張文杰，張冰凱，董朔暉，董 浩，劉增林，鄭文博，張 翔，王延磊，胡三元，戴 勇

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東 濟(jì)南，250012)

隨著發(fā)病率、死亡率的上升，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)于2016年已成為導(dǎo)致死亡的第三大癌癥[1]。因手術(shù)、放療、化療及靶向治療的應(yīng)用，CRC患者的5年、10年生存率達(dá)到了65%與58%[2]。即使這樣，晚期CRC患者依然容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。多項研究表明，50%～60%的CRC患者在疾病進(jìn)展過程中會出現(xiàn)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[4-5]。復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移依然是CRC患者死亡的首要原因。因此，CRC治療的關(guān)鍵是找到能早期發(fā)現(xiàn)疾病并可監(jiān)測疾病進(jìn)展的方法[6]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)被認(rèn)為是癌癥患者的一種實時“液體活組織”，可反映疾病進(jìn)展與預(yù)后[7]。一項納入15個臨床研究共3 129例病例的薈萃分析表明，不論采用何種檢測方法，外周血CTCs陽性預(yù)示CRC患者更差的總生存期(overall survival，OS)[風(fēng)險比(hazard ratio，HR)＝2.36，95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)：1.87-2.97，P＝0.006)]及無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)(HR＝1.83，95%CI：1.42-2.36，P＜0.00001)[8]。 此外，單純 CTCs計數(shù)不足以反映腫瘤的異質(zhì)性狀況，研究發(fā)現(xiàn)[9]，CTCs可分為不同的亞群，其中間充質(zhì)CTCs可作為評估腫瘤進(jìn)展的生物標(biāo)志物。另有研究表明[10]，部分CTCs表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，在腫瘤形成過程中扮演循環(huán)腫瘤干細(xì)胞(circulating tumor stem cells，CTSCs)的角色。

1 腫瘤轉(zhuǎn)移與CTCs的形成

部分原發(fā)腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程獲得高侵襲性，從原發(fā)組織脫落，侵入周圍基質(zhì)并進(jìn)入血液循環(huán)，成為CTCs。大多數(shù)CTCs被機體免疫系統(tǒng)殺死，僅極少數(shù)轉(zhuǎn)移傾向極高的CTCs存活下來，并可相互聚集形成循環(huán)腫瘤微栓。幸存的CTCs或循環(huán)腫瘤微栓離開血液循環(huán)，進(jìn)入到繼發(fā)臟器的局部微環(huán)境，進(jìn)而逃避宿主的局部非特異免疫殺傷作用，在各類生長因子的作用下增殖生長并最終形成轉(zhuǎn)移灶[11]。

CTCs被認(rèn)為在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者創(chuàng)造性地建立了CRC的原位小鼠模型來發(fā)展轉(zhuǎn)移并獲取CTCs。獲取的CTCs成功地在體外進(jìn)行了培養(yǎng)，并將培養(yǎng)的CTCs重新注入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在注射部位迅速生長出了腫瘤，表明CTCs的腫瘤形成能力。同時，他們對這個細(xì)胞系的表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞間粘附相關(guān)的基因claudin-7、CD166顯著下調(diào)，表明與來自肝轉(zhuǎn)移瘤的大量腫瘤細(xì)胞相比，CTCs更具有轉(zhuǎn)移表型；干細(xì)胞標(biāo)志物 DLG7、BMI1在CTCs中顯著上調(diào)，這與CTCs更強的腫瘤形成及自我更新能力密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明了小鼠來源的CTCs參與腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。

2 CTCs的檢測技術(shù)

2.1 基于化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行富集的檢測方法 CellSearch系統(tǒng)是利用上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molcule，Ep-CAM)標(biāo)記磁珠對上皮細(xì)胞進(jìn)行富集，細(xì)胞經(jīng)固定后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚[2-(4-amidinophenyl)-6-indole carbamidine dihydrochloride，DAPI]熒光染料標(biāo)記細(xì)胞核，CD45熒光抗體及CK8、CK18、CK19或CKmix熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，結(jié)果分析在四色熒光顯微鏡下進(jìn)行。將DAPI+、CD45-、CK+及Ep-CAM+的細(xì)胞定義為CTCs。CellSearch系統(tǒng)的優(yōu)點是細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)能較好地保存，即熒光顯微鏡不但能看到熒光染色的結(jié)果，還能觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)，且已有商品化的半自動檢測儀器簡化操作過程。缺點是采用上皮細(xì)胞標(biāo)志篩選將遺漏發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞，檢測結(jié)果具有較高的假陰性率[13]。

LiquidBiopsy 平 臺(Cynvenio Biosystems，Westlake Village，CA，USA)通過最初與 DAPI、CK、CD45 抗體、Ep-CAM-生物素抗體進(jìn)行差異性免疫染色來富集CTCs，再加入生物素蛋白-鐵磁流體抗體用于磁固定，再使用高通量基因測序進(jìn)一步分析。其優(yōu)點是能處理相對大量的血液樣本，特定腫瘤細(xì)胞的捕獲率可達(dá)到70%以上，純度可達(dá)10%，同時可集成到實驗室流程中，實現(xiàn)CTCs計數(shù)并提供高純度樣品用于分子分析。但由于采用了與CellSearch系統(tǒng)類似的檢測原理，仍存在假陰性率較高的問題[14]。

Epic 系統(tǒng)(Epic Sciences Inc.，San Diego，CA，USA)除紅細(xì)胞裂解外沒有富集步驟。所有有核細(xì)胞沉積在載玻片上，再進(jìn)行差異免疫染色鑒別CTCs。由于考慮到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、循環(huán)腫瘤微栓、凋亡的存在，Epic系統(tǒng)一定程度上解決了假陰性率問題，在驗證性試驗中體現(xiàn)了比較好的敏感性、特異性及線性，除了同樣可整合熒光原位雜交技術(shù)、高通量基因測序等下游功能，此系統(tǒng)一個重要特征是具有患者載玻片的生物儲存庫的能力，可用于回顧性生物標(biāo)記分析[15]。

Saucedo-Zeni等[16]已發(fā)明了基于Ep-CAM抗體標(biāo)記原理的醫(yī)療器械，僅需將其放置于外周靜脈中即可于體內(nèi)對CTCs進(jìn)行初篩，然后將初篩的CTCs在體外進(jìn)一步鑒別；其優(yōu)點是克服了少量血液樣本中CTCs稀少難以富集的困難，可在全身血液中捕獲CTCs，提高了富集效率。

2.2 基于物理性質(zhì)進(jìn)行富集的檢測方法 ISET(RareCells Diagnostics，Paris，F(xiàn)rance)利用CTCs的較大尺寸及更多結(jié)構(gòu)剛性的特性進(jìn)行富集。其核心部件是一個過濾器，過濾器內(nèi)分布有一定直徑的濾孔濾膜，最后根據(jù)形態(tài)特征對富集的CTCs進(jìn)行鑒別。相較實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)，ISET 具有更高的靈敏度，所需血液標(biāo)本的量更少，結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光等下游功能，可對CTCs進(jìn)行更深入的分析[17]。

Parsortix平臺(ANGLE plc，Guildford，UK)采用微流體原理，不僅考慮到了富集過程中CTCs的大小特性，對其變形能力也有一定考量。通過對富集的CTCs進(jìn)行免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)該平臺對于不同來源腫瘤細(xì)胞的捕獲率為42%～70%，純度約1%?？少F的是，經(jīng)過分離獲得CTCs，99%是有活性的。與CellSearch系統(tǒng)相比，兩者在CTCs捕獲率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義[18]。

FMSA 系統(tǒng)(Pennsylvania State University，Department of Biomedical Engineering，State College，PA，USA)是一種新型靈活微型彈簧陣列裝置，與以前的微過濾裝置不同，微型彈簧陣列的柔性結(jié)構(gòu)可最大限度地減少細(xì)胞損傷，以保存活力，同時最大限度地提高過濾速度。其平均捕獲率為90%，存活率高于80%，在與CellSearch系統(tǒng)的對比試驗中，F(xiàn)MSA系統(tǒng)顯示出更高的靈敏度[19]。

OncoQuick系統(tǒng)(Greiner Bio-One International GmbH，Germany)采用物理過濾原理的同時進(jìn)行密度梯度離心來分離CTCs，再采用RT-PCR進(jìn)行鑒定。這種新密度梯度離心法與標(biāo)準(zhǔn)方法Ficoll相比，OncoQuick顯著提高了純度，腫瘤細(xì)胞捕獲率也有一定程度的提高[20]。

AccuCyte系統(tǒng)(RareCyte，Seattle，WA，USA)則采用了將密度離心、免疫染色及全外顯子測序結(jié)合起來的設(shè)計思路，AccuCyte系統(tǒng)可提供高分辨率圖像，通過形態(tài)、表型特征識別CTCs，捕獲率為90%～91%。在某些血液標(biāo)本中，其捕獲的CTCs數(shù)量顯著高于CellSearch系統(tǒng)[21]。

DEPArray系統(tǒng)(Menarini Silicon Biosystems，Castel Maggiore，Italy)利用 CTCs獨特的電性質(zhì)，采用雙電流技術(shù)對CTCs進(jìn)行檢測。此技術(shù)需要預(yù)先使用OncoQuick系統(tǒng)對CTCs進(jìn)行富集，捕獲率受目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量影響，為11.6～86.0%[22]。

聲學(xué)分離是利用細(xì)胞尺寸、可壓縮性差異來分離不同的細(xì)胞類型[23]。有研究人員設(shè)計的聲學(xué)流式細(xì)胞儀已實現(xiàn)從血液中高通量分離CTCs，其捕獲率超過83%，可去除90%以上的雜質(zhì)細(xì)胞，同時對細(xì)胞活力沒有顯著影響[24]。

3 CTCs在CRC治療中的作用

最近，一項納入12項通過RT-PCR檢測外周血CTCs的臨床研究共2 363例非轉(zhuǎn)移性CRC患者的薈萃分析表明，不管何種TNM分期、何時進(jìn)行采樣、是否進(jìn)行新輔助治療，CTCs陽性均意味著更差的 OS(HR＝3.07，95%CI：2.05-4.624，P＜0.001)與PFS(HR＝ 2.58，95%CI：2.00-3.32，P＜0.001)。 同時，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(RR＝1.62，95%CI：1.17-2.23，P＝0.003)、浸潤深度(RR＝1.41，95%CI：1.03-1.92，P＝0.03)、血管侵犯(RR＝1.66，95%CI：1.17-2.36，P＝0.004)、腫瘤級別(RR＝1.19，95%CI：1.02-1.40，P＝0.029)、TNM 分期(RR＝0.76，95%CI：0.71-0.81，P＜0.001)與 CTCs陽性密切相關(guān)。這些證據(jù)表明，與影像學(xué)相比，CTCs的臨床應(yīng)用價值在于可更早地預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移[25]。同時Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)，腸系膜下靜脈血中檢測到的CTCs較外周血更多，表明肝臟可減少CTCs的數(shù)量。Wind等[27]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與術(shù)前相比，術(shù)中CTCs的檢出率、數(shù)量顯著增加，并且腹腔鏡手術(shù)中檢測到的CTCs少于開腹手術(shù)[27]。Zhao等還發(fā)現(xiàn)CTCs陽性患者往往伴隨血清CEA、CA19-9水平升高。即使在非轉(zhuǎn)移性CRC患者外周血幾乎檢測不到的CTCs的情況下，血清CA19-9與腸系膜下靜脈CTCs水平也呈現(xiàn)相關(guān)性。這些結(jié)果表明，在腸系膜下靜脈使用CellSearch系統(tǒng)檢測CTCs更具有臨床意義，血清CA19-9水平可幫助進(jìn)一步評估腸系膜下靜脈CTCs水平[26]。不同于CA19-9，Ki67指數(shù)對CRC患者預(yù)后的提示作用獨立于CTCs計數(shù)[28]。

對于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)患者，Kaifi等[29]發(fā)現(xiàn)肝腫瘤負(fù)荷越大，血清CEA水平越高，檢測到的CTCs數(shù)量越多[29]。但Das等[30]的研究表明，CTCs計數(shù)與肝肺轉(zhuǎn)移瘤沒有關(guān)系，這項基于21例mCRC患者的聯(lián)合化療實驗還發(fā)現(xiàn)，11例開始化療后立即出現(xiàn)CTCs計數(shù)下降，5例化療結(jié)束時與基線水平相比CTCs計數(shù)下降，這提示我們CTCs聯(lián)合血清CEA有助于評估化療mCRC患者的化療反應(yīng)。多藥聯(lián)合對晚期CRC仍然有效，但會使化療產(chǎn)生的副作用明顯增加，CTCs計數(shù)可識別可能獲益更多的患者，避免對無獲益者采取高毒性方案[31]。在基因?qū)用?，原發(fā)腫瘤與CTCs的KRAS突變水平是一致的，當(dāng)原發(fā)腫瘤難以獲得時，CTCs可作為替代選擇，甚至可更精確地動態(tài)預(yù)測mCRC患者對靶向治療的反應(yīng)[32-33]。一項納入38例接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療的mCRC患者的前瞻性研究分別在基線(治療前)、早期(治療后2～4周)及晚期(治療后8～10周)測定CTCs水平，發(fā)現(xiàn)早期CTCs陽性與陰性患者的PFS(中位數(shù)，2.0 vs.4.0個月，P＝0.004)、OS(4.7 vs.11.4，P＝0.039)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，治療期間CTCs的變化情況是PFS、OS的獨立預(yù)測因素，其對靶向治療反應(yīng)的評估作用早于影像學(xué)檢查[34]。雖然西妥昔單抗的治療原理是基于表皮生長因子受體，但有研究顯示[35]，表皮生長因子受體在CTCs中是否表達(dá)對靶向治療反應(yīng)的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

CTCs作為CRC患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子正得到越來越多的接受，但多數(shù)用于檢測CTCs的技術(shù)顯示出低靈敏度、特異性。因此，Chen等[36]試圖找到CTCs的替代標(biāo)記物。他們從90例CRC患者、151例健康志愿者的1.5 mL外周血中所含的CTCs直接提取RNA，然后通過RT-PCR篩選候選標(biāo)記基因，成功鑒定了上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2基因具有高差異表達(dá)比率(P＜0.01)。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2基因顯示出良好的靈敏度與特異性，可作為替代的測量方法彌補目前CTCs檢測在CRC患者診斷與監(jiān)測中的不足。

4 CTCs亞群及CTSCs與CRC

雖然CTCs計數(shù)作為CRC進(jìn)展及治療反應(yīng)的潛在標(biāo)記物已被廣泛接受，但對這些細(xì)胞異質(zhì)性缺乏認(rèn)識已成為將其應(yīng)用于臨床的瓶頸。Cui等[9]根據(jù)上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況，將CTCs分為上皮型、混合型、間質(zhì)型，發(fā)現(xiàn)在CRC患者中，間質(zhì)型隨著腫瘤進(jìn)展而顯著增加，且間質(zhì)型陽性與CRC患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生顯著相關(guān)。Malara等[37]則將結(jié)腸癌患者血液中分離出的CTCs分為CTSCs亞群(CD45-CD133+)、循環(huán)分化細(xì)胞(趨化因子受體4亞群+CK20+)。生存分析結(jié)果表明，CTSCs亞群對應(yīng)更差的OS，而循環(huán)分化細(xì)胞亞群則對應(yīng)更差的PFS。對于CD26+CD326-的CTCs亞群，有研究發(fā)現(xiàn)CRC患者術(shù)前高水平的CD26+CD326-的CTCs正確預(yù)測了44.4%的腫瘤復(fù)發(fā)，而術(shù)后高水平的CD26+CD326-的CTCs正確預(yù)測了69%的腫瘤復(fù)發(fā)，準(zhǔn)確性為88.8%。相比之下，術(shù)后CD26+CD326-的CTCs陰性患者的三年無進(jìn)展生存率增加86%，同時腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險降低大于90%。因此，CD26+CD326-的CTCs可作為CRC復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因子[38]。

CTSCs代表了基于其干細(xì)胞特性、侵入性而具有轉(zhuǎn)移起始能力的CTCs獨特亞群，因此對于CRC患者的預(yù)后是至關(guān)重要的。Grillet等建立多個體外CTCs細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)所有CTCs細(xì)胞系在皮下異種移植物中是致瘤性的，并且在脾內(nèi)注射后也能定植于肝臟。雖然CTCs在血細(xì)胞中很少，但在遺傳、表型上是異質(zhì)的。對單克隆的CTCs進(jìn)行分析，其中部分單克隆系仍呈現(xiàn)異質(zhì)性并高表達(dá)CTSCs標(biāo)記，直接表明CRC患者來源的部分CTCs具有CTSCs的所有功能屬性。同時，與化療藥物抗性相關(guān)的基因也呈高表達(dá)狀態(tài)，藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞系的藥物敏感性存在差異，這強烈提示我們CRC患者需要個性化治療[39]。與非致瘤性的CTCs相比，CTSCs不僅能從原發(fā)性腫瘤脫落，而且能逃避免疫監(jiān)視，在循環(huán)血液中存活并隨后在遠(yuǎn)處器官中形成轉(zhuǎn)移。因此，CTSCs可能是預(yù)防CRC進(jìn)展的潛在治療靶點[40]。目前報道的主要 CTSCs標(biāo)志物包括 CD133、CD44、CD166、Ep-CAM、CD24、CD26、CD29、ALDH1 等。 盡管不同的細(xì)胞表面標(biāo)記已用于表征與分離CTSCs，但迄今尚無鑒定CTSCs的良好標(biāo)記物。Meng等[41]發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng) CD133+或 CD44+的CTCs細(xì)胞相比，CD262+的CTCs在培養(yǎng)的腫瘤球體中形成更多的腫瘤球，表現(xiàn)出更高的化學(xué)耐受性，在裸鼠中移植后發(fā)生腫瘤的比例更高，并且發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移瘤的頻率更高。此外，當(dāng)皮下移植CD262+的CTCs細(xì)胞時，在循環(huán)中能更頻繁地檢測到CTCs。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期CRC CTCs中CD44變體外顯子9陰性患者的5年生存率為89%，而陽性表達(dá)患者的5年生存率為52.4%(P＜0.05)。對于Ⅳ期不可切除的CRC患者而言，CD44變體外顯子9陰性表達(dá)患者的2年生存率為70.1%，而陽性表達(dá)患者的 2年生存率為 33.3%(P＜0.05)[42]。Fang等[43]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合影像學(xué)、血清 CEA水平及CD133+、CD44+、CD54+的CTCs檢測可提高CRC肝轉(zhuǎn)移檢出率，靈敏度為 88.2%，特異度為 92.4%。 同時，CD133+、CD44+、CD54+的CTCs高表達(dá)意味著更短的生存期，其對預(yù)后的提示作用在肝轉(zhuǎn)移瘤無法切除的CRC患者中更明顯[44]。不同于CTCs，CTSCs(CD133+Ep-CAM+)數(shù)量在肝門靜脈血、外周血中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此，我們可能無法從門脈系統(tǒng)中獲取更多的CTSCs[45]。

CRC中CTCs的檢測有助于腫瘤的早期診斷及預(yù)后判斷，同時還可用于抗腫瘤藥物的療效評估及制定個體化治療方案，是一種具有高度可行性及可重復(fù)性的非侵入性新型診斷工具。目前阻礙我們深入認(rèn)識CTCs的兩個重要障礙是它們的稀缺性與異質(zhì)性。越來越多的新方法使CTCs的富集效率大大提高，新的標(biāo)記物組合有效降低了假陽性率、假陰性率，但仍難以覆蓋隨疾病進(jìn)展不斷發(fā)生縱向變化的所有CTCs，期待更加完善的檢測方法。同時，越來越多的證據(jù)表明CTCs動態(tài)異質(zhì)性的存在，僅僅依據(jù)CTCs計數(shù)無法對CRC進(jìn)行全面而精確的評估，不同CTCs亞群在CRC發(fā)生與發(fā)展過程中扮演著不同的角色。CTSCs作為具有干細(xì)胞特性的獨特亞群，其作用不言而喻，可能是早期發(fā)現(xiàn)、阻斷腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。相較CTCs，更加稀缺且更加神秘的CTSCs吸引著我們?nèi)ソ议_其神秘的面紗，多種標(biāo)志物組合仍是鑒別CTSCs的主要手段。CTCs體外模型的建立不僅為CTCs及CTSCs研究開辟了更廣闊的空間，而且為CRC患者制定個體化治療方案提供了無限可能?？傊贑TCs的個體化、實時性治療會是CTCs應(yīng)用于CRC治療的發(fā)展趨勢。