劉攀 李鵬

摘要：從江漢平原部分豬場(chǎng)嚴(yán)重腹瀉的仔豬中采集24份仔豬黃痢、白痢糞便樣品，共分離鑒定出8株大腸桿菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，所分離到的8株大腸桿菌對(duì)氧氟沙星、頭孢噻肟、磺胺六甲、頭孢拉啶等藥物最敏感。利用強(qiáng)毒分離菌株研制成油乳劑滅活菌苗對(duì)產(chǎn)前15 d母豬和初生仔豬進(jìn)行免疫，疫苗對(duì)仔豬保護(hù)率達(dá)到100%，結(jié)果表明利用地方流行強(qiáng)毒分離菌株作為抗原制備疫苗進(jìn)行免疫可有效預(yù)防豬場(chǎng)仔豬黃白痢的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：仔豬黃白??；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)；江漢平原

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2018）03-0010-03

仔豬黃白痢是仔豬黃痢和仔豬白痢的合稱(chēng)，是由致病性大腸桿菌引起的哺乳仔豬常見(jiàn)腸道傳染性疾病。仔豬黃痢主要發(fā)生于出生后數(shù)小時(shí)至7日齡內(nèi)的仔豬，以1～3日齡內(nèi)的最常見(jiàn)，一周齡以上很少發(fā)病， 病豬主要表現(xiàn)為排黃色糊狀糞便；仔豬白痢一般發(fā)生于10～30日齡的仔豬，尤以10～20日齡的仔豬發(fā)病最多，也最為嚴(yán)重，1月齡以上則很少發(fā)生，病豬主要表現(xiàn)為排乳白色或灰白色腥臭糊狀糞便[1，2]。無(wú)論是現(xiàn)代集約化養(yǎng)豬場(chǎng)還是傳統(tǒng)式家庭養(yǎng)殖場(chǎng)，仔豬黃白痢都時(shí)有發(fā)生，其發(fā)病率和死亡率均較高，是造成仔豬育成成活率低，影響?zhàn)B豬業(yè)效益的主要疾病之一。由于近幾年大量抗生素濫用，導(dǎo)致致病性大腸桿菌耐藥譜廣泛，因其血清型眾多，變異頻繁，對(duì)生豬疫病防控工作造成嚴(yán)重威脅。

本試驗(yàn)對(duì)江漢平原豬場(chǎng)腹瀉嚴(yán)重的仔豬黃白痢病料進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)和自家滅活苗的制備及應(yīng)用，以期為仔豬黃白痢的有效防治提供理論依據(jù)和參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 江漢平原豬場(chǎng)嚴(yán)重腹瀉仔豬中采集的24份糞便樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基 TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅-美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 藥敏紙片 杭州天和微生物試劑公司生產(chǎn)。

1.1.4 白油 生物制品用10號(hào)白油，購(gòu)自杭州煉油廠(chǎng)，長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 12只清潔級(jí)昆明小鼠，每只20 g左右，購(gòu)自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 按照所購(gòu)培養(yǎng)基使用說(shuō)明制備好相應(yīng)的培養(yǎng)基。

1.2.2 病原分離鑒定 從江漢平原各地豬場(chǎng)無(wú)菌采集具有黃痢、白痢癥狀的仔豬糞便24份，分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，置37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取紅色中等大小光滑菌落，接種于TSB培養(yǎng)基增菌，置37 ℃溫箱培養(yǎng)16～18 h，然后將培養(yǎng)物分別劃線(xiàn)接種于TSA培養(yǎng)基和伊紅-美藍(lán)瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，18～24 h 后挑取平板上可疑菌落抹片染色鏡檢， 后將疑似菌落少許再接種于TSB培養(yǎng)基， 供以后試驗(yàn)用。

1.2.3 生化試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、M.R試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)等生化試驗(yàn)，做好試驗(yàn)結(jié)果記載。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 挑選臨床中常用的藥物如青霉素、鏈霉素、頭孢噻肟、卡拉霉素及恩諾沙星等按常規(guī)藥敏紙片法進(jìn)行，詳細(xì)記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 致病試驗(yàn) 將分離菌的TSB純培養(yǎng)物稀釋至統(tǒng)一濃度后分別腹腔接種10只健康小鼠，劑量為0.2 mL/只，另設(shè)5只小鼠為對(duì)照。24 h內(nèi)死亡的小鼠棄掉并做無(wú)害化處理。24～48 h 死亡或發(fā)病者無(wú)菌采集其心血抹片，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。并取病料接種于TSA瓊脂，增殖后保存?zhèn)渲泼缡褂肹4]。

1.2.6 滅活疫苗的制備 用上述步驟分離鑒定的高致病性大腸桿菌作為菌種，接種TSB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)36 h，采用無(wú)菌生理鹽水洗下培養(yǎng)平板上的菌苔，制成分離菌混懸液，活菌計(jì)數(shù)后將其稀釋至濃度為12 億CFU/mL，加入甲醛，37 ℃滅活48 h，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后再加入白油佐劑進(jìn)行乳化制成油乳劑滅活苗，疫苗中抗原的終濃度為3 億CFU/mL。

1.2.7 疫苗免疫試驗(yàn) 取制成的油乳劑滅活菌苗，按2 mL/只劑量接種產(chǎn)前10～15 d的母豬，詳細(xì)記載免疫母豬后代的黃白痢發(fā)病率，判斷其免疫效果。按1 mL/只劑量接種非免母豬生產(chǎn)的初生仔豬，詳細(xì)記載免疫仔豬的黃白痢發(fā)病率，判斷其免疫效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

24份糞便樣品中有8株疑似菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)18 h后均為紅色菌落，在伊紅-美藍(lán)瓊脂上培養(yǎng)18 h后均為紫黑色帶金屬光澤的中等大小圓形菌落，革蘭氏染色鏡檢均為紅色中等大小桿菌。

2.2 生化鑒定

分離到的8株細(xì)菌都能發(fā)酵乳糖、麥芽糖和葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；僅有部分菌株不分解蔗糖，不產(chǎn)生硫化氫，V-P 試驗(yàn)為陰性，吲哚和甲基紅試驗(yàn)（M.R）均為陽(yáng)性，根據(jù)文獻(xiàn)[3]可判定分離菌株為大腸桿菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)

所有分離菌均對(duì)氧氟沙星、頭孢噻肟、磺胺六甲、頭孢拉啶等藥物敏感， 而對(duì)其他藥物則產(chǎn)生了不同程度的耐受性。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 致病性試驗(yàn)

8組試驗(yàn)組中均有小鼠死亡，對(duì)照組小鼠不發(fā)病。發(fā)病及死亡小鼠的心血抹片經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為紅色中等大小的桿菌，與致病試驗(yàn)所用菌株一致。從表2中可知第6、7、8組分離菌對(duì)小鼠的致死率很高，這3組死亡小鼠心血分離菌可用作疫苗抗原。

2.5 疫苗免疫效果

根據(jù)致病試驗(yàn)結(jié)果，選取3株強(qiáng)毒力菌株作為抗原制苗，取制備的油乳劑滅活菌苗，隨機(jī)選取9個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。由表3、表4數(shù)據(jù)可知，按2 mL/只劑量接種產(chǎn)前10～15 d的母豬，免疫母豬后代無(wú)黃白痢發(fā)生，而對(duì)照組仔豬的發(fā)病率為70%～90%。按1 mL/只劑量接種非免母豬生產(chǎn)的初生仔豬，仔豬無(wú)黃白痢發(fā)生，而對(duì)照組仔豬的發(fā)病率為60%～100%。無(wú)論是免疫產(chǎn)前母豬還是免疫初生仔豬，以分離株作為抗原制備的疫苗對(duì)仔豬的免疫保護(hù)效果都非常好。

3 小結(jié)與討論

（1）對(duì)從豬場(chǎng)糞便采樣分離到的8株細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)特性、顯微鏡檢、生化試驗(yàn)及致病試驗(yàn)鑒定，證實(shí)所分離到的細(xì)菌均為致病性大腸桿菌，且其中有3株毒力非常強(qiáng)。

（2）藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明8株大腸桿菌對(duì)氧氟沙星、頭孢噻肟、磺胺六甲、頭孢拉啶等藥物敏感，而對(duì)青霉素、鏈霉素和痢特靈等藥物產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性。

（3）根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇敏感藥物磺胺六甲、頭孢噻肟對(duì)豬場(chǎng)病豬進(jìn)行了治療，取得了很好的療效。但是在停藥后大約1周左右部分豬又開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉癥狀，表明僅僅依靠藥物治療很難徹底控制該病，主要原因是豬場(chǎng)在臨床上濫用抗生素，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥性在不斷增強(qiáng)。因此，仔豬黃白痢防治的重點(diǎn)是預(yù)防為主，應(yīng)通過(guò)加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理，做好環(huán)境衛(wèi)生，管理好母豬，做好其他豬病的防控，來(lái)提高仔豬的抵抗力。

（4）目前防治仔豬黃白痢最有效的措施仍然是免疫接種，通常是給臨產(chǎn)母豬注射市售的大腸桿菌基因工程菌苗。即便如此，免疫后母豬所產(chǎn)仔豬仍然會(huì)有黃白痢發(fā)生， 表明免疫用菌苗的抗原血清型與臨床上引起仔豬黃白痢的大腸桿菌血清型不一致。在本試驗(yàn)中，根據(jù)豬場(chǎng)實(shí)際情況，從豬場(chǎng)分離病原，通過(guò)致病試驗(yàn)，再?gòu)姆蛛x株中挑選強(qiáng)毒株作為抗原制備成油乳劑滅活苗，經(jīng)豬場(chǎng)應(yīng)用試驗(yàn)，免疫母豬的后代及免疫仔豬不再發(fā)生黃白痢，而對(duì)照組組仍有60%以上的發(fā)病率。結(jié)果提示各豬場(chǎng)應(yīng)使用與本場(chǎng)流行的血清型一致的菌株制苗進(jìn)行群體免疫，可以非常有效地防治黃白痢的發(fā)生。

（5）本次采用分離到的3株強(qiáng)毒株制苗免疫結(jié)果表明對(duì)非分離株豬場(chǎng)的免疫保護(hù)率也達(dá)到了100%，說(shuō)明目前在江漢平原豬場(chǎng)流行的毒株以分離到的毒株為主，該毒株血清型具有地方流行性特點(diǎn)。另外5株分離株血清型是否與3株強(qiáng)毒株的血清型相同還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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