余瓊衛(wèi),　方凱敏,　何小梅,　鄭　杰,　馮鈺锜(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430072)

蛋白質(zhì)的磷酸化是一種重要的可逆性翻譯后修飾,參與諸多生理調(diào)控過程[1]。一般采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)或基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(MALDI-MS)對磷酸化蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行檢測,用于研究磷酸化的豐度、位點(diǎn)等。但是,由于磷酸化多肽在體內(nèi)含量低,且所處基質(zhì)復(fù)雜,難以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析檢測。因此,在質(zhì)譜分析前,需對其進(jìn)行純化和富集[2,3]。目前應(yīng)用最廣泛的磷酸化多肽的富集方法主要是固載金屬親和色譜法[4-9]和金屬氧化物親和色譜法[10-15]。其中,金屬氧化物親和色譜法中已有多種金屬氧化物(如TiO2、ZrO2、Al2O3等)被開發(fā)應(yīng)用于磷酸化多肽的富集,但是由于金屬氧化物表面性質(zhì)的差異,它們對磷酸化多肽的選擇性存在較大的差別[16,17],如ZrO2和TiO2, Zr和Ti在晶體中的配位數(shù)不同會導(dǎo)致它們對磷酸化多肽不一樣的結(jié)合能力;不僅如此,采用不同方法制備得到的不同晶型的同種類型金屬氧化物對磷酸化多肽也會有不同的選擇性[18]。因此,磷酸化多肽預(yù)富集新方法及富集材料的開發(fā)一直是磷酸化蛋白質(zhì)組研究的重要課題,具有重要意義。

液相沉積法(liquid phase deposition,簡稱LPD)是濕化學(xué)法中發(fā)展起來的一種全新的成膜方法[19,20],該方法為向金屬氟代絡(luò)離子([MFn]m-n,m為金屬M(fèi)離子的價(jià)態(tài),n為F原子個(gè)數(shù))中添加反應(yīng)物水,其基本原理可用以下反應(yīng)式表示:

同時(shí)加入它們的反應(yīng)產(chǎn)物HF的消耗劑硼酸(H3BO3)或金屬鋁使金屬氧化物薄膜沉積在基質(zhì)表面。該方法操作簡單、不受基底形狀限制、制備過程中不需要熱處理,并且不需要昂貴的設(shè)備,它是專為制備氧化物薄膜而發(fā)展起來的,因此被廣泛應(yīng)用于催化材料或電極材料等材料中功能性氧化物薄膜的制備。

基于LPD的特點(diǎn),本課題組將該方法應(yīng)用于分離介質(zhì)材料的制備中[11,14,20-23],目前我們已采用LPD分別在毛細(xì)管和硅膠基質(zhì)上沉積了納米氧化鈦、納米氧化硅及納米氧化鎳等多種納米氧化物涂層材料,目前還未見采用LPD制備的納米氧化鋯涂層應(yīng)用于分離科學(xué)領(lǐng)域中的報(bào)道。

棉花作為一種豐富的天然生物材料,具有廉價(jià)、生物相容性好、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),近年來被引入到分離科學(xué)領(lǐng)域,本課題組將進(jìn)行功能化修飾后的棉花應(yīng)用于一種微型化的SPE裝置,即將功能化的棉花填裝于注射器內(nèi)或者移液槍的吸頭中,從而對待分析物進(jìn)行快速萃取[24-29]。因棉花的表面含有大量的羥基,可以作為液相沉積的基底。本工作采用液相沉積法制備了納米氧化鋯沉積棉花纖維(ZrO2-CF)材料,對材料進(jìn)行了表征,并將其應(yīng)用于磷酸化多肽的選擇性富集。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器、試劑與材料

冷凍離心濃縮儀(美國Labconco公司), 掃描電鏡(Quanta 200，荷蘭FEI公司)及其附帶的能量色散型光譜儀(EDAX GENSIS, 美國Ametek公司)。Axima TOF型MALDI-TOF MS儀(日本Shimadzu公司)。

磷酸(H3PO4)、三氟乙酸(TFA)、2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)、β-酪蛋白(β-casein)、牛血清白蛋白(BSA)、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)、胰蛋白酶等購自美國Sigma-Aldrich公司。氟鋯酸(H2ZrF6)購自阿拉丁公司。鋁片購自國材科技有限公司。分析純氨水、乙酸購自國藥集團(tuán)有限公司。脫脂棉花購買于徐州衛(wèi)材有限公司。純水使用Millipore公司的Milli-Q裝置(Bedford,美國)制備得到。脫脂牛奶購于武漢大學(xué)自強(qiáng)超市。血清是來自武漢大學(xué)?？傖t(yī)院健康人的血清,存放在-80 ℃冰箱中,備用。

1.2　二氧化鋯涂覆脫脂棉花(ZrO2-CF)的制備

在裝有75 mL二次水的100 mL的塑料燒杯中裝入約2 g棉花,1片16 cm2的鋁片,然后加入2 mL的H2ZrF6(45%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),磁力攪拌沉積3天,讓納米氧化鋯均勻地沉積在棉花的表面,接著將棉花取出,在砂芯漏斗中抽濾、二次水潤洗5～6次,放入烘箱中100 ℃烘干6 h。用LPD法制備得到ZrO2的過程如反應(yīng)式(1)和(2)所示:

(1)

(2)

1.3　樣品的制備

β-酪蛋白酶解物:采用100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)緩沖溶液稀釋β-酪蛋白配制1 g/L的β-酪蛋白溶液,然后按照酶與β-酪蛋白質(zhì)量比為1∶50的比例在上述溶液中加入胰蛋白酶,將加入了酶的β-酪蛋白溶液在37 ℃下反應(yīng)16 h,β-酪蛋白溶液經(jīng)酶解后得到的產(chǎn)物在真空離心濃縮儀中旋干,存放在-80 ℃冰箱中備用。

BSA酶解物:首先配制含8 mol/L尿素的100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)緩沖溶液,然后將1 mg BSA加入到100 μL上述緩沖溶液中,待BSA溶解后,再加入DTT(DTT終濃度為10 mmol/L),放于37 ℃烘箱中反應(yīng)30 min,然后在上述溶液體系中繼續(xù)加入IAA(IAA終濃度為20 mmol/L),避光室溫反應(yīng)30 min;之后,再加入300 μL 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)稀釋,按照酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1∶50的比例加入胰蛋白酶,置于37 ℃烘箱中反應(yīng)16 h。酶解后的產(chǎn)物經(jīng)真空離心濃縮儀旋干后存放于-80 ℃冰箱中備用。

脫脂牛奶酶解物:將100 μL脫脂牛奶放在真空離心濃縮儀中旋干,然后加入100 μL含8 mol/L尿素的100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)緩沖溶液復(fù)溶牛奶。剩余的步驟與BSA的酶解步驟相同。

1.4　磷酸化多肽的富集過程

稱取3 mg的ZrO2-CF裝填在200-μL吸頭前端,控制材料填裝的高度在4 mm左右,將裝填了ZrO2-CF的吸頭裝在移液槍上,通過移液槍的多次吸/推使用。

圖 1　棉花(CF)及納米氧化鋯沉積棉花(ZrO2-CF)的(a,b)掃描電鏡圖及(c,d)能量色散光譜表征圖Fig. 1　(a, b) Scanning electron microscopy (SEM) and (c, d) energy-dispersive spectroscopy (EDS) characterization images of CF and ZrO2-CFa. CF; b. ZrO2-CF; c. CF; d. ZrO2-CF.

1.4.1多肽溶液的富集

先將移液槍吸/推20次50 μL 3% (體積分?jǐn)?shù),下文中若無特殊說明,均為體積分?jǐn)?shù))TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)對材料平衡處理,然后將50 μL加入了多肽的3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)上樣液進(jìn)行上樣,為使磷酸化多肽充分吸附在ZrO2-CF材料上,吸/推移液槍40次上樣液,然后用50 μL 3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)清洗兩次,每次吸/推移液槍30次,之后采用50 μL 5%的氨水進(jìn)行解吸兩次,兩次各吸/推移液槍30次。將兩次所得的解吸液合并,真空離心濃縮儀旋干。最后,用2 μL的基質(zhì)溶液(20 g/L 2,5-DHB于50%乙腈、1% H3PO4的水溶液中)對旋干的解吸液進(jìn)行復(fù)溶,取1 μL的復(fù)溶液點(diǎn)在質(zhì)譜儀靶上進(jìn)行MALDI-TOF2MS分析。

1.4.2血清中磷酸化多肽的富集

與1.4.1節(jié)方法基本一致,先將2 μL血清樣品用3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)稀釋至50 μL,再作為上樣液進(jìn)行上樣,其他操作同1.4.1節(jié)。

1.4.3脫脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集

將2 μL脫脂牛奶酶解物用3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)稀釋500倍,取50 μL的稀釋液作為上樣液,其他操作同1.4.1節(jié)。

1.5　儀器分析條件

MALDI-TOF2MS分析時(shí)采用波長為337 nm的氮?dú)饧す馄?其脈沖寬度為3 ns;采用20 kV的加速電壓,在正離子反射模式下進(jìn)行檢測。質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為1 000～3 500,每張譜圖是500次激光掃描的平均結(jié)果。

2　結(jié)果與討論

2.1　ZrO2-CF的表征

我們利用掃描電子顯微鏡(SEM)對棉花和ZrO2-CF的表面形貌進(jìn)行了表征。結(jié)果如圖1所示,相比于棉花(圖1a), ZrO2-CF的表面出現(xiàn)了一層致密的納米二氧化鋯顆粒(圖1b)。同時(shí)采用能量色散型光譜儀表征了棉花和ZrO2-CF表面元素的差異(圖1c, 1d),證明了ZrO2-CF表面ZrO2的存在。結(jié)果表明,ZrO2-CF中Zr的含量為5.59%(圖1d)。

2.2　ZrO2-CF對磷酸化多肽的富集性能考察

2.2.1萃取條件的優(yōu)化

多肽混合物中除含有磷酸化多肽外,還含有大量的非磷酸化多肽,在一定的酸度條件下,含有羧酸根等基團(tuán)的非磷酸化多肽也會與氧化鋯產(chǎn)生路易斯酸堿作用,從而干擾磷酸化多肽的富集,因而需對上樣溶液的酸度進(jìn)行優(yōu)化。我們將ZrO2-CF用于β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物(物質(zhì)的量比為1∶10)混合樣品的磷酸化多肽的富集分析研究。上樣液中有機(jī)相為50%乙腈時(shí),考察水相中不同體積分?jǐn)?shù)的TFA對多肽混合物萃取效果的影響。當(dāng)上樣液的水相中TFA的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí),非磷酸化多肽的信號較1%TFA和3%TFA時(shí)的弱,但信噪比較低;上樣液的水相中TFA含量為1%時(shí),磷酸化多肽的信噪比較高,但是由于溶液的酸度較低,所以羧酸根等離子也被電離,也與納米氧化鋯產(chǎn)生路易斯酸堿作用,因而非磷酸化多肽的信號也較高,綜合比較,最后選擇3%TFA水溶液作為上樣液的酸度條件。

仍然將β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物(物質(zhì)的量比為1∶10)混合樣品作為考察對象,固定上樣液的酸度為3%TFA,考察上樣液中乙腈含量對萃取效果的影響。如圖2所示,上樣液中含有20%乙腈或者80%乙腈的時(shí)候,解吸液譜圖中都含有大量的非磷酸化多肽(圖2a, 2c),而上樣液中乙腈的含量為50%時(shí),解吸液譜圖中的非磷酸化多肽比較少,磷酸化多肽的峰較為明顯(圖2b)。圖中標(biāo)有數(shù)字的峰為磷酸化多肽信號峰,所標(biāo)的數(shù)字為對應(yīng)磷酸化多肽的質(zhì)荷比(m/z)。這可能與磷酸化多肽與大部分非磷酸化多肽的疏水性不同有關(guān)。故選擇50%乙腈作為上樣液的有機(jī)相。

圖 2　β-酪蛋白和BSA酶解混合物經(jīng)ZrO2-CF富集后的MALDI-TOF2譜圖Fig. 2　MALDI-TOF2 mass spectra of the tryptic digest mixtures of β-casein and BSA after the ZrO2-CF enrichment Sampling solution: a. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (80∶20,v/v); b. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (50∶50, v/v); c. 3%(v/v) TFA aqueous solution-ACN (20∶80,v/v). Molar ratio of β-casein to BSA is 1∶10. Phosphopeptides are labeled with their observed m/z.

綜上,選擇3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)作為上樣液。采用填裝了3 mg ZrO2-CF材料的吸頭對3 pmol溶解于3%TFA水溶液-乙腈(50/50, v/v)的β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽進(jìn)行萃取,將萃取后的萃余液用MALDI-TOF2MS進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)萃余液中無磷酸化多肽信號,表明ZrO2-CF對3 pmolβ-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽萃取沒達(dá)到吸附飽和,滿足少量生物樣品分析。

2.2.2萃取性能的考察

分別采用ZrO2-CF和未修飾的棉花纖維CF對β-酪蛋白酶解物(3 pmol)進(jìn)行萃取分析,考察它們對磷酸化多肽的富集能力。如圖3a所示,當(dāng)β-酪蛋白酶解物未經(jīng)材料富集直接進(jìn)行MALDI-TOF2MS檢測分析時(shí),雖然可以檢測到4個(gè)磷酸化多肽的信號峰,但是譜圖中還有大量非磷酸化多肽的信號峰,并且檢測到的磷酸化多肽的信號都較弱。而經(jīng)ZrO2-CF富集后,萃余液(圖3b)中幾乎看不到磷酸化多肽的峰,表明ZrO2-CF材料對磷酸化多肽具有較強(qiáng)的作用,解吸液(圖3c)中可以看到9個(gè)磷酸化多肽的峰,幾乎看不到非磷酸化多肽的峰,說明在用ZrO2-CF處理后能有效地去除大部分的非磷酸化多肽,表明材料對磷酸化多肽有較好的萃取選擇性。然而用未修飾的棉花富集β-酪蛋白酶解物后的解吸液中只能檢測到1個(gè)磷酸化多肽(圖3d),表明CF表面沉積的納米ZrO2顆粒對磷酸化多肽具有較好的選擇性作用。

圖 3　β-酪蛋白的酶解物萃取前后的MALDI-TOF2的質(zhì)譜圖Fig. 3　MALDI-TOF2 mass spectra of tryptic digest of β-casein a. direct analysis; b. analysis after enrichment with ZrO2-CF; c. analysis of sampling eluate; d. analysis after enrichment with cotton fiber. Phosphopeptides are labeled with their observed m/z.

圖 4　不同比例的β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的混合物經(jīng)ZrO2-CF富集前后的質(zhì)譜圖Fig. 4　MALDI-TOF2 mass spectra obtained by direct analysis and after ZrO2-CF enrichment of the tryptic digest mixtures of β-casein and BSA Molar ratio of β-casein and BSA are 1∶1 (a, d), 1∶10 (b, e), and 1∶100 (c, f). The concentration of β-casein was 6.0×10-8 mol/L. a, b, c is obtained by direct analysis; d, e, f is obtained after enrichment with ZrO2-CF.

圖 5　血清酶解物和脫脂牛奶酶解物直接進(jìn)樣和經(jīng)ZrO2-CF富集后的MALDI-TOF2質(zhì)譜圖Fig. 5　MALDI-TOF2 mass spectra of tryptic digest of human serum and non-fat milk obtained by direct analysis or after enrichment with the ZrO2-CF a, b: tryptic digest of human serum obtained by (a) direct analysis and (b) after enrichment with the ZrO2-CF ; c, d: tryptic digest of non-fat milk obtained by (c) direct analysis and (d) after enrichment with the ZrO2-CF.

為了進(jìn)一步考察ZrO2-CF對磷酸化多肽的萃取選擇性,將它用于β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物不同比例混合后的磷酸化多肽的富集。如圖4所示,酶解物混合后未經(jīng)富集直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí),譜圖中無法觀察到磷酸化多肽的信號(圖4a, 4b, 4c),基本上都是非磷酸化多肽的信號峰,說明非磷酸化多肽嚴(yán)重干擾了磷酸化多肽的質(zhì)譜分析,因此質(zhì)譜檢測磷酸化多肽前需將其選擇性地從復(fù)雜樣品中萃取出來。圖4d、4e和4f分別為1∶1、1∶10、1∶100(物質(zhì)的量比)的β-酪蛋白和BSA酶解物的混合物經(jīng)ZrO2-CF富集后質(zhì)譜檢測的譜圖,可以看出,當(dāng)β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的比例為1∶1時(shí),經(jīng)材料處理后能觀察到5個(gè)磷酸化多肽的信號峰;當(dāng)其混合比例提高到1∶10, ZrO2-CF富集后的溶液能仍觀察到5個(gè)磷酸化多肽的信號峰;而當(dāng)其比例達(dá)到1∶100后,ZrO2-CF富集后的溶液依然能觀察到4個(gè)磷酸化多肽的信號峰,且3個(gè)比例的酶解混合物經(jīng)ZrO2-CF富集后的質(zhì)譜圖中基本上看不到非磷酸化多肽的峰。以上結(jié)果表明,ZrO2-CF可以有效地從多肽混合物中選擇性地萃取磷酸化多肽。

為考察方法的靈敏度,將ZrO2-CF用于β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽的萃取,當(dāng)β-酪蛋白的濃度低至10 fmol時(shí),其酶解物經(jīng)過ZrO2-CF富集后仍然可以檢測到m/z3 122的信號,這說明方法靈敏度高。

2.3　ZrO2-CF材料對血清和牛奶中磷酸化多肽的富集應(yīng)用

由于磷酸化多肽與人類疾病有著密切關(guān)系,人血清中內(nèi)源性磷酸化多肽的測定受到越來越多的關(guān)注。由于血清樣品含有大量蛋白質(zhì)、多肽等復(fù)雜成分,對其中的磷酸化多肽進(jìn)行分析仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性的工作。將血清樣品稀釋后,未經(jīng)材料富集直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí),如圖5a所示,譜圖中沒有磷酸化多肽的信號;而在經(jīng)ZrO2-CF富集后,如圖5b所示,解吸液的質(zhì)譜圖中可看到4個(gè)磷酸化多肽的信號峰,它們的序列信息分別為DSGEGDFLAEGGGV(m/z1 389.5)、ADSGEGDFLAEGGGV(m/z1 460.5)、DSGEGDFLAEGGGVR(m/z1 545.5)和ADSGEGDFLAEGGGVR(m/z1 616.5)。

為了進(jìn)一步證明ZrO2-CF對復(fù)雜樣品中磷酸化多肽的萃取能力,將脫脂牛奶的酶解產(chǎn)物作實(shí)際樣品,繼續(xù)考察ZrO2-CF從實(shí)際樣品中捕獲磷酸化肽段的選擇性。牛奶中含有大量的蛋白質(zhì)和碳水化合物,基質(zhì)非常復(fù)雜,當(dāng)將脫脂牛奶酶解物直接經(jīng)MALDI-TOF2質(zhì)譜分析時(shí),如圖5c所示,僅有6個(gè)標(biāo)示的譜峰為磷酸化多肽的信號峰,且信號較弱,譜圖中大多數(shù)是非磷酸化多肽的信號峰;然而經(jīng)過ZrO2-CF富集后,如圖5d所示,非磷酸化多肽被有效去除,有9個(gè)磷酸化多肽被檢測到且信號得到極大的提高,這9個(gè)被檢測到的磷酸化肽段分別為β1(FQSEEQQQTEDELQDK,m/z2 061.5)、β2(FQSEEQQQTEDELQDKIHPF,m/z2 556.8)、β3(RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR,m/z3 122.1)、α1 (TVDMESTEVFTK,m/z1 466.3)、α2(TVDM- ESTEVFTKK,m/z1 594.4)、α3 (VPQLEIVPNSAEER,m/z1 660.4)、α4(YLGEYLIVPNSAEER,m/z1 832.6)、α5(DIGSESTEDQAMEDIK,m/z1 927.4)、α6(YKVPQLEIVPNSAEER,m/z1 951.7)和α7(FPQYLQYLYQGPIVLNPWDQVKR,m/z3 024.9)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ZrO2-CF可以從復(fù)雜的實(shí)際樣品中高選擇性地萃取磷酸化多肽,與文獻(xiàn)報(bào)道的萃取材料相比(見表1), ZrO2-CF與其他材料對磷酸化多肽的富集靈敏度基本相當(dāng),但是材料的制備方法及萃取方式更簡單,適用于少量樣品的磷酸化多肽的快速萃取分析。

表 1　ZrO2-CF與文獻(xiàn)報(bào)道的磷酸化富集材料的比較Table 1　Comparison of ZrO2-CF with the reported different materials for phosphopeptide enrichment

MDE: matrix dispersion extraction; MSPE: magnetic solid-phase extraction; SPE: solid-phase extraction.

3　結(jié)論

本文采用液相沉積法成功制備了納米氧化鋯沉積棉花纖維ZrO2-CF材料,并將其填裝于移液槍的吸頭內(nèi),應(yīng)用于磷酸化多肽的簡單、快速富集萃取。不論對簡單的磷酸化蛋白質(zhì)的酶解物樣品還是混有大量非磷酸化蛋白的酶解物樣品,ZrO2-CF材料對磷酸化多肽均表現(xiàn)出較高的萃取選擇性。將ZrO2-CF材料應(yīng)用于人血清和脫脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集萃取,也表現(xiàn)出了較好的選擇性。材料制備簡單、成本低,且生物相容性好,對磷酸化多肽具有較好的萃取選擇性;將材料裝填到移液槍后的抽吸萃取方法簡單、快速、具有較好的應(yīng)用前景。

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