浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

胃潰瘍是一種常見的慢性疾病，自然人群中發(fā)病率高達(dá)10%。日常生活中人們對(duì)乙醇（酒精）的濫用，是胃潰瘍高發(fā)的重要誘因之一。濫用乙醇后，可誘導(dǎo)機(jī)體合成、分泌活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，攻擊細(xì)胞基本成分如蛋白質(zhì)、核酸等[1-2]，一方面誘導(dǎo)磷脂膜中脂肪酸的過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物、氧自由基及脂質(zhì)分解產(chǎn)物等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生[3-4]，另一方面還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1,5-6]。目前對(duì)于胃潰瘍臨床上較多采取內(nèi)科保守治療手段，質(zhì)子泵抑制劑（如泮托拉唑）、胃黏膜保護(hù)劑、H2受體拮抗劑（如雷尼替?。┑仁侵委熚笣兊某Ｒ?guī)藥物[7-8]。這些西藥治療胃潰瘍的近期療效較為理想，但難以根治，停藥后胃潰瘍極易復(fù)發(fā)，服藥后部分患者還可能出現(xiàn)頭痛、腹瀉、惡心等不良反應(yīng)，對(duì)血腦屏障的完整性也有一定影響[9-10]。因此，胃潰瘍的根治及復(fù)發(fā)的預(yù)防仍是當(dāng)前研究領(lǐng)域的重要課題。

腹水草（Veronicastrum axillare,V.axillare）別名爬巖紅、多穗草等，為玄參科腹水草屬草本植物，微寒，味苦，歸腎、脾、肝經(jīng)[11]。主要功效有緩解小便不利、逐水消腫等。其水煎劑在民間和臨床上用于治療胸腔積液[12]、腎炎[13]、肝硬化腹水[14]和胃潰瘍[15-16]等。本課題組的前期研究結(jié)果表明，腹水草水提液對(duì)無水乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷具有顯著的保護(hù)作用[15-19]；大鼠含藥血清對(duì)5%乙醇損傷的GES-1細(xì)胞亦具有顯著的保護(hù)作用[15]。本文直接用腹水草水提液預(yù)處理GES-1細(xì)胞，探討其對(duì)GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為腹水草的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 腹水草水提液的制備 腹水草全草采自浙江縉云，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)姚振生教授鑒定為玄參科腹水草屬植物腹水草（V.axillare）。將腹水草全草陰干至恒重、粉碎，過80目篩，取100g腹水草粉末，以8倍體積的蒸餾水浸泡30min，采用回流的方法進(jìn)行提取，每次1.5h，重復(fù)3次，合并濾液，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，減壓濃縮至100mL，即得到濃度為1 g·mL-1的腹水草水提液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1細(xì)胞購(gòu)于南京市科佰生物科技有限公司（批號(hào)：CBP60512）；雷尼替丁膠囊購(gòu)于上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司（批號(hào)：17101204），使用時(shí)采用雙蒸水配制成1 g·mL-1的溶液，4℃保存?zhèn)溆?；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone公司（批號(hào)：AC10253805）；胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司（批號(hào)：20170315）；0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：c0203）；磺酰羅丹明 B（sulforhodamine B，SRB）購(gòu)于上海研拓生物科技有限公司（批號(hào)：20223EAV）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)于 Sigma公司（批號(hào)：20170424）；Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司（批號(hào)：6301518）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Thermo3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）、3K15型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）、Multiskan Flash型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、Q5000型微量紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)Quawell公司）、TE2000-S型倒置熒光相差顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 GES-1細(xì)胞的傳代培養(yǎng) GES-1細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用含 10%FBS、1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸消化后傳代。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 腹水草水提液和雷尼替丁對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL接種于 96孔板，每孔 100μL，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞貼壁后，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分為正常組、腹水草水提液不同劑量組（5、10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120、10 240、20 480、40 960 μg·mL-1）、雷尼替丁不同劑量組（2.8、5.6、11.25、22.5、45、90、180、360、720、1 440、2 880、5 760、11 520、23 040 μg·mL-1），每組 6 個(gè)復(fù)孔。正常組加入100μL不含藥物的DMEM培養(yǎng)基，其余各組分別加入100μL含相應(yīng)劑量藥物的DMEM培養(yǎng)基。待培養(yǎng)48h后，棄去原培養(yǎng)基，采用SRB法檢測(cè)細(xì)胞存活率。每孔加入10%三氯乙酸100μL，4℃固定1h，蒸餾水沖洗5遍，自然晾干后，每孔加入0.57 mg·mL-1SRB溶液，室溫下染色30min，棄去SRB溶液，用1%醋酸沖洗5遍，自然晾干。每孔再加入10 μmol·L-1的Tris-base溶液100μL，待結(jié)晶體完全溶解，酶標(biāo)儀515mm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的OD。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD/正常組OD×100%；選擇細(xì)胞存活率＞90%的藥物濃度作為最大安全濃度（maximum non-toxic concentration，TC0）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算腹水草水提液和雷尼替丁對(duì)GES-1細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.4.3 腹水草水提液對(duì)乙醇損傷GES-1細(xì)胞存活率的影響 細(xì)胞的接種和培養(yǎng)方法同1.4.2。將細(xì)胞分為正常組，模型組，雷尼替丁組，腹水草水提液低、中、高劑量組（具體劑量根據(jù)1.4.2的結(jié)果確定），每組6個(gè)復(fù)孔。正常組及模型組加入100μL不含藥物的DMEM培養(yǎng)基。雷尼替丁組加入100μL含45 μg·mL-1雷尼替丁的DMEM培養(yǎng)基，腹水草水提液低、中、高劑量組則分別加入含 20、40、80 μg·mL-1腹水草水提液的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)基，除正常組加入100μL DMEM培養(yǎng)基以外，其余各組每孔加入100μL含5%乙醇的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)4h后，SRB法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算公式同1.4.2。

1.4.4 腹水草水提液對(duì)乙醇損傷GES-1細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES-1細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL的數(shù)量接種于6孔板，每孔2mL，于37℃、5%CO2孵育，待細(xì)胞鋪滿單層后，棄去上清液，將細(xì)胞分為正常組，模型組，雷尼替丁組，腹水草水提液低、中、高劑量組。正常組和模型組分別加入2mL DMEM培養(yǎng)基，其余各組分別加入2mL含雷尼替丁、各劑量腹水草水提液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，棄去原培養(yǎng)液，除正常組加入2mL DMEM培養(yǎng)基外，其余各組每孔加入2mL含5%乙醇的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，以不含EDTA的胰酶進(jìn)行消化，吹打細(xì)胞，1 000r/min，4℃離心5min，棄去上清液，加入1mL預(yù)冷的PBS（pH=10.5），清洗細(xì)胞 2次，輕輕震蕩懸浮細(xì)胞，2 000r/min，4℃離心5min。將細(xì)胞重懸于200μL Binding Buffer，加入 5μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，室溫下避光孵育 15min。加入 5μL PI和 300μL Binding Buffer，1h內(nèi)以流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey HSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹水草水提液和雷尼替丁對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響 腹水草水提液劑量在5～160 μg·mL-1時(shí)，與正常組比較，GES-1細(xì)胞的存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)劑量≥320 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率均顯著低于正常組（P＜0.01），且呈劑量依賴性。見表1。其 TC0和 IC50分別為 160 μg·mL-1和 5 096 μg·mL-1。當(dāng)雷尼替丁劑量在 2.8～180 μg·mL-1時(shí)，GES-1 細(xì)胞的存活率顯著高于90%（P＜0.05或P＜0.01）；當(dāng)其劑量≥360 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞的存活率顯著低于正常組（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。見表1。其TC0和 IC50分別為 180 μg·mL-1和 5 396 μg·mL-1。根據(jù)藥物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將腹水草水提液低、中、高劑量分別確定為 20 μg·mL-1、40 μg·mL-1和 80 μg·mL-1；雷尼替丁劑量為 45 μg·mL-1。

表1 腹水草水提液和雷尼替丁對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響Tab.1 Effects of V.axillare water extract and Ranitidine on survival rates of GES-1 cells

2.2 各組GES-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察，正常組細(xì)胞呈致密單層貼壁生長(zhǎng)，梭形，排列緊密，漂浮的細(xì)胞極少；模型組細(xì)胞大量皺縮，變圓，各細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞間的連接減少，大量細(xì)胞彼此分離，漂浮的細(xì)胞顯著增多；雷尼替丁組大部分細(xì)胞呈致密性生長(zhǎng)，各細(xì)胞間隙小，細(xì)胞間連接緊密；腹水草水提液低、中、高劑量組隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)逐漸接近于正常組。見圖1。

圖1 各組GES-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（10×）Fig.1 Morphological observation of GES-1 cells in each group(10×)

2.3 各組GES-1細(xì)胞存活率比較 與正常組相比，模型組、雷尼替丁組和腹水草水提液低劑量組的細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01或 P＜0.05），腹水草水提液中、高劑量組的細(xì)胞存活率與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，雷尼替丁組及腹水草水提液低、中、高劑量組細(xì)胞存活率均顯著升高（P＜0.01）。腹水草水提液中、高劑量組細(xì)胞的存活率均顯著高于雷尼替丁組和低劑量組（P＜0.01或P＜0.05）。見表 2。

2.4 各組GES-1細(xì)胞凋亡率比較 正常組GES-1細(xì)胞的早期凋亡率為（1.45±0.05）%，5%乙醇作用4h后，模型組細(xì)胞凋亡率顯著高于正常組（P＜0.01）；低、中、高劑量腹水草水提液預(yù)處理48h后，細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組（P＜0.01），并呈劑量依賴性；其中腹水草水提液高劑量組GES-1細(xì)胞的凋亡率最低，與腹水草水提液低、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但與正常組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。雷尼替丁組的細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組和腹水草水提液低劑量組（P＜0.01或 P＜0.05），但與腹水草水提液中、高劑量組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表 2、圖 2。

表2 各組GES-1細(xì)胞存活率和凋亡率比較Tab.2 Comparison of the survival rate and apoptosis rate of GES-1 cells in each group

圖2 各組GES-1細(xì)胞凋亡率檢測(cè)Fig.2 Apoptosis rate of GES-1 cells in each group

3 討論

胃黏膜保護(hù)受到人們的日益關(guān)注，當(dāng)胃受到一定程度的損傷刺激時(shí)，胃黏膜立即啟動(dòng)自我防御與修復(fù)功能，這是胃黏膜自身抵抗疾病的一種特殊屏障。胃黏膜損傷后的修復(fù)是一個(gè)比較復(fù)雜、受多種因素影響的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程。乙醇具有脂溶性的特點(diǎn)，大量、高濃度的乙醇可直接引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和血流停滯，使組織細(xì)胞缺氧、缺血，從而導(dǎo)致胃黏膜組織損傷[18-19]。西藥治療胃黏膜損傷雖然在短期內(nèi)可以達(dá)到良好的效果，但難以根治，停藥后易復(fù)發(fā)[8-9]，因此患者容易對(duì)西藥產(chǎn)生依賴性和耐藥性，而且西藥存在一些毒副作用，如引起精神錯(cuò)亂、定向力障礙、幻覺、譫妄等[10]，還可能導(dǎo)致黃疸和肝臟損害[9]，限制了其在臨床上的應(yīng)用。傳統(tǒng)中藥具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性、多靶點(diǎn)治療等優(yōu)勢(shì)[20-24]，從而得到越來越多的使用。

本項(xiàng)目組的前期研究表明，腹水草水提液對(duì)大鼠乙醇型胃潰瘍具有拮抗作用，能顯著抑制胃液和胃酸分泌、降低胃蛋白酶活性，減少自由基生成，促進(jìn)氧自由基的清除，抗脂質(zhì)過氧化，減輕炎癥反應(yīng)等，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)胃黏膜的保護(hù)和修復(fù)[15-16,18-19]。對(duì)SD大鼠進(jìn)行腹水草水提液灌胃給藥后，大鼠含藥血清對(duì)乙醇損傷的GSE-1細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與減輕炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[15]。為了明確腹水草水提液在體外對(duì)GES-1細(xì)胞是否具有毒副作用，同時(shí)進(jìn)一步明確其保護(hù)GES-1細(xì)胞的有效成分是其天然成分還是經(jīng)動(dòng)物消化吸收后的代謝產(chǎn)物，項(xiàng)目組設(shè)計(jì)了本研究。本研究結(jié)果表明，在 5～160 μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，腹水草水提液對(duì)GES-1細(xì)胞無毒性，但當(dāng)劑量達(dá)到320 μg·mL-1及以上時(shí)，卻顯著降低細(xì)胞的存活率。這可能是由于增大劑量后，腹水草水提液中的某些成分對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖具有毒性作用，但具體有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，加入5%乙醇培養(yǎng)4h后，GES-1細(xì)胞的存活率為52.26%，這一結(jié)果與以往的研究一致[25]，表明乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型造模成功。用含腹水草水提液的培養(yǎng)基預(yù)處理GES-1細(xì)胞48h，能夠顯著降低乙醇對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響，尤其是腹水草水提液中、高劑量組細(xì)胞的存活率均顯著高于雷尼替丁組。這不僅在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了腹水草水提液對(duì)GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用，同時(shí)說明中、高劑量腹水草水提液對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用優(yōu)于雷尼替丁，而且還證明腹水草水提液中存在保護(hù)GES-1細(xì)胞的天然活性成分，具體成分還有待于深入研究加以明確。

細(xì)胞凋亡是一種ATP依賴性的并由細(xì)胞嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡。在正常情況下，機(jī)體通過細(xì)胞凋亡來消除體內(nèi)過量、冗余、老化和不健康的細(xì)胞以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定[26]。乙醇引起的胃黏膜損傷主要包括由于過度飲酒誘發(fā)的胃潰瘍、胃黏膜應(yīng)激性損傷、胃出血等，在臨床上表現(xiàn)為腹部疼痛、脹滿、嘔吐、燒心等癥狀[1]。以往研究表明，乙醇能夠誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，且具有濃度依賴性，但該誘導(dǎo)作用具有時(shí)效性，持續(xù)60min后會(huì)逐漸減弱，這可能與乙醇的揮發(fā)性有關(guān)。乙醇的揮發(fā)導(dǎo)致局部濃度逐漸下降，不足以長(zhǎng)時(shí)間抑制細(xì)胞的自我修復(fù)能力。因此在實(shí)驗(yàn)過程中需要及時(shí)補(bǔ)充乙醇（刺激劑）或者加大給藥的初始劑量，以確保促凋亡作用的持續(xù)性[1]。既往研究證明，乙醇濃度達(dá)到3%時(shí)即可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的損傷和誘導(dǎo)凋亡作用，但由于乙醇易揮發(fā)的特性，3%乙醇作用持續(xù)時(shí)間較短，對(duì)細(xì)胞的損傷和誘導(dǎo)凋亡作用有限[1]。本實(shí)驗(yàn)為確保乙醇造模條件的穩(wěn)定及具有重復(fù)性，參考李洪亮等的研究[25]，確定以5%乙醇作用4h作為GES-1細(xì)胞損傷的造模條件。結(jié)果顯示，5%乙醇誘導(dǎo)4h后，顯著抑制GES-1細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞的凋亡率上升至22.87%，這一結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致[27]。本研究結(jié)果顯示，腹水草水提液具有降低乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡的作用，但其有效成分和具體的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，在 5～160 μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，腹水草水提液對(duì)GES-1細(xì)胞無毒性。在2.8～180 μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，雷尼替丁亦對(duì)GES-1細(xì)胞無毒性，其中在 5.6～22.5 μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，雷尼替丁可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但當(dāng)劑量≥360 μg·mL-1時(shí)，對(duì)GES-1細(xì)胞具有損傷作用。腹水草水提液呈劑量依賴性地提高乙醇損傷GES-1細(xì)胞的存活率，并降低其凋亡率，且其作用優(yōu)于雷尼替丁，尤其是腹水草水提液中、高劑量組作用較明顯，但具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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