杭敏，嚴玉蘭，邵小美，張日婷，步雪峰

（1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002；3.江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江212002）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率在多數(shù)國家均呈上升趨勢［1］。盡管目前包括手術、放化療及靶向治療在內(nèi)的主要治療手段在不斷進步，但多數(shù)患者治療過程中病情仍迅速進展和出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移。局部浸潤和轉(zhuǎn)移是癌癥致死的主要原因，腫瘤細胞的遷移和侵襲也是促進腫瘤轉(zhuǎn)移的關鍵環(huán)節(jié)。本實驗組前期研究已發(fā)現(xiàn)，表達IL-29的重組新城疫病毒 LoSota株（recombinant Newcastle disease virus LoSota line expressing IL-29，rL-IL29）能抑制肺腺癌A549細胞的增殖及遷移，但未進一步觀察其對肺癌細胞株侵襲力的影響及其可能的作用機制［2］。故本實驗將rL-IL29感染肺腺癌A549細胞，采用CCK法、劃痕試驗及Transwell侵襲實驗觀察A549細胞的增殖、遷移和侵襲，并運用蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞 E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白及AKT／NF-κB相關蛋白的表達水平，進一步探索rLIL29對肺腺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能機制。

1　材料與方法

1.1　細胞株與主要試劑

人肺腺癌A549細胞株由江蘇大學基礎醫(yī)學研究所保存，LoSota株新城疫病毒（Newcastle disease virus LoSota，NDVL）、雞抗NDV HN蛋白抗體由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；rL-IL29由本課題組成員在中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所構建。DMEM及胎牛血清（維森特生物技術南京公司）；CCK8試劑盒（南京厚載生物科技有限公司）；Transwell小室（美國康寧公司）；鼠抗β-肌動蛋白抗體（美國Santa Cruz公司）；兔抗IL-29、E-鈣黏蛋白、MMP2（72、66 kDa）、波形蛋白、p-AKT、P65抗體（美國博士德生物公司）；HRP標記的山羊抗鼠二抗、HRP標記的山羊抗兔二抗（康為世紀公司）；HRP標記的兔抗雞二抗（美國Earthox公司）。

1.2　A549細胞的培養(yǎng)及病毒感染分組

NDVL及rL-IL29病毒原液的滴度分別為雞胚半數(shù)感染量（50%egg infective doses，EID50）109.1、108.5 EID50／mL左右。用無血清的DMEM分別稀釋NDVL及rL-IL29原液（1∶1 000）。接種對數(shù)生長期A549細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培育2～3 d換液，待細胞密度達70%～80%時，隨機分為PBS組、NDVL組及rL-IL29組，分別加入PBS及稀釋后的NDVL及rL-IL29病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3　蛋白質(zhì)印跡法檢測A549細胞中NDV HN、IL-29、E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白及 PI3K／AKT／NF-κB通路相關蛋白的表達

分別收集上述3組細胞并提取蛋白，BCA試劑盒定量各組蛋白。配置SDS-PAGE凝膠（10%的分離膠和5%的濃縮膠），蛋白上樣，先80 V 20min，再120 V 70 min電泳，結(jié)束后350 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h（電壓60～70 V），脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入雞抗NDV HN蛋白抗體（1∶800）或兔抗 IL-29、E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白、p-AKT、P65抗體（1∶300）以及鼠抗β-肌動蛋白抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜；TBST洗膜30 min／次，共3遍，后分別加入相應的二抗37℃保溫箱孵育1 h；TBST洗膜30 min／次，共3遍，曝光獲得目的條帶。采用β-肌動蛋白作為內(nèi)參，測定各泳道目的蛋白的灰度值并計算比值。

1.4　CCK8法檢測rL-IL29感染對A549細胞增殖的影響

用無血清DMEM稀釋病毒原液至以下濃度：1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5。將對數(shù)生長期A549細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成約1×105個／mL密度的細胞懸液，取100μL置96孔板（邊緣孔用無菌水填充），置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。每孔加入不同濃度的NDVL及rLIL29感染細胞，以加入PBS作為對照組，每組設3個復孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。每孔加入10μL CCK8溶液，37℃孵育1 h。同時設置空白孔（僅加培養(yǎng)基及CCK8溶液，無細胞）。用酶標儀測定450 nm各孔的D值。細胞活力（%）＝（實驗組D值－空白D值）／（對照組D組－空白D值）×100%。

1.5　劃痕實驗檢測rL-IL29感染對A549細胞遷移的影響

接種對數(shù)生長期A549細胞于24孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培育，待細胞匯合度達80%～90%時，用無菌200μL加樣槍頭在細胞層中縱向劃一條直線，保持寬度均勻一致；PBS洗3遍后，分別加入DMEM培養(yǎng)基稀釋后的PBS（對照組）、NDVL及 rL-IL29（1∶1 000）；每組均設立2個復孔。分別于劃痕后0、48 h在倒置相差顯微鏡下觀察劃痕間距。

1.6　Transwell法檢測rL-IL29感染對A549細胞侵襲的影響

將對數(shù)生長期A549細胞，用無血清DMEM配制成約1×105個／mL密度的細胞懸液，取200μL滴入24孔板Transwell小室的上室，下室分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的PBS（對照組）、NDV及 rL-IL29（1∶1 000）各500μL，每組均設立2個復孔，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培育24 h。用棉簽擦去Transwell上室聚碳酸酯膜表面的細胞，PBS洗2遍，將上室置于4%多聚甲醛中固定15 min。PBS洗2遍后，結(jié)晶紫染色20 min，再用PBS洗2遍后，倒置相差顯微鏡下計數(shù)10個不同視野的細胞數(shù)，計算平均值。

1.7　統(tǒng)計學處理

2　結(jié)果

2.1　感染rL-IL29后的A549細胞表達NDV HN和IL-29蛋白

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，rL-IL29及NDVL感染A549細胞24 h后，NDV-HN蛋白在NDVL組及rLIL29組均穩(wěn)定表達，且rL-IL29組表達量高于NDVL組，而PBS組未見NDV-HN表達；rL-IL29組IL-29蛋白的表達水平明顯高于NDVL組和PBS組。見圖1。

圖1　A549細胞感染rL-IL29后NDV HN和IL-29蛋白的表達

2.2　rL-IL29感染后A549細胞增殖能力下降

CCK8細胞增殖實驗結(jié)果顯示，rL-IL29及NDVL感染A549細胞24 h后能夠抑制細胞的增殖，且rL-IL29組的細胞活力明顯低于 NDVL組（P＜0.05）；隨著病毒稀釋倍數(shù)的增加，NDV組及 rLIL29組A549細胞活力逐步增強。見圖2。

圖2　不同濃度的rL-IL29及NDVL對A549細胞生長的影響

2.3　A549細胞感染rL-IL29后遷移能力降低

劃痕后48 h顯微鏡下觀察各組細胞由兩側(cè)向中央遷移的距離，結(jié)果顯示rL-IL29組A549細胞遷移率明顯低于 NDVL組和 PBS組（t＝10.87，20.04；P＜0.05），NDV組A549細胞遷移率明顯低于PBS組（t＝25.92，P＜0.05）。見圖3。

圖3　rL-IL29及NDVL感染對A549細胞遷移能力的影響（劃痕實驗×40）

2.4　A549細胞感染rL-IL29后侵襲能力降低

Transwell檢測顯示，rL-IL29組A549細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)明顯少于NDVL組和PBS組（t＝10.29，14.97；P＜0.05），NDVL組 A549細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)亦明顯少于PBS組（t＝8.449，P＜0.05）。見圖4。

圖4　rL-IL29及NDVL感染對A549細胞侵襲力的影響（Transwell侵襲實驗×200）

2.5　rL-IL29感染對 A549細胞中 E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白及AKT／NF-κB相關蛋白表達的影響

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與PBS組比較，NDVL組A549細胞中E-鈣黏蛋白表達量顯著增加（t＝12.65，P＜0.05），而波形蛋白、MMP2前體和激活體（66 kDa／72 kDa）、p-AKT及 P65蛋白表達均明顯降低（t＝2.97，2.86，6.871，3.286，3.534；均 P＜0.05）。與 NDVL組比較，rL-IL29組A549細胞E-鈣黏蛋白表達量明顯增加（t＝18.66，P＜0.05），其余蛋白表達均明顯下降（t＝6.04，6.018，11.25，5.095，9.058；均 P＜0.05）。見圖5。

圖5　感染rL-IL29及NDVL后A549細胞中E-鈣黏蛋白、MMP2、波形蛋白及AKT／NF-κB相關蛋白的表達

3　討論

NDV屬于溶瘤病毒，能高度選擇性殺傷腫瘤細胞且不損傷正常細胞。近年來大量研究表明溶瘤病毒治療腫瘤安全且有效［3－5］。IFNλ家族是2003年Sheppard等［6］首先報告的一組新型人白細胞介素（interleukin，IL），又名Ⅲ型 IFN，包括 IL-29（IFN-λ1）、IL-28A（IFN-λ2）和 IL-28B（IFN-λ3）。其結(jié)構與Ⅰ型IFN相似，功能較Ⅰ型IFN增強，具有抗病毒、抗增殖、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等生物學活性。人體中IL-29活性最強。研究發(fā)現(xiàn)人體不同器官的IL-28R1表達水平具有明顯差異，IL-29在多種細胞中均有表達，而IL-29通過與IL-28R1結(jié)合發(fā)揮生物學效應，說明 IL-29的特異性靶細胞呈高度局限性［7］。因此，與Ⅰ型IFN相比，IL29療效高而毒副反應小。Numasaki等［8］通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導 IFNλ促使鼠纖維肉瘤MCA205細胞分泌m IFN-λ，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)成瘤受到明顯抑制且皮下瘤肺轉(zhuǎn)移灶明顯減少。

上皮細胞間質(zhì)化對腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移過程起重要作用。上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程通常伴有上皮標志物如E-鈣黏蛋白等的下調(diào)和間質(zhì)標志物如波形蛋白等的上調(diào)［9］?；|(zhì)金屬蛋白酶如MMP2／9，能降解基底膜細胞外基質(zhì)、促進腫瘤細胞侵襲周邊結(jié)締組織進入脈管系統(tǒng)形成轉(zhuǎn)移灶［10－11］。本研究蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，rL-IL29感染后可上調(diào)E-鈣黏蛋白表達水平及下調(diào)MMP2、波形蛋白表達。推測rL-IL29可通過調(diào)控上皮細胞間質(zhì)化相關因子活性抑制腫瘤細胞的侵襲及遷移。

PI3K／AKT信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其活化可促進腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移，抑制凋亡及阻斷腫瘤新生血管形成等［12］。活化的AKT（p-AKT）通過下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化而發(fā)揮作用［13］。本研究結(jié)果顯示，rL-IL29可下調(diào)A549細胞株中AKT的磷酸化水平。另已發(fā)現(xiàn)PI3K／AKT轉(zhuǎn)導路徑通過調(diào)節(jié)肺腺癌MMPs表達參與腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤［14］。因此rL-IL29對肺腺癌A549細胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響可能與PI3K／AKT信號通路相關。PI3K／AKT的下游蛋白NF-κB是機體內(nèi)具有多種調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與了腫瘤細胞的分化、凋亡和遷移，可促進腫瘤發(fā)展的進程［15］。P65為NF-κB家族的重要成員，一般以非活性的 P65／P50／IκB（κB抑制物）聚體復合物存在于胞質(zhì)內(nèi)［16］，受到炎癥因子刺激后磷酸化激活從而發(fā)揮促腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)［17］，NF-κB可調(diào)節(jié) MMPs的表達，從而促進腫瘤遷移、侵襲。本實驗結(jié)果表明，rL-IL29可下調(diào)P65蛋白表達水平。因此推測rL-IL29可通過AKT／NF-κB路徑調(diào)節(jié)肺腺癌A549細胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

綜上，本研究表明rL-IL29可能通過阻礙AKT／NF-κB信號通路，上調(diào) E-鈣黏蛋白的表達和下調(diào)MMP2、波形蛋白的表達，從而抑制肺腺癌A549細胞的侵襲及遷移，但具體的作用機制仍需進一步證實。

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