劉世旭 王慶 方珍珍 常藕琴 曾偉偉 黃志斌

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2. 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

隨著社會(huì)生活水平的提高，人們對(duì)于水產(chǎn)品的需求量的日益增多，隨之帶來(lái)的是水產(chǎn)行業(yè)的迅猛發(fā)展。但是，在養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)的一些問(wèn)題諸如病害頻發(fā)、藥物殘留以及由此帶來(lái)的水域污染問(wèn)題都嚴(yán)重制約著水產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展，在臨床上需要一種經(jīng)濟(jì)適用、可持續(xù)發(fā)展的疾病防控方法，免疫防控技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

1942年，Duff 首次將殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）的滅活口服疫苗應(yīng)用于硬頭鱒并獲得成功后，開創(chuàng)了水產(chǎn)疫病防控的新紀(jì)元。20世紀(jì)70年代，荷蘭英特威公司使用福爾馬林來(lái)滅活細(xì)菌，制造出細(xì)菌性滅活疫苗，通過(guò)注射和浸泡的方式來(lái)防治鮭魚弧菌病和腸紅嘴病。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種疫苗能夠有效抑制弧菌病的發(fā)生和傳播，給北美的鮭魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的成功［1］。1988年，挪威法瑪克公司在歐洲成功研制出一種細(xì)菌滅活疫苗用于防治冷水魚弧菌病，此舉為挪威的三文魚養(yǎng)殖業(yè)挽回了巨大的經(jīng)濟(jì)損失；1991年，該公司又開發(fā)出世界上第一例防治疥瘡病的細(xì)菌滅活魚疫苗并推向市場(chǎng)，這一疫苗因其良好的疾病防治效果，最后成功獲得了歐洲的商業(yè)許可［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，到2012年年底，全球商業(yè)化生產(chǎn)的水產(chǎn)疫苗數(shù)量已經(jīng)有140多種［2］。但口服疫苗由于免疫保護(hù)率偏低，成本較高，占據(jù)的比例很小，到2013年底，國(guó)外主要的商品化漁用疫苗產(chǎn)品中僅有傳染性胰臟壞死病毒亞單位疫苗和傳染性三文魚貧血病毒亞單位疫苗通過(guò)口服進(jìn)行接種。而中國(guó)僅獲得新獸藥證書的5種水產(chǎn)疫苗中，沒有一種是口服疫苗。本文綜述了水產(chǎn)口服疫苗的研究進(jìn)展，旨為研究安全高效并且成本低廉的新型口服疫苗提供一定的參考信息。

1 水產(chǎn)疫苗的概況

我國(guó)的水產(chǎn)疫苗研究工作開展得比較晚，始于上世紀(jì)50年代草魚出血病土法疫苗研究，但是進(jìn)步緩慢［3］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)研究的水產(chǎn)疫苗種類達(dá)50余種，涉及病原近30種，但獲得國(guó)家新獸藥證書的水產(chǎn)疫苗只有5種，獲得生產(chǎn)批文的水產(chǎn)疫苗僅有草魚出血病活疫苗與嗜水氣單胞菌滅活疫苗2種，與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家還存在較大差距［4-5］。

2 水產(chǎn)疫苗的接種方式

水產(chǎn)疫苗的常用接種方式主要有浸泡、注射和口服。水產(chǎn)疫苗的注射接種主要分為肌肉注射和腹腔注射兩種方式。肌肉注射主要用于DNA疫苗等核酸疫苗的接種，而腹腔注射主要用于傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒疫苗的接種［6］。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)主要有兩類疫苗獲得批準(zhǔn)：一類是減毒疫苗，其典型代表是草魚出血病弱毒疫苗；另一類是傳統(tǒng)滅活疫苗，其代表主要有魚嗜水氣單胞菌滅活疫苗等。這些疫苗主要通過(guò)對(duì)魚體進(jìn)行腹腔注射從而使魚體產(chǎn)生免疫能力［5］。注射免疫可保證免疫個(gè)體數(shù)量和疫苗劑量的準(zhǔn)確性，并能同時(shí)免疫多種抗原，減少注射的次數(shù)［7］。但是采用注射這種疫苗接種方式在實(shí)際生產(chǎn)和臨床試驗(yàn)上也存在一定的缺陷：首先，這種免疫方式對(duì)體型小的魚并不適用；其次，其接種方式費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)于大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)工作量巨大；同時(shí)，由于操作人員的水平差異也會(huì)對(duì)魚體造成不同程度的傷害。此外，有時(shí)伴隨疫苗注射使用的麻醉劑會(huì)影響魚群的生命活動(dòng)［8］。

浸泡免疫又分為4種方式，包括直接浸泡、高滲浸泡、噴霧和浸?。?］。浸泡免疫這一方式適用于體型較小的魚類，省時(shí)省力，但是這種疫苗接種方式的缺點(diǎn)是抗原的需要量大，并且容易使魚群產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)。近年來(lái)，有研究者將超聲波和浸泡免疫結(jié)合起來(lái)，可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞滲透性來(lái)加強(qiáng)免疫的效果。

口服疫苗被認(rèn)為是水產(chǎn)疫苗最具可操作性的免疫方式，主要考慮到水生動(dòng)物生活環(huán)境離不開水體，并且養(yǎng)殖數(shù)量較大。這種疫苗接種方式幾乎適用于所有規(guī)格的魚類，采取拌入飼料口服的方式，省時(shí)省力，但口服疫苗因?yàn)槊庖唪~體數(shù)量和疫苗劑量不能得到有效保證，抗原易受消化道的影響，從而使其提供的免疫保護(hù)力在目前低于注射免疫。

3 口服疫苗的作用機(jī)制

魚類的腸道黏膜分為兩個(gè)部分：上皮層和固有層［9］。在所有生物體內(nèi)，黏膜表面是病原體進(jìn)入的主要部位［10］，而黏膜表面覆蓋有免疫增強(qiáng)黏液的保護(hù)層，此保護(hù)層作為防御病原體的第一道防線，魚的黏液中含有多種與免疫相關(guān)的因素如凝集素、黏蛋白、抗菌肽、毒素、免疫球蛋白等［11］。通常認(rèn)為魚類口服疫苗免疫主要以黏膜免疫為主，它在魚類疾病的防御過(guò)程中起著主導(dǎo)作用，但是目前對(duì)于黏液免疫作用機(jī)制的研究并不是特別清晰。

魚類沒有器官化的淋巴結(jié)或者淋巴集結(jié)，而只有彌散性的腸道淋巴組織，這是一種在功能上與哺乳類不同的組織［12］，但是魚類卻有大量的淋巴細(xì)胞，由淋巴產(chǎn)生的免疫球蛋白能夠抵御病原體和防止共生細(xì)菌進(jìn)入上皮細(xì)胞［13］。

在單克隆抗體技術(shù)的支持下，Companjen等［14］在舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）的腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了淋巴組織，并且還發(fā)現(xiàn)舌齒鱸的淋巴細(xì)胞的數(shù)量從消化道到肛門呈現(xiàn)明顯的數(shù)量梯度上升趨勢(shì)。這種現(xiàn)象表明，后腸比其他任何腸道部位能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，推測(cè)口服疫苗主要在后腸發(fā)揮作用。由于抗原呈遞效率的不穩(wěn)定性，以及疫苗容易受到魚類胃腸黏膜系統(tǒng)中的各種消化酶的影響，口服疫苗產(chǎn)生的免疫效果并不如理想條件下的好。一般認(rèn)為，口服疫苗的效果不如肛門灌注，這是由于口服疫苗在消化道中受到消化酶的降解或破壞，使到達(dá)后腸的抗原達(dá)不到發(fā)揮預(yù)期免疫效果的數(shù)量要求［15］。

為了避免這種現(xiàn)象，研究者們運(yùn)用各種手段和技術(shù)使口服疫苗免受胃酸和腸道中各類消化酶的影響，從而保障其免疫效果，同時(shí)減緩疫苗中抗原物質(zhì)的釋放，使之持續(xù)釋放抗原物質(zhì)，以產(chǎn)生更大程度的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

4 口服疫苗的種類

由于口服疫苗需要激發(fā)局部或者全身的免疫應(yīng)答，這些疫苗在到達(dá)發(fā)生免疫反應(yīng)的組織之前，抗原需要被保護(hù)，以防受到破壞，影響免疫效果［16］。實(shí)驗(yàn)表明，高濃度的胃酸可能在口服疫苗到達(dá)腸道淋巴組織之前就使之變性或失去活性［17］，腸道內(nèi)蛋白酶的存在，一部分抗原會(huì)受到蛋白酶的降解［18］。由于口服疫苗可能會(huì)在魚類消化系統(tǒng)內(nèi)被降解，或當(dāng)拌入飼料中時(shí)，也可能與飼料中的成分互相作用，影響飼料的適口性甚至影響疫苗本身應(yīng)有的免疫效果。因此，口服疫苗需要得到妥善的保護(hù)，盡量避免疫苗的裸露，使之能更好地發(fā)揮免疫效果［19］。

4.1 佐劑疫苗

免疫佐劑是指一種能夠增強(qiáng)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)，但其本身并不會(huì)引起任何特定的反應(yīng)，它是一類免疫類增強(qiáng)劑［20］。到目前為止，用作疫苗佐劑的常見材料有聚合微球體、生物被膜、抗原成分和細(xì)胞因子，有的菌體有時(shí)也可以作為疫苗的佐劑［21］。

4.1.1 聚合微球體 常見的聚合微球體的包裹材料主要有海藻酸鹽、殼聚糖還有脂質(zhì)體等，這類疫苗有時(shí)也被稱為微囊疫苗。抗原成分可以是全病原、重組表達(dá)的蛋白或者核酸。

Romalde等［22］用福爾馬林滅活格氏乳球菌（Lactococcus garvieae），由海藻酸鈉丙酮微粒包裹疫苗用以口服免疫虹鱒魚。在口服疫苗1-24 h后，在胃和小腸中檢測(cè)到該種藻酸鹽微球完好無(wú)損。同時(shí)，在用肛門插管法接種該種疫苗16-24 h后，也能在后腸檢測(cè)到海藻酸鹽微粒。這一結(jié)果表明海藻酸鈉丙酮微粒能夠有效抵抗消化道中的低pH環(huán)境和各種蛋白酶的降解。腹腔注射疫苗口服海藻酸鈉丙酮微粒疫苗和無(wú)包裹的的疫苗，攻毒結(jié)果顯示，三者的相對(duì)存活率分別為83.3%、50%和7%，說(shuō)明雖然口服疫苗的免疫效果不如注射疫苗，但實(shí)驗(yàn)中海藻酸鹽可有效保護(hù)疫苗，有效提高免疫效果。余俊紅等［23］分別將全細(xì)胞濃縮疫苗和微膠囊疫苗拌料投喂鱸魚魚苗，免疫一周后，進(jìn)行注射攻毒，結(jié)果表明兩組的免疫保護(hù)力分別為51%和56.2%，而對(duì)照組的死亡率高達(dá)95%，這表明微膠囊疫苗可以提高抗原的保護(hù)性。孫翰昌等［24］用生物可降解材料聚丙烯酸樹脂來(lái)制備腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas punctata f.intestinalis）的微粒疫苗，并用其口服免疫草魚。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，佐劑疫苗、全菌疫苗和微粒疫苗的免疫保護(hù)率分別為71.4%、66.7%和52.4%。

除了全病原抗原外，包裹重組表達(dá)的蛋白，也是常見的口服疫苗抗原類型。Caruffo等［25］利用釀酒酵母同時(shí)表達(dá)血凝素酯酶（Hemagglutinin-esterase，HE）病毒的表面蛋白與鮭魚貧血病毒（ISAV）毒株F蛋白的保守區(qū)域，包裹在一個(gè)陽(yáng)離子多糖基質(zhì)膠囊里。將該疫苗混入三文魚配合餌料中，疫苗組的存活率高達(dá)66.7%。任燕等［26］用殼聚糖-海藻酸鈉包裹哈維氏弧菌（Vibrio harveyi，Vh）重組外膜蛋白OmpK，制備復(fù)合微囊疫苗，口服免疫斜帶石斑魚，口服微囊疫苗組的RPS（相對(duì)存活率）達(dá)到62.5%，高于OmpK 蛋白組（P＜0.01）。Dubey等［27］將遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）的外膜蛋白A包裹在殼聚糖納米微粒（NP）中，形成納米微粒重組外殼蛋白（np-rOMP），免疫纓野鯪（Labeo fimbriatus），以滅活全細(xì)胞大腸桿菌（iwc-nt）疫苗、空納米微粒疫苗作為對(duì)照組。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示nprOMP疫苗組、iwc-nt疫苗組、空疫苗組的存活率分別為73.3%、48.28%和為23.33%。表明np-rOMP疫苗較iwc-nt疫苗能在魚體內(nèi)產(chǎn)生更高的免疫水平，從另一方面也說(shuō)明了殼聚糖微粒在疫苗呈遞過(guò)程中起的保護(hù)作用。

已經(jīng)證實(shí)，DNA疫苗可以提高魚體對(duì)疾病的防御能力，但是口服裸露的DNA疫苗的免疫效果并不理想。de las Heras等［28］將一種表達(dá)衣殼蛋白VP2基因的DNA疫苗包裹在海藻酸鈉微球內(nèi)避免其受到消化系統(tǒng)的影響，并用該疫苗免疫虹鱒魚。結(jié)果顯示，在接種該疫苗的早期，衣殼蛋白VP2基因在虹鱒魚的不同器官內(nèi)均有表達(dá)。該疫苗能誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，相較于在接種7-15 d后再接種空質(zhì)粒疫苗，該疫苗能提高魚體內(nèi)IFN的表達(dá)量，并且高達(dá)十幾倍。還有研究者也將重組DNA技術(shù)與微囊疫苗結(jié)合起來(lái)對(duì)魚類進(jìn)行口服免疫［29］。

4.1.2 生物被膜 生物被膜（Biofilm，BF）有時(shí)也被用作口服疫苗的佐劑。生物被膜是一些附著在生物或非生物表面的微生物細(xì)胞的聚集膜樣物，這些微生物附著的表面經(jīng)常被細(xì)胞外聚集物質(zhì)（Extracellular polymeric substances，EPSs）包裹，EPSs作為生物被膜中的微生物的保護(hù)屏障，可增強(qiáng)它們對(duì)環(huán)境壓力的耐受性，如干燥、滲透壓、紫外線輻射、消毒和抗生素治療等［30］。將生物被膜運(yùn)用在口服疫苗上，可以保護(hù)疫苗中的抗原成分在到達(dá)腸道淋巴組織的過(guò)程中免受消化液的影響，使其發(fā)揮應(yīng)有的免疫功能。

如丁詩(shī)華等［31］采用復(fù)乳揮發(fā)法制備含嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）被膜或滅活菌體的聚乳酸-乙醇酸共聚物（Poly-（1actide-co-glycolide），PLG）疫苗微粒，口服免疫草魚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，被膜疫苗微粒疫苗組、全菌疫苗微粒疫苗組及空微粒組在攻毒后的相對(duì)存活率分別為46.7%、36.7%和6.7%，被膜疫苗和全菌疫苗能使草魚對(duì)嗜產(chǎn)生水氣單胞菌一定的抵抗力。

4.1.3 抗原成分 Josepriya等［32］發(fā)現(xiàn)固定化抗原（iAg）可作為抗隱核蟲（Cryptocaryon irritans）感染的保護(hù)性抗原，并把熱休克蛋白70C（Hsp70C）作為固定化抗原疫苗的佐劑，可提高魚體對(duì)于隱核蟲感染的抗原免疫保護(hù)力。將iAg與Hsp70C的cDNA共同和相對(duì)獨(dú)立封裝在殼聚糖納米粒子中，作為抗隱核蟲感染的口服疫苗免疫石斑魚，攻毒試驗(yàn)表明，口服免疫32 d后含iAg和Hsp70C的疫苗組和含iAg的疫苗組RPS為100%；42 d后，含iAg和Hsp70C的疫苗組、含iAg的疫苗組RPS分別為51%，15%。Hsp70C作為固定化疫苗的佐劑能夠增強(qiáng)石斑魚對(duì)于隱核蟲感染的抗原免疫保護(hù)力。這類復(fù)合型疫苗成功地提高了石斑魚的存活率，這一結(jié)果對(duì)于制備防治隱核蟲感染的疫苗提供了一種新思路。

4.1.4 菌體成分 Chen等［33］發(fā)現(xiàn)鰻弧菌（V.anguillarum）可作為抗神經(jīng)壞死病毒（Nervous necrosis virus，NNV）亞單位口服疫苗的生物佐劑，同時(shí)鹵蟲幼體可作為該疫苗的載體。該實(shí)驗(yàn)以NNV的外殼蛋白作為抗原，鰻弧菌的熱休克蛋白60基因作為啟動(dòng)子，運(yùn)用基因重組技術(shù)，獲得重組外殼蛋白，將重組的鰻弧菌滅活并由鹵蟲幼體攜帶，陽(yáng)性對(duì)照為大腸桿菌口服疫苗組，口服免疫石斑魚。攻毒后，鰻弧菌疫苗組的RPS為51.3%，大腸桿菌口服疫苗組的RPS為23.1%，鰻弧菌作為該疫苗的生物佐劑起到了積極地輔助作用。

在制備佐劑疫苗時(shí)，并不僅限于一種佐劑材料的使用，可能同時(shí)使用兩種或兩種以上的佐劑材料，以保證更好的免疫效果。Rivas-Aravena等［34］用病毒的DNA復(fù)制酶（Ad）作為佐劑與滅活的ISAV（V）包裹在殼聚糖納米微粒（NP）中，連續(xù)7 d口服免疫三文魚。30 d后腹腔注射ISAV毒液進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，NP-V疫苗組可提供40.4%的免疫保護(hù)率，NP-V+NP-Ad疫苗組能提供77.9%的免疫保護(hù)率。這些數(shù)據(jù)表明實(shí)驗(yàn)中的DNA復(fù)制酶作為佐劑能提高三文魚的存活率，而DNA復(fù)制酶與NP結(jié)合更能顯著增強(qiáng)三文魚抵抗ISAV的免疫能力。

在這些佐劑材料中，微球可以使疫苗免受消化道各種酶類的影響，還可起到延緩釋放抗原的作用；而生物被膜也可以降低呈遞過(guò)程中消化液對(duì)疫苗中抗原成分的影響?？傮w來(lái)講，佐劑可以保護(hù)抗原成分使之更好地發(fā)揮免疫效應(yīng)［35］。但同時(shí)也存在一些問(wèn)題：首先，佐劑疫苗使用的生產(chǎn)材料大多價(jià)格昂貴、使用的劑量大而且需要對(duì)養(yǎng)殖生物進(jìn)行多次免疫，這一系列的因素使得佐劑疫苗的生產(chǎn)成本大大增加；其次，就目前對(duì)于水產(chǎn)口服佐劑疫苗的研究并未考慮水產(chǎn)生物的腸道黏膜免疫系統(tǒng)的特殊性，某些佐劑因子可能會(huì)引起黏膜免疫的非特異性反應(yīng)，降低了疫苗的使用效率［36］。因此，在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，另外一種疫苗——生物載體疫苗也廣泛應(yīng)用。

4.2 生物載體疫苗

生物載體疫苗也叫作活載體疫苗，是在基因工程技術(shù)的支持下，外源抗原成分借助非致病性的微生物得以表達(dá)的一種疫苗［37-38］。

口服疫苗通常是拌入餌料中或者用人工合成的材料進(jìn)行包裹，這樣就可能造成餌料的適口性不佳，導(dǎo)致疫苗的攝入量較低，不能達(dá)到預(yù)期的免疫效果［39］。為了解決這一問(wèn)題，許多研究者嘗試采用天然的生物餌料作為疫苗的載體來(lái)增強(qiáng)疫苗的攝入。已經(jīng)報(bào)道的生物載體包括鹵蟲、蠶蛹、益生菌及植物等。

余俊紅等［23］在用微膠囊疫苗口服免疫鱸魚時(shí)，對(duì)疫苗進(jìn)行了兩種形式的處理，即直接拌入飼料和鹵蟲攜帶。結(jié)果表明，相較于其他疫苗，鹵蟲攜帶生物微膠囊疫苗能夠在鱸魚魚體內(nèi)發(fā)揮最好的免疫效果，其對(duì)應(yīng)的疫苗組在一周內(nèi)的相對(duì)存活率高達(dá)75%；直接口服的微膠囊疫苗次之，其疫苗組一周的相對(duì)存活率約為63%。這一現(xiàn)象表明口服生物-載體疫苗的免疫保護(hù)率優(yōu)于直接口服微囊疫苗。

魏克強(qiáng)等［40］通過(guò)基因重組技術(shù)研制白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）重組囊膜蛋白亞單位疫苗，其成分為受到重組桿狀病毒HyNPV-Vp28和HyNPV-Vp19感染的家蠶蛹的勻漿，口服免疫克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）長(zhǎng)達(dá)75 d，在免疫35 d后分別進(jìn)行口服和注射攻毒實(shí)驗(yàn)，觀察蝦體在接種疫苗后對(duì)WSSV的抵抗能力。結(jié)果表明，口服攻毒實(shí)驗(yàn)后，rVp28、rVp28+ rVp19疫苗組的RPS分別達(dá)到63.16%、68.42%，與對(duì)照組相比具有較好的免疫效應(yīng)，說(shuō)明這種類型的重組蛋白亞單位疫苗可有效提高克式原螯蝦的免疫能力。

任鵬麗等［41］用枯草桿菌作為表達(dá)草魚呼腸孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV）衣殼蛋白VP4的載體，并以此制備口服疫苗。用含有重組芽孢CotCVP4的疫苗口服免疫草魚，以口服CotC空載質(zhì)粒組作為陰性對(duì)照，以注射草魚出血病商品疫苗組為陽(yáng)性對(duì)照。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，在兩周以內(nèi)，陰性對(duì)照組的死亡率均高達(dá)90%以上，陽(yáng)性對(duì)照組僅為10%，而口服重組芽孢疫苗組分別為45%和60%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，生物載體口服疫苗的免疫效果雖然不如注射疫苗的效果好，但是也能夠使草魚魚體對(duì)GCRV產(chǎn)生一定的疾病免疫能力。

張毅等［42］利用PCR重疊延伸技術(shù)將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT序列與WSSV的vp28基因融合，以原核宿主大腸桿菌作為表達(dá)載體，表達(dá)TAT-VP28融合蛋白?？诜庖呖耸显r（Procambarus clarkii），分別連續(xù)免疫7 d和14 d后，進(jìn)行WSSV攻毒實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 d內(nèi)對(duì)照組的死亡率超過(guò)90%，VP28、TAT-VP28蛋白疫苗組的死亡率分別為36.7%、43.3%；50.0%和60%。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于VP28亞單位疫苗，TAT-VP28重組亞單位疫苗對(duì)WSSV感染具有良好的抵抗效果，且其免疫保護(hù)率較高。

除了使用菌體作為疫苗的生物載體外，有時(shí)水生植物也可作為疫苗的生物載體成分發(fā)揮作用。

賈曉會(huì)等［43］利用魚腥藻7120（Anabaena sp.PCC 7120）作為表達(dá)主要包膜蛋白VP28的載體，口服免疫凡納濱對(duì)蝦（L. vannamei）仔蝦，觀察仔蝦在接種此種疫苗后對(duì)WSSV的抵抗力。實(shí)驗(yàn)者將仔蝦分為5組，1組和2組投喂未經(jīng)處理的飼料；3組口服含野生型魚腥藻的疫苗，4組口服無(wú)魚腥藻的疫苗，5組口服含VP28蛋白的突變型疫苗，各組持續(xù)投喂10 d，對(duì)2-4組進(jìn)行5 h的WSSV浸泡攻毒實(shí)驗(yàn)。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1-5組的存活率分別為100%、0%、15.5%、20.6%和68%，重組生物疫苗能夠使凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)生抵抗WSSV的較好的免疫能力。

生物載體疫苗相較于傳統(tǒng)的疫苗，在表達(dá)外源抗原成分時(shí)有更多的選擇性，并且在抗原呈遞方面有效性較高［44］，可根據(jù)不同的抗原特性制備不同的載體疫苗，或者在同一種載體疫苗上插入多種外源抗原，達(dá)到一種疫苗可防治幾種疾病的效果［45］。

生物載體疫苗還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非特異性甚至特異性免疫反應(yīng)，但是正是由于載體會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)這一特性，載體會(huì)受到母源抗體的干擾，從而影響生物載體疫苗的二次免疫反應(yīng)；同時(shí)，生物載體疫苗的抗原成分也會(huì)對(duì)宿主造成潛在的威脅性［46］。因此，針對(duì)抗原選用合適的生物載體，提高生物載體疫苗的安全性和適用性成為大批量生產(chǎn)生物載體疫苗的前提。

4.3 其他的一些口服疫苗

除了上述佐劑疫苗和生物載體疫苗外，Companjen等［14］制備了一種特殊的口服疫苗，該口服疫苗主要為融合蛋白，由腸黏連分子和植物病毒肽組成，腸黏附分子結(jié)合在腸道內(nèi)，植物病毒肽作為抗原誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用融合的腸道黏附分子和表達(dá)于馬鈴薯塊莖的B和T細(xì)胞的抗原表位，二者具有良好的異源線性，通過(guò)口服疫苗，隨后在鯉魚的后腸中發(fā)揮免疫功能，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的發(fā)生。

付天增等［47］制備了遲緩愛德華菌菌蛻疫苗，并與全菌滅活疫苗分別口服免疫羅非魚（Oreochromis niloticus），首次免疫后14 d再采用相同方法增強(qiáng)免疫。攻毒結(jié)果顯示，滅活全菌疫苗和菌蛻疫苗的RPS分別為60%、77%，兩者的相對(duì)保護(hù)率相較于對(duì)照組明顯偏高（P＜0.05），證明菌蛻疫苗相比于滅活全菌疫苗能夠在羅非魚感染愛德華菌病時(shí)提供更高的免疫保護(hù)力。

5 結(jié)語(yǔ)

疫苗通過(guò)口服進(jìn)行免疫是一種較為簡(jiǎn)單快捷的免疫方式，它避免了注射疫苗和浸泡疫苗存在的一些問(wèn)題，減少了勞動(dòng)強(qiáng)度和人工投入，更重要的是減少了注射免疫帶來(lái)的強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)。這種免疫方式并不受魚體大小、種類、地點(diǎn)及時(shí)間等的限制，是一種較為理想的疫苗給予方式?？诜呙缭谙乐兄饕责つっ庖邽橹?，但是就目前的研究來(lái)看，其黏膜免疫的具體機(jī)制尚不清楚。因此，在后續(xù)的工作中應(yīng)該就黏膜免疫這方面展開更深入的研究。

研究口服疫苗一個(gè)不可回避的問(wèn)題就是怎樣避免消化道對(duì)抗原的影響，怎樣維持疫苗在到達(dá)后腸前的穩(wěn)定性和完整性，以及抗原的釋放問(wèn)題。就目前處于實(shí)驗(yàn)室研究階段的口服疫苗其免疫效果仍然與注射疫苗的免疫效果有差距，甚至有時(shí)只能達(dá)到注射疫苗免疫效果的一半。因此，在疫苗生產(chǎn)中抗原的處理方式，有效劑量，疫苗的包裹材料、載體及佐劑等的類型、疫苗形式以及免疫時(shí)間、免疫次數(shù)、實(shí)驗(yàn)魚的生理發(fā)育階段等都需要研究者進(jìn)一步詳盡的研究，不斷攻克水產(chǎn)口服疫苗的關(guān)鍵技術(shù)，切實(shí)提高口服疫苗的免疫效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康保駕護(hù)航。

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