魏 萌，李 菁，楊麗菲，胡 瑞

(上海兒童醫(yī)學(xué)中心新生兒科，上海 200217)

高膽紅素血癥是新生兒最常見(jiàn)的疾病之一。60%～80%的新生兒會(huì)發(fā)生黃疸或新生兒高膽紅素血癥，至今臨床上仍有約50%黃疸患兒的病因不明確[1]。部分新生兒嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為急性膽紅素腦病(acute bilirubin encephalopathy，ABE)或核黃疸，將顯著增加新生兒死亡率，幸存的新生兒可能會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)期的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、耳聾、智力障礙或嚴(yán)重發(fā)育遲緩等?，F(xiàn)有的臨床指南建議，早期發(fā)現(xiàn)新生兒患嚴(yán)重高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)，可利于及時(shí)、有效地預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。引起新生兒重癥高膽紅素血癥的原因很多，形成因素也較為復(fù)雜，往往是多種因素綜合作用的結(jié)果。近年我國(guó)對(duì)新生兒高膽紅素血癥臨床原因的分析較多。2009年北京兒童醫(yī)院新生兒中心研究發(fā)現(xiàn)，重癥高膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素中臨床最常見(jiàn)的是感染，其次是原因不明、早產(chǎn)、溶血、窒息、頭顱血腫、遺傳代謝病。臨床上，很多不明原因的黃疸與基因改變有關(guān)。目前關(guān)于新生兒黃疸基因研究主要集中在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1 Al，UGTlAl)基因多態(tài)性方面。

據(jù)此，在不明原因高膽紅素血癥患兒中通過(guò)評(píng)估家族史、基因監(jiān)測(cè)等發(fā)現(xiàn)基因突變?nèi)巳?，?duì)這類患兒進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，同時(shí)對(duì)這類患兒家屬今后生育子女及早采取預(yù)防措施是降低膽紅素腦病發(fā)生的有效途徑之一，也可進(jìn)一步深入研究不明原因嚴(yán)重高膽紅素血癥的發(fā)生機(jī)制。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

對(duì)上海兒童醫(yī)學(xué)中心新生兒科2015—2016年收治的嚴(yán)重高膽紅素血癥59例患兒進(jìn)行分析，以探討UGT1A1基因突變與新生兒不明原因嚴(yán)重高膽紅素血癥的相關(guān)性。根據(jù)對(duì)光療的反應(yīng)將59例患兒分為難治性高膽紅素血癥組(難治組)和非難治性高膽紅素血癥組(非難治組，難治性：光療8h后，血清膽紅素下降小于5mg/dL或黃疸退而復(fù)現(xiàn)，再次達(dá)到光療或者換血標(biāo)準(zhǔn))。納入標(biāo)準(zhǔn)：原因不明，出生14d之內(nèi)，重癥高膽紅素血癥血清膽紅素峰值達(dá)342mol/L以上，以非結(jié)合膽紅素增高為主，非結(jié)合膽紅素占總膽紅素的80%以上的足月患兒。患兒入院時(shí)家屬即簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：生后>14d、新生兒溶血病、新生兒窒息、先天性心臟病和消化道畸形引起攝入不足、感染、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)缺乏、頭皮血腫、出血性疾病、使用影響膽紅素代謝的藥物、胃腸外營(yíng)養(yǎng)及患兒乙肝表面抗原陽(yáng)性或其他肝臟疾??；監(jiān)護(hù)人拒絕行基因檢測(cè)的；研究者認(rèn)為有不適合參加試驗(yàn)的任何其他情況。

1.2研究方法

本研究為非隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。通過(guò)監(jiān)測(cè)外周血白細(xì)胞基因組DNA UGT1A1測(cè)序，了解不明原因高膽紅素血癥患兒UGT1A1突變發(fā)生率及類型，比較不明原因的難治性嚴(yán)重高膽紅素血癥患兒和非難治性嚴(yán)重高膽紅素血癥患兒UGT1A1基因突變的發(fā)生率的差異?；驒z測(cè)：采外周靜脈血2～4mL，設(shè)計(jì)UGT1A1基因PCR擴(kuò)增引物，采用Taq DNA聚合酶試劑盒對(duì)DNA樣本UGT1A1基因(外顯子及其側(cè)翼序列)擴(kuò)增，擴(kuò)增后電泳條帶特異，ABI3100測(cè)序儀Sanger測(cè)序；試驗(yàn)中止標(biāo)準(zhǔn)：原因不明嚴(yán)重高膽紅素血癥患兒相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢查回報(bào)，找到明確病因者，予以剔除。收集患兒一般資料：性別、胎齡、分娩方式、出生體重、Apgar評(píng)分、日齡、喂養(yǎng)方式、生長(zhǎng)發(fā)育情況等。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。計(jì)量數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布方差齊性計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布或方差不齊計(jì)量資料采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)、百分比描述，分析采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2結(jié)果

2.1一般情況

在59例患兒中，難治組47例，非難治組12例。兩組間一般情況比較未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 基本資料比較Table 1 Comparison of basic

2.2兩組間基因突變類型分析

難治組中檢測(cè)到UGT1A1基因純合突變5例，全部均為G71R純合突變；檢測(cè)到雜合突變共29例，其中G71R雜合突變26例，突變頻率為65.957%(31/47)，為熱點(diǎn)突變點(diǎn)。26例G71R突變中21例不伴有UGT1A1基因其他位點(diǎn)突變。c.1091C>T,p.P364L雜合突變4例，突變頻率為8.511%(4/47)；檢測(cè)到c.529 T>C,p.Cys177Arg 雜合突變1例；檢測(cè)到c.1352C>T,p.P451L 雜合突變1例；檢測(cè)到c.456T>G,p.Tyr486Asp雜合突變 1例；發(fā)現(xiàn)2例c.536T>A,p.Leu179Gl雜合突變，這是既往未報(bào)道過(guò)的新的UGT1A1突變位點(diǎn)。8例未檢測(cè)到基因突變。

非難治組中檢測(cè)到UGT1A1基因純合突變2例，全部均為G71R純合突變。檢測(cè)到雜合突變共7例，其中G71R雜合突變6例，突變頻率為66.667%(8/12)，為熱點(diǎn)突變點(diǎn)；6例G71R突變中5例不伴有UGT1A1基因其他位點(diǎn)突變。c.1091C>T,p.P364L雜合突變1例，突變頻率為8.333%(1/12)；檢測(cè)到c.1352C>T,p.P451L 雜合突變1例；3例未檢測(cè)到突變。兩組間基因突變無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表2。

表2 兩組基因突變比較[n(%)]Table 2 Variance analysis of gene mutation between two groups[n(%)]

2.3 UGT1A1不同突變基因組比較

將UGT1A1突變分為無(wú)突變、純合突變、雜合突變?nèi)M，對(duì)比患兒一般情況，發(fā)現(xiàn)患兒入院日齡在無(wú)突變組與純合突變組之間有差異，F(xiàn)=4.4831，P<0.05；患兒出院黃疸值在純合突變組和雜合突變組之間有差異，F(xiàn)=3.4423，P<0.05，見(jiàn)表3。

表3 不同基因組的患兒一般資料比較Table 3 Comparison of general information among children of different gene

注：*無(wú)突變組與純合突變組比較，P<0.05；**純合突變組與雜合突變組比較，P<0.05。

3討論

UGT1A1是膽紅素在肝臟結(jié)合的關(guān)鍵酶，可使膽紅素與葡萄醛酸結(jié)合形成結(jié)合膽紅素，UGT1A1缺陷可導(dǎo)致非溶血性高未結(jié)合膽紅素血癥。UGT1酶的編碼基因定位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂37區(qū)8帶(2 q 378)，它由4個(gè)共同外顯子和1個(gè)多變的第一外顯子構(gòu)成，UGT1A1就是由第一外顯子A1和4個(gè)共同外顯子(2～5外顯子)組成的復(fù)合體。UGT1A1啟動(dòng)子是一非編碼區(qū)，它存在于上游調(diào)節(jié)區(qū)，有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，它包含TATA盒，可精確調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列。純合子UGT1A1基因啟動(dòng)子(TA)7TAA突變可導(dǎo)致酶的活性明顯下降，這種UGT1A1基因啟動(dòng)序列多態(tài)性變化與白種人和亞洲馬來(lái)西亞新生兒高膽紅素血癥相關(guān)，但日本人和中國(guó)臺(tái)灣新生兒高膽紅素血癥卻與UGT1A1基因Gly71Ary突變(UGT1A1基因第一外顯子211位核苷酸G被A替代，導(dǎo)致71位氨基酸Gly被Arg取代)相關(guān)，表明與新生兒高膽紅素血癥相關(guān)的UGT1A1基因突變的位點(diǎn)，不同種族之間存在差異[2]。

3.1兩組間基因突變類型分析

本研究發(fā)現(xiàn)難治組與非難治組嚴(yán)重高膽紅素血癥新生兒中G71R突變頻率分別為65.957%和66.667%，提示我國(guó)嚴(yán)重高膽紅素血癥漢族新生兒UGT1A1基因中仍以G71R突變?yōu)橹?。有研究發(fā)現(xiàn)，在日本、韓國(guó)、中國(guó)等亞洲國(guó)家黃疸新生兒中的G71R是最常見(jiàn)的UGT1A1突變類型，G71R多態(tài)性位點(diǎn)的純合突變和雜合突變可使轉(zhuǎn)移酶活性下降[3]。這與本研究結(jié)果一致。

決定高膽紅素血癥不良預(yù)后的是膽紅素腦病[4]。該病不僅可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，甚至可導(dǎo)致死亡。胎齡>35周新生兒血清總膽紅素(serum total bilirubin,TSB)水平在342～427μmol/L時(shí)有核黃疸病例報(bào)道，G-6-PD缺乏癥患兒黃疸出現(xiàn)時(shí)間早、進(jìn)展快，膽紅素峰值高，且易并發(fā)膽紅素腦病[5]，足月兒TSB水平達(dá)427μmol/L時(shí)即高度提示可能發(fā)生高膽紅素血癥，需行頭顱MRI及腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位等檢查。目前，越來(lái)越多的研究開(kāi)始探究重度及極重度高膽紅素血癥的突變基因類型。

3.2本研究的必要性和局限性

大部分病理性黃疸如能及時(shí)去除病因、給予光療或者換血，預(yù)后較好。在臨床工作中，經(jīng)常遇到經(jīng)過(guò)光療后黃疸消退效果不佳及黃疸退而復(fù)現(xiàn)的新生兒，對(duì)于這一部分難治性嚴(yán)重高膽紅素血癥新生兒，一旦形成膽紅素腦病，后果嚴(yán)重。故及時(shí)尋找病因，積極預(yù)防，早期干預(yù)及治療尤為重要。本研究對(duì)比了難治性嚴(yán)重高膽紅素血癥新生兒和非難治性高膽紅素血癥新生兒基因突變類型及發(fā)生率，未發(fā)現(xiàn)顯著差異。因時(shí)間及條件限制，本次研究樣本量仍太小，故兩組間是否存在差異，仍需進(jìn)一步研究。雖然本研究對(duì)比難治性與非難治性嚴(yán)重高膽紅素血癥新生兒一般情況及基因突變類型未發(fā)現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但我國(guó)人口眾多、民族豐富，構(gòu)成了基因多態(tài)性的豐富資源。了解種族背景、家族史以及相關(guān)的基因?qū)W研究，對(duì)早期新生兒嚴(yán)重高膽紅素血癥的篩查和治療是非常有必要的。

3.3新的突變位點(diǎn)及未來(lái)研究方向

在本研究中還發(fā)現(xiàn)2例新的UGT1A1基因突變位點(diǎn)，c.536T>A,p.Leu179Gl雜合突變，既往國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未曾報(bào)道此位點(diǎn)基因突變與新生兒高膽紅素血癥的相關(guān)性，是否為新生兒高膽紅素血癥致病基因突變還有待進(jìn)一步研究論證。除此之外，Watchko[6]研究發(fā)現(xiàn)G6PD、UGT1A1、OATP2等基因均可能是引起嚴(yán)重高膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素。2009年Boony等認(rèn)為G6PD突變而非G-6-PD酶活性水平的改變是嚴(yán)重高膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素。Azlin等于2011年研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1是獨(dú)立于G6PD缺乏之外的馬來(lái)西亞人群嚴(yán)重高膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素，但其是否增加其他遺傳因素的風(fēng)險(xiǎn)并不明確。盡管本研究納入的病例已排除G-6-PD酶活性異常的新生兒，但尚需對(duì)G6PD、OATP2等基因的改變進(jìn)一步分析研究。這也是未來(lái)工作研究的重點(diǎn)。

[1]李軍,李貴南,吳運(yùn)芹,等.膽紅素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因突變類型與新生兒高膽紅素血癥的相關(guān)性分析[J].中國(guó)新生兒科雜志,2016,31(1):28-31.

[2]石航婷,龍雋,鄧俊彪,等.UGT1A1基因多態(tài)性分析與新生兒高膽紅素血癥的關(guān)系[J].中國(guó)新生兒科雜志,2013,28(1):21-24.

[3]Yu Z,Zhu K,Wang L,etal.Association of neonatal hyperbilirubinemia with UGT1A1 gene polymorphisms: a meta-analysis[J].Med Sci Monit,2015,21:3104-3114.

[4]Canu G,Minucci A,Zuppi C,etal.Gilbert and Crigler Najjar syndromes: an update of the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) gene mutation database[J].Blood Cells Mol Dis,2013,50(4):273-280.

[5]鐘元枝,劉玲,肖體海,等.新生兒G-6-PD缺乏癥合并高膽紅素血癥的臨床分析[J].中國(guó)婦幼健康研究,2017,28(1):69-71,80.

[6]Watchko J F.Genetics and pediatric unconjugated hyperbilirubinemia[J].J Pediatr,2013,162(6):1092-1094.

[專業(yè)責(zé)任編輯：艾 婷]