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        共抑制RAD18和REV1基因顯著增加順鉑對肺癌細(xì)胞的毒性

        2018-04-03 08:49:08金君李堅袁榮霞
        關(guān)鍵詞:耐藥肺癌

        金君,李堅,袁榮霞

        (江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,江蘇鎮(zhèn)江212001)

        近年來全世界每年約有近1 600萬人死于肺癌[1]。大多數(shù)患者確診時已是局部晚期或晚期肺癌。順鉑作為晚期非小細(xì)胞肺癌聯(lián)合化療方案中的基本藥物,在臨床長期使用過程中引起的腫瘤細(xì)胞耐藥性使其治療效果逐漸降低[2]。順鉑主要通過作用于DNA導(dǎo)致其形成鏈間交聯(lián)和鏈內(nèi)交聯(lián),造成DNA損傷,由此干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過程,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鏈間交聯(lián)指DNA鏈間發(fā)生了錯誤的共價交聯(lián),是毒性最強(qiáng)的一種DNA損傷,如不及時修復(fù),鏈間交聯(lián)會轉(zhuǎn)換成DNA雙鏈斷裂(DSB)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性與DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)有關(guān)。根據(jù)DNA損傷的類型和位點,鏈間交聯(lián)損傷的修復(fù)方式可分為核苷酸切除修復(fù)、非同源末端連接、同源重組修復(fù)、跨損傷合成(translesion synthesis,TLS)修復(fù)和范可尼貧血(Fanconi anemia,F(xiàn)A)通路等[3]。而與其他通路不同的是,TLS通路可通過復(fù)制性DNA聚合酶越過損傷的DNA位點繼續(xù)進(jìn)行DNA鏈復(fù)制來耐受DNA損傷[2-3]。

        近年來的研究發(fā)現(xiàn),肺癌細(xì)胞獲得性耐藥與FA通路以及TLS通路等的再活化有關(guān)[2-4]。在鏈間交聯(lián)損傷修復(fù)過程中,F(xiàn)A通路、TLS通路和其他信號通路交互作用,共同參與這種DNA損傷的修復(fù)。FA是一種罕見的常染色體隱性遺傳病,絕大部分由FA相關(guān)基因失活引起。這種遺傳病會導(dǎo)致患者的體細(xì)胞對DNA交聯(lián)劑類化療藥物(如順鉑)異常敏感,并且使患者更易發(fā)生腫瘤和骨髓衰竭[5]。目前已經(jīng)證實FA通路由19個FA蛋白(FANCA-FANCNT)組成,其中任何一個蛋白的缺失都有可能導(dǎo)致細(xì)胞對DNA交聯(lián)性損傷劑的高度敏感,這也構(gòu)成了抑制FA通路蛋白增加鉑類藥物對腫瘤細(xì)胞毒性的作用機(jī)制[6]。

        RAD18作為一種E3泛素連接酶可與RAD6結(jié)合形成RAD6/RAD18復(fù)合體,通過誘導(dǎo)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的單泛素化和招募TLS聚合酶來激活TLS通路。RAD6/RAD18還可通過誘導(dǎo)FANCD2的單泛素化激活FA通路[7-8]。同時單泛素化的FANCD2亦可通過招募TLS聚合酶激活TLS通路。REV1屬于TLS聚合酶中的Y家族成員,在鏈間交聯(lián)和DSB損傷的修復(fù)中扮演了重要角色,具有為其他TLS聚合酶提供平臺的作用[9-10]。其他Y家族的DNA聚合酶通過REV1作用域與REV1相互作用,在DNA損傷耐受機(jī)制中行使功能。例如,DNA聚合酶η的一個PIP結(jié)構(gòu)域與REV1作用域重疊,可與REV1結(jié)合并激活下游蛋白[11]。

        本實驗應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默 A549/DDP細(xì)胞的FA通路和TLS通路的上游調(diào)節(jié)基因RAD18以及TLS通路的REV1基因后,觀察FANCD2及PCNA的單泛素化水平、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡率變化,探討抑制 RAD18和 REV1后逆轉(zhuǎn) A549/DDP細(xì)胞對順鉑耐藥性的可行性及機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        肺癌A549和A549/DDP細(xì)胞株(中科院上海生命科學(xué)研究院);RMPI 1640培養(yǎng)液以及胎牛血清(以色列Bioind公司);順鉑注射液(江蘇豪森制藥有限公司);siRNA套裝:含RAD18與REV1的特異性siRNA及陰性對照siRNA(廣州銳博生物科技有限公司);LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司);CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒與PI/RNase細(xì)胞周期檢測試劑(美國 BD公司);RAD18和PCNA蛋白抗體(美國 Cell Signaling公司);REV1和 FANCD2蛋白抗體(美國 Santa Cruz公司);羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗、PVDF膜、牛血清白蛋白和ECL發(fā)光劑(美國Millipore公司)。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

        用含有0.1%青霉素與鏈霉素(雙抗)及10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549和A549/DDP細(xì)胞株,在37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。

        將處于對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞均勻接種于6孔板,使每孔密度相近,約為80%。過夜培養(yǎng)后用不含胎牛血清及雙抗的培養(yǎng)液(空白培養(yǎng)液)饑餓細(xì)胞2 h。取 siRNA儲存液2.5μL及 LipofectamineTM2000試劑5μL分別溶于250μL空白培養(yǎng)液中,室溫孵育5 min后,在20 min內(nèi)加入每孔含空白培養(yǎng)液1 mL的上述6孔板中。轉(zhuǎn)染6~8 h后,用只含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),以備后續(xù)實驗使用。

        1.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測肺癌細(xì)胞株中各蛋白的表達(dá)

        提前1 d將A549和轉(zhuǎn)染前后的A549/DDP細(xì)胞株分別接種于6孔板中,待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時,分別加入含順鉑濃度梯度為 0、1.25、2.5、5、10和20μg/mL的2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,先用預(yù)冷(4℃)1×PBS沖洗各孔3次,棄上清液,再每孔加入細(xì)胞裂解液90μL,用細(xì)胞刮板分別取出細(xì)胞裂解物于標(biāo)記的EP管中,干式恒溫器100℃煮沸5 min,細(xì)胞超聲破碎儀破碎30 s,常溫離心機(jī)2 000 r/min離心1 min后,置于-20℃冰箱保存。蛋白樣品行10%SDS-PAGE,根據(jù)蛋白分子量大小選擇轉(zhuǎn)膜90~120 min,后續(xù)用脫脂牛奶封閉1 h,相應(yīng)的一抗REV1羊抗人(1∶1 000)、RAD18(1∶1 000)、FANCD2(1∶1 000)和 PCNA(1∶1 000)兔抗人低溫(4℃)搖床孵育過夜,用TBST洗膜(15 min×3次),羊抗鼠 IgG(1∶10 000)和羊抗兔 IgG(1∶10 000)二抗孵育1 h,現(xiàn)配現(xiàn)用ECL發(fā)光劑,用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光,Lane 1D凝膠分析軟件分析其灰度。每個蛋白的相對含量為蛋白的表達(dá)量與對應(yīng)的β-肌動蛋白比值,F(xiàn)ANCD2單泛素化水平為FANCD2長短片段之比即L/S,PCNA單泛素化水平為PCNA-mUb與PCNA的比值。實驗重復(fù)3次。

        1.4 CCK-8法檢測A549/DDP細(xì)胞的增殖率

        將轉(zhuǎn)染前后的A549/DDP細(xì)胞株接種于96孔板,使每孔密度約為2×103個,同時設(shè)置3個復(fù)孔。在96孔板各孔中分別加入含順鉑濃度梯度為0、1.25、2.5、5、10和20μg/mL的 100μL培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24和48 h,用空白培養(yǎng)液作為空白組進(jìn)行校正。每孔加入含10%CCK-8試劑的培養(yǎng)液100 μL,培養(yǎng)箱孵育1~2 h后,酶標(biāo)儀上檢測光密度(D)值。細(xì)胞增殖率=[(實驗組D平均值-空白組D平均值)/(陰性對照組D平均值-空白組D平均值)]×100%。實驗重復(fù)3次。

        1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549/DDP細(xì)胞的凋亡率

        以6孔板培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前后的A549/DDP細(xì)胞,使其密度約為2×105/孔。加入含順鉑濃度為10μg/mL的2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,用無EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞,低溫離心機(jī)2 000 r/min離心10 min,用預(yù)冷(4℃)1×PBS重懸細(xì)胞,再次離心,倒盡上清液,取1×連接緩沖液500 mL輕柔緩慢稀釋成細(xì)胞懸液,加入流式管中,順序加入5μL的Annexin VFITC和5μL的PI染色液同時輕搖混勻,室溫避光15 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率(發(fā)射波長530 nm、激發(fā)波長488 nm)。實驗重復(fù)3次。

        1.6 流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞周期

        6孔板培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前后的A549/DDP細(xì)胞,使各孔密度約為2×105/孔。每孔用10μg/mL的2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后,用無EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞,收集細(xì)胞于流式管中,用3 mL PBS重懸細(xì)胞,1 500 r/min離心10 min后,棄上清液,逐滴加入預(yù)冷的75%乙醇5 mL,混勻細(xì)胞,4℃避光過夜且超過18 h。低溫離心機(jī)1 500 r/min離心10 min,用1×PBS清洗細(xì)胞兩次,棄上清液,每管加入500μL PI/RNase染色液,過200目篩網(wǎng)后再加入標(biāo)記好的流式管中,4℃避光保存,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實驗重復(fù)3次。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

        應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析結(jié)果,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組比較行單因素方差分析,兩組均數(shù)比較行SNK-q檢驗,實驗組與對照組均數(shù)比較行Dunnett-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Bliss法計算肺癌細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(50 percent inhibitory concentration,IC50)。

        2 結(jié)果

        2.1 A549和 A549/DDP細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后的RAD18、REV1蛋白表達(dá)水平

        經(jīng)不同濃度順鉑處理24 h后,A549細(xì)胞的RAD18蛋白和REV1蛋白表達(dá)水平隨著順鉑濃度的升高而下降;而A549/DDP細(xì)胞的RAD18、REV1蛋白表達(dá)隨著順鉑濃度升高而升高;在順鉑濃度為0時,A549/DDP細(xì)胞組 RAD18蛋白表達(dá)水平與A549細(xì)胞組無明顯差異(t=1.739,P=0.097),在其他的順鉑濃度點耐藥細(xì)胞中這兩個蛋白的表達(dá)量均明顯高于 A549細(xì)胞(均 P<0.05)。A549/DDP細(xì)胞中RAD18和REV1蛋白的表達(dá)上調(diào)表明FA通路和TLS通路功能增強(qiáng),提示與該細(xì)胞株對順鉑耐藥有關(guān)。見圖1和圖2。

        圖1 A549和A549/DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度順鉑處理后RAD18蛋白的表達(dá)水平

        圖2 A549和A549/DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度順鉑處理后REV1蛋白的表達(dá)

        2.2 轉(zhuǎn)染 siRNA前后 A549/DDP細(xì)胞 REV1和RAD18蛋白的表達(dá)

        A549/DDP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 REV1-siRNA和RAD18-siRNA后,REV1蛋白和RAD18蛋白表達(dá)水平均比陰性對照組和空白對照組明顯降低(均P<0.05);陰性對照組與空白對照組組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和圖4。表明REV1-siRNA和RAD18-siRNA轉(zhuǎn)染有效。

        圖3 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染REV1-siRNA后REV1蛋白相對表達(dá)水平

        圖4 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后RAD18蛋白相對表達(dá)水平

        2.3 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染 RAD18-siRNA前后FANCD2單泛素化水平

        蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后,經(jīng)不同濃度順鉑處理24 h后的 A549/DDP細(xì)胞FANCD2蛋白單泛素化水平較轉(zhuǎn)染前明顯降低(均P<0.05)(圖5),表明沉默 RAD18基因后抑制了FANCD2的單泛素化,RAD18位于FA通路的上游,是調(diào)控FA通路重要因子。

        2.4 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染 RAD18-siRNA前后 PCNA單泛素化水平

        轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后,經(jīng)不同濃度順鉑處理24 h后A549/DDP細(xì)胞的PCNA單泛素化水平明顯降低(均 P<0.05,圖6),表明 RAD18是參與 PCNA單泛素化調(diào)控的重要組分。RAD18和RAD6形成的RAD6/RAD18復(fù)合物可通過誘導(dǎo)PCNA單泛素化繼而激活TLS通路。沉默RAD18基因可使TLS通路的PCNA單泛素化水平明顯降低,表明RAD18不僅參與了FA通路的激活,也是TLS通路的調(diào)控因子。

        圖5 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后FANCD2單泛素化水平

        圖6 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA后PCNA單泛素化水平

        2.5 分別及共轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA和REV1-siRNA對A549/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響

        2.5.1順鉑對轉(zhuǎn)染不同siRNAs的 A549/DDP細(xì)胞增殖的抑制作用 A549/DDP細(xì)胞分別和共轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA和REV1-siRNA,經(jīng)順鉑處理24 h和48 h后的IC50較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞均明顯降低 (均P<0.05),共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 IC50較單轉(zhuǎn)染 RAD18-siRNA或REV1-siRNA細(xì)胞進(jìn)一步下降(均P<0.05)。見表1。圖7和圖8顯示,隨著順鉑濃度的增高,單轉(zhuǎn)染組與共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率逐漸降低,且呈劑量依賴性,共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率下降較單轉(zhuǎn)染組更為明顯(均P<0.05),而兩個單轉(zhuǎn)染組之間的細(xì)胞增殖率無明顯差異(P>0.05)。隨著順鉑作用時間的增加,細(xì)胞增殖率繼續(xù)降低,呈現(xiàn)出時間依賴性。這些結(jié)果表明沉默RAD18和REV1基因可明顯增加順鉑耐藥肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性,這兩個基因共沉默則可進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑對A549/DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

        表1 轉(zhuǎn)染不同siRNAs后A549/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50 μg/mL

        圖7 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同siRNAs后經(jīng)順鉑處理24 h的增殖率

        圖8 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同siRNAs后經(jīng)順鉑處理48 h的增殖率

        2.5.2轉(zhuǎn)染不同siRNAs后 A549/DDP細(xì)胞經(jīng)順鉑誘導(dǎo)的凋亡率 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,A549/DDP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA和REV1-siRNA以及兩者共轉(zhuǎn)染后,早期凋亡率分別為(24.60±2.11)%、(23.33±3.13)%和(40.55±1.01)%,均明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的早期凋亡率 (12.62±1.75)% (均 P<0.05)。兩個單轉(zhuǎn)染組之間的細(xì)胞早期凋亡率無明顯差異(t=0.583,P>0.05),但共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡率明顯高于兩個單轉(zhuǎn)染組(均 P<0.05)。見圖9。

        圖9 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同siRNAs后經(jīng)10μg/m L順鉑處理48 h的凋亡率

        2.5.3A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同 siRNAs后順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞周期變化 分別和共轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA以及 REV1-siRNA后,A549/DDP細(xì)胞經(jīng)10μg/mL順鉑處理48 h,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個轉(zhuǎn)染組G2期細(xì)胞數(shù)比例較未轉(zhuǎn)染組明顯增加(均P<0.05),且共轉(zhuǎn)染組比單轉(zhuǎn)染組增加更為明顯(均P<0.05)。表明轉(zhuǎn)染RAD18-siRNA和(或)REV1-siRNA后,A549/DDP細(xì)胞主要阻滯于G2期。見圖10。

        圖10 各組A549/DDP細(xì)胞經(jīng)10μg/m L順鉑處理48 h的細(xì)胞周期

        3 討論

        順鉑主要是通過抑制DNA的復(fù)制殺傷腫瘤細(xì)胞,順鉑引起的DNA損傷類型包括鏈間交聯(lián)、DSBs、單鏈斷裂和染色體重排[12]。相關(guān)研究表明腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力是順鉑耐藥的主要原因之一,而順鉑耐藥是一個涉及多個DNA損傷修復(fù)通路的復(fù)雜過程[13]。因此,探明腫瘤細(xì)胞為了應(yīng)對這些DNA損傷而具備的多種DNA修復(fù)機(jī)制是解決順鉑耐藥的前提。

        腫瘤細(xì)胞通過DNA損傷反應(yīng)機(jī)制不斷檢查染色體DNA是否存在受損或被阻滯的DNA復(fù)制叉。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA交聯(lián)損傷時,可激活經(jīng)典的FA通路產(chǎn)生修復(fù)反應(yīng),首先該通路的8個上游FA蛋白以及FA相關(guān)蛋白被活化形成FA核心復(fù)合物,然后單泛素化FANCD2和FANCI,再形成復(fù)合物ID,定位于受損的DNA,繼而募集并激活FA通路的下游蛋白到DNA損傷部位,經(jīng)過與其他DNA修復(fù)通路蛋白的相互作用,修復(fù)損傷DNA[14]。有文獻(xiàn)報告,當(dāng)細(xì)胞DNA交聯(lián)損傷發(fā)生時,除了FA核心復(fù)合物可以引起FANCD2的單泛素化,RAD18和RAD6形成的復(fù)合物也參與觸發(fā)FA通路的這一關(guān)鍵步驟[15]。FANCD2單泛素化是FA通路激活過程的中心環(huán)節(jié),也是FA通路被激活的標(biāo)志。FANCD2單泛素化水平反映了FA通路的激活狀態(tài)。研究顯示應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)直接下調(diào)FANCD2或者下調(diào)FA通路上游的蛋白表達(dá),可以抑制FANCD2單泛素化,通過阻滯FA通路激活,抑制化療藥物誘導(dǎo)DNA損傷的修復(fù),從而增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[16-18]。本研究應(yīng)用 siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲減RAD18基因?qū)е翭ANCD2的單泛素化水平明顯下降,并顯示出順鉑對耐藥肺癌細(xì)胞A549/DDP的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng),順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯增加,以及細(xì)胞周期S/G2阻滯效應(yīng)增強(qiáng),證明RAD18作用于FA通路上游,直接參與調(diào)控和誘導(dǎo)FANCD2的單泛素化以及FA通路的激活,參與了DNA交聯(lián)損傷的修復(fù)。

        DNA修復(fù)通路模型表明,致DNA損傷因子作用于細(xì)胞后導(dǎo)致DNA復(fù)制叉停滯、雙螺旋解開并產(chǎn)生異常的單鏈DNA。這些DNA單鏈未復(fù)制的區(qū)域被異常的單鏈DNA結(jié)合蛋白即復(fù)制蛋白A包被,繼而招募RAD18到DNA損傷位點,啟動TLS通路等參與的復(fù)制后修復(fù)[3]。RAD6與 RAD18結(jié)合后形成的RAD6/RAD18主要通過誘導(dǎo)PCNA單泛素化而激活TLS,促使特異性DNA聚合酶在DNA損傷部位募集,觸發(fā) TLS通路的 DNA修復(fù)反應(yīng)[19]。作為TLS聚合酶Y家族重要成員的REV1具有特殊的BRCT結(jié)構(gòu)域,能與PCNA結(jié)合并發(fā)生相互作用[20]。亦有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)A核心復(fù)合物對REV1的募集也有調(diào)控效應(yīng),提示FA通路和TLS通路之間有著密切的相互作用[21]。本實驗沉默RAD18基因后顯示PCNA蛋白的單泛素化水平明顯下調(diào),表明RAD18在TLS通路被激活的PCNA單泛素化過程中發(fā)揮了不可或缺的作用。

        本次實驗證實,順鉑對A549/DDP細(xì)胞的毒性作用明顯低于A549細(xì)胞,而順鉑誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞REV1和RAD18蛋白表達(dá)水平明顯高于A549細(xì)胞,順鉑可誘導(dǎo) A549/DDP細(xì)胞的 FANCD2和PCNA單泛素化水平呈劑量依賴性升高,提示FA通路與TLS通路均參與了A549/DDP細(xì)胞內(nèi)順鉑誘導(dǎo)DNA交聯(lián)損傷的修復(fù),或者說參與了A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥。應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染敲減RAD18基因下調(diào)其蛋白表達(dá)后可明顯抑制FANCD2和PCNA單泛素化水平,與此同時能顯著增強(qiáng)順鉑對A549/DDP的細(xì)胞毒性,表明RAD18在FA和TLS兩個通路參與的順鉑所致DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮了作用[22]。此外,本研究中細(xì)胞增殖率和細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示,敲減REV1基因亦能明顯增加順鉑對A549/DDP細(xì)胞的殺傷效應(yīng),證實REV1在TLS通路參與的順鉑誘導(dǎo)的DNA交聯(lián)損傷修復(fù)中具有重要作用。值得注意的是,RAD18和REV1基因共沉默后增加順鉑對A549/DDP細(xì)胞毒性的作用強(qiáng)于分別單獨沉默RAD18和REV1基因,提示雖然RAD18在FA和TLS兩個通路中參與DNA修復(fù)過程,與REV1共同作用在TLS通路,但RAD18和REV1的DNA修復(fù)功能并不完全重疊在一個相同的DNA修復(fù)通路中。此外,RAD18或REV1亦可能通過FA和TLS通路之外的其他途徑或機(jī)制,參與DAN交聯(lián)損傷的修復(fù),導(dǎo)致共沉默A549/DDP細(xì)胞的這兩個基因?qū)樸K的致敏效應(yīng)強(qiáng)于單基因沉默。RAD18和REV1在DNA交聯(lián)損傷修復(fù)過程中可能存在的不同作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

        綜上所述,本研究顯示,F(xiàn)A通路和TLS通路在順鉑所致肺癌細(xì)胞DNA交聯(lián)損傷的修復(fù)中發(fā)揮了重要作用,這兩個通路功能上調(diào)是肺癌細(xì)胞對順鉑耐藥的主要機(jī)制之一。分別抑制這兩個通路中的RAD18和REV1蛋白均可增加順鉑對 A549/DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒性,而共抑制RAD18和REV1可進(jìn)一步增強(qiáng)順鉑對A549/DDP細(xì)胞的殺傷效應(yīng),顯示出對順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。我們的研究結(jié)果為今后應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)或小分子抑制劑抑制RAD18和REV1,逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性,提高肺癌化療效果提供了實驗依據(jù)。

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