很高的醫(yī)用價(jià)值，目前已經(jīng)從人參中分離鑒定出大量的活性成分，其中人參皂苷Rg1是發(fā)揮人參功效的主要成分［4］。近來大量的數(shù)據(jù)提示Rg1能夠促進(jìn)血管新生以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化、血管發(fā)生［5－8］。作為糖皮質(zhì)激素受體的配體，Rg1能夠增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）及 eNOS的活化［9］。這些研究均提示Rg1具有潛在的促進(jìn)血管新生作用，也許可以作為一種新的治療下肢缺血的藥物。本研究通過制作小鼠后肢缺血模型，探討人參皂苷Rg1是否具有促進(jìn)小鼠缺血后肢血管新生的作用以及可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)分組

人參皂苷Rg1（純度＞96%）購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。雄性C57BL／6J小鼠20只隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（n＝10）腹腔注射生理鹽水0.1 mL；Rg1治療組（n＝10）腹腔注射人參皂苷 Rg1（10 mg·kg－1）。每天給藥1次，連續(xù)2周。

1.2　后肢缺血模型的制作

所有小鼠以戊巴比妥（50 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后，在操作顯微鏡的輔助下在右側(cè)后肢自腹股溝韌帶中點(diǎn)至膝上做一個(gè)縱形長(zhǎng)切口，顯露股動(dòng)脈，小心地將股動(dòng)脈與股靜脈和股神經(jīng)分離，將股動(dòng)脈自腹股溝韌帶處至膝上部分用7－0線結(jié)扎兩個(gè)結(jié)，切斷兩個(gè)結(jié)之間的股動(dòng)脈。左側(cè)后肢作為非缺血對(duì)照。

1.3　激光多普勒灌注成像儀檢測(cè)小鼠后肢血流灌注

結(jié)扎股動(dòng)脈后第14天，用激光多普勒灌注成像儀（PeriScan PIM 3，瑞典）測(cè)定小鼠后肢血流灌注恢復(fù)程度。以結(jié)扎側(cè)／未結(jié)扎側(cè)血流比值即LDPI指數(shù)比較不同組之間的差別［10］。

1.4　免疫熒光檢測(cè)缺血肢體毛細(xì)血管密度

在手術(shù)后2周，小鼠血流檢測(cè)后立即處死。收集每只小鼠缺血后肢的腓腸肌。腓腸肌包埋于OTC中，液氮速凍后制備成5μm冰凍組織切片。用免疫熒光染色法檢測(cè)毛細(xì)血管密度。每張玻片熒光顯微鏡（×200倍）隨機(jī)采集2～3個(gè)不同視野的圖像，用 Image-Pro Plus軟件（Media Cybernetics，Rockville，USA）分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的CD31及DAPI染色陽(yáng)性的區(qū)域。組織毛細(xì)血管密度以CD31陽(yáng)性區(qū)域面積除以DAPI染色陽(yáng)性區(qū)域面積的比值計(jì)算［10］。

1.5　比色法檢測(cè)缺血肢體一氧化氮分泌

手術(shù)后14 d，分離缺血肢體內(nèi)收肌和半膜肌，并用PBS沖洗去除多余的血液，0.1 g肌肉放在2 mL PBS（pH＝7.4）中勻漿，勻漿物 5 000×g離心 5 min，提取上清液即刻檢測(cè)一氧化氮濃度（碧云天生物技術(shù)有限公司）［11］。

1.6　TUNEL法檢測(cè)缺血肌肉細(xì)胞凋亡

術(shù)后第14天，收集缺血肢體腓腸肌，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5μm切片。按照TUNEL試劑盒（In Situ Cell Death Detection kit，德國(guó) Roche公司）說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　Rg1治療改善缺血肢體血流

手術(shù)后14 d，激光多普勒檢測(cè)結(jié)果顯示，Rg1治療明顯地改善了小鼠缺血肢體的LDPI指數(shù)（0.65±0.11），而對(duì)照組為 0.43±0.08，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.836，P＜0.05）。見圖1。

圖1　Rg1治療改善缺血肢體血流

2.2　Rg1治療增加缺血肢體毛細(xì)血管密度

免疫熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明，Rg1治療組小鼠缺血肢體血管密度（CD31／DAPI比值）為0.65±0.11，與對(duì)照組（0.46±0.15）相比，Rg1治療使缺血肢體血管密度增加了0.4倍（t＝2.278，P＜0.05）。見圖2。

圖2　Rg1治療促進(jìn)了缺血肢體毛細(xì)血管的新生

2.3　Rg1治療降低缺血肢體細(xì)胞凋亡

TUNEL法染色凋亡細(xì)胞核為綠色，正常細(xì)胞核為藍(lán)色。結(jié)果顯示，Rg1治療組小鼠缺血組織細(xì)胞的凋亡［（20.3±6.3）%］較對(duì)照組顯著降低［（30.7±6.4）%，t＝3.682，P＜0.05］。見圖3。

圖3　Rg1治療降低缺血組織細(xì)胞的凋亡

2.4　Rg1治療增加缺血肢體組織一氧化氮的分泌

Rg1治療組缺血肢體組織一氧化氮的含量為（239.4±98.2）μmol／mL，對(duì)照組為（139.5±68.6）μmol／mL，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.637，P＜0.05）。

3　討論

本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1治療能顯著地改善小鼠肢體缺血后血流再灌注以及血管再生，其潛在機(jī)制可能為增加一氧化氮的分泌，抑制缺血組織細(xì)胞的凋亡。

既往的研究發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓eNOS活化的下降會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的受損［12］。有觀察提示NOS衍生的一氧化氮對(duì)適應(yīng)急性嚴(yán)重的肢體缺血，避免發(fā)生組織壞死和維持動(dòng)脈新生是必需的［13］。我們以前的研究表明人參皂苷Rg1提高了糖尿病小鼠及非糖尿病小鼠缺血肢體中磷酸化eNOS的表達(dá)［10］。所有這些研究表明，eNOS對(duì)促進(jìn)缺血組織血管新生具有重要作用。

研究已經(jīng)揭示，基本的細(xì)胞凋亡程序?qū)е铝瞬煌问降慕M織缺血后細(xì)胞丟失［14－15］，不受控制的細(xì)胞凋亡阻止了側(cè)支形成。我們的結(jié)果證實(shí)了人參皂苷Rg1治療能夠降低小鼠肢體缺血后細(xì)胞的凋亡。以前的研究發(fā)現(xiàn)Rg1治療能夠通過PI3K及Akt通路促進(jìn)功能性血管的新生，而PI3K及Akt通路已經(jīng)被證實(shí)在拮抗細(xì)胞凋亡中起作用［16－17］。PI3K及Akt通路是否參與了Rg1治療抑制肢體缺血后細(xì)胞凋亡還需要進(jìn)一步的研究。

本研究的主要局限是我們僅選擇了人參皂苷Rg1一種劑量，不同的治療劑量對(duì)小鼠下肢缺血后血管新生的確切作用還需要進(jìn)一步探討。

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