馮寒騫 李超

（華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241）

生長素（Auxin）一詞來自于希臘語，其意為生長。生長素的作用最早由達(dá)爾文所描述，當(dāng)植物組織的頂端感受到光信號或重力信號后，某種刺激物質(zhì)會被運送到其他組織，促使向光和向重力反應(yīng)的發(fā)生。隨后，瓊脂塊擴散實驗發(fā)現(xiàn)其能夠從植物組織中擴散分離出來，并依然具有促進(jìn)生長的活性［1］。

生長素在植物生長發(fā)育過程中起著核心作用。吲哚-3-乙酸（IAA）是植物中生長素最主要的形式。生長素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞分裂以及細(xì)胞特異性的分化來參與一系列生長發(fā)育過程，如胚胎極性建成、維管束分化、頂端優(yōu)勢以及向光反應(yīng)、重力響應(yīng)等過程［2］。在細(xì)胞生長水平，生長素處理10 min之后就會誘導(dǎo)質(zhì)膜上的H+-ATP酶的磷酸化，鉀離子通道表達(dá)量的上調(diào)，以及細(xì)胞壁松弛蛋白expansin的激活，從而促使胚芽鞘或下胚軸細(xì)胞的快速生長［3-4］。

對生長素信號的研究主要包括3個方面：一是，生長素的合成和代謝［5］；二是，生長素的極性運輸［6］；三是，生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。生長素的合成和極性運輸控制著植物不同組織的生長素水平。生長素由色氨酸作為底物起始，經(jīng)多條途徑進(jìn)行合成，其中最重要的是吲哚-3-丙酮酸（Indole-3-pyruvate，IPA）合成途徑［7］。這一途徑分為兩步，主要由色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶TAA1和黃素單加氧酶YUCCA來負(fù)責(zé)［8-9］。GH3家族基因引起生長素和氨基酸結(jié)合，從而控制體內(nèi)生長素的水平［10］。生長素在細(xì)胞間的極性運輸主要通過幾個生長素轉(zhuǎn)運體家族基因完成。生長素的極性轉(zhuǎn)運對于植物生長發(fā)育至關(guān)重要，生長素在特定的組織合成后，轉(zhuǎn)運到靶點組織和器官發(fā)揮功能。AUX1共轉(zhuǎn)運體負(fù)責(zé)生長素由胞外向胞內(nèi)的內(nèi)流運輸［11］，PIN家族負(fù)責(zé)生長素由胞內(nèi)向胞外的外流運輸，而ABCB/PGP可以雙向運輸生長素［12-13］。生長素轉(zhuǎn)運體響應(yīng)環(huán)境和發(fā)育信號，其表達(dá)量和亞細(xì)胞定位發(fā)生變化，從而建立特異的濃度，調(diào)控特定的發(fā)育和環(huán)境信號響應(yīng)過程。生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制著組織和器官對生長素的反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)了3條生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：Aux/IAA-TIR1核信號通路，細(xì)胞表面起始的信號通路和SKP2A介導(dǎo)的信號通路。其中Aux/IAA-TIR1核通路介導(dǎo)了生長素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，細(xì)胞膜表面起始的信號通路介導(dǎo)了生長素的快速響應(yīng)。本文將重點闡述生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，并討論和展望其研究前景及面臨的挑戰(zhàn)。

1 生長素信號：Aux/IAA-TIR1-ARF信號通路及轉(zhuǎn)錄調(diào)控

外界生長素濃度的變化信號經(jīng)細(xì)胞感受和識別后，引起大量基因轉(zhuǎn)錄水平的變化［14］。早期生長素響應(yīng)基因的表達(dá)水平在生長素處理幾分鐘后就明顯上升，這些基因可以分為3個家族：SAUR、GH3和Aux/IAA。SAUR基因產(chǎn)生的是一類高度不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄本，包括70多個成員。GH3家族編碼的是一類催化生長素和氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)的酶。GH3負(fù)責(zé)生長素的反饋調(diào)節(jié)，從而控制胞內(nèi)生長素的穩(wěn)態(tài)。Aux/IAA在生長素響應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控過程中起著核心作用。擬南芥中存在29個Aux/IAA蛋白，其編碼一類短周期的核蛋白，該家族多數(shù)成員作為生長素誘導(dǎo)基因的抑制因子發(fā)揮功能［15］。Aux/IAA與生長素響應(yīng)因子發(fā)揮作用（Auxin response factor，ARF）形成二聚體，從而抑制ARF的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的行使。而ARF類轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到生長素誘導(dǎo)基因的順式作用元件上，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá)［16］。

TIR1最早通過遺傳篩選的方法鑒定得到。tir1突變體在下胚軸伸長和側(cè)根形成等生長素調(diào)節(jié)的發(fā)育過程方面存在缺陷［17］。TIR1是一個F-box蛋白，其通過F-box基序與Skp1類似蛋白ASK相互作用，進(jìn)而與Cullin類似蛋白CUL1相互作用，從而形成泛素連接酶（E3）復(fù)合體SCFTIR1［18］。生長素能夠穩(wěn)定TIR1和Aux/IAA蛋白的第二個結(jié)構(gòu)域（Domain II）的相互作用，介導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄抑制子Aux/IAA蛋白的降解，從而將ARF從Aux/IAA-ARF二聚體中釋放出來［19-20］。不同的 TIR1/AFBs和 Aux/IAAs配對組合的結(jié)合活性差異很大，這使得Aux/IAA蛋白具有一系列不同的半衰期，能夠響應(yīng)不同濃度的生長素，并呈現(xiàn)差異化的反應(yīng)。

2 生長素核信號通路的新進(jìn)展

2.1 生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的工具

對于生長素信號的研究，其中很關(guān)鍵的是如何動態(tài)地檢測不同組織在發(fā)育過程中生長素的分布和信號強弱。在植物中常用于檢測生長素分布的工具是基于DR5啟動子的一系列報告基因。DR5啟動子中包含眾多ARF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，從而能夠響應(yīng)生長素信號［21］。DR5啟動子作為生長素信號的輸出端，其活性不僅與內(nèi)源生長素的分布有關(guān)，同時也受到生長素信號的控制。在此基礎(chǔ)上，對DR5啟動子進(jìn)行改造，開發(fā)出了DR5v2啟動子。相比DR5，DR5v2在更多的植物細(xì)胞中能夠更加準(zhǔn)確地反映出生長素的水平，如胚胎發(fā)生過程中的子葉和維管組織、根表皮細(xì)胞和中柱細(xì)胞等［22］。作為生長素的誘導(dǎo)基因，GH3∶GFP同樣被用于指示生長素的濃度和生長素的信號強弱［23］。

Aux/IAA蛋白水平的變化直接反映了體內(nèi)生長素濃度的變化。將Aux/IAA蛋白IAA28的DII結(jié)構(gòu)域和黃色熒光蛋白VENUS構(gòu)建為融合蛋白，以35S啟動子驅(qū)動，并在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DII-VENUS的熒光強度能夠靈敏地反映根尖和冠部頂端分生組織中的生長素濃度，以及重力響應(yīng)過程中根部生長素濃度變化［24］。目前，DII-VENUS被廣泛用于對多種植物生長發(fā)育過程中生長素分布及響應(yīng)的研究［25-26］。

2.226S蛋白酶體調(diào)控途徑

生長素通過26S蛋白酶體介導(dǎo)的降解途徑來降解Aux/IAA蛋白。26S蛋白酶體受到多種信號蛋白的調(diào)控。RAC/ROP GTP酶引起Aux/IAA-SCFTIR/AFBs-26S proteasome復(fù)合體的形成，從而使得Aux/IAA蛋白被降解［27］。高溫能夠增加TIR1蛋白的積累，該過程依賴于分子伴侶HSP90。HSP90與SGT1均與TIR1相互作用。抑制HSP90的活性使得TIR1被降解，并引起一系列生長素缺陷表型［28］。在哺乳動物中，PI31是一個被廣泛研究的蛋白酶體的抑制因子。最近的研究表明，擬南芥中PI31的同源基因PTRE1參與Aux/IAA復(fù)合體的形成。ptre1突變體中生長素信號的傳遞受到抑制，多數(shù)IAA基因的表達(dá)量下降，DR5：GFP的熒光強度降低。IAA7和IAA17的蛋白水平的表達(dá)量在ptre1突變體中上升，在PTER1的過表達(dá)中下降。PTRE1能夠與IAA蛋白的DII結(jié)構(gòu)域相互作用。生長素處理能夠促使PTRE1蛋白由內(nèi)膜系統(tǒng)向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移［29］。這些研究結(jié)果表明，生長素通過PTRE1來調(diào)控蛋白酶體的活性，從而控制Aux/IAA蛋白的穩(wěn)態(tài)和生長素的響應(yīng)。

2.3 LTR2調(diào)控Aux/IAA蛋白的異構(gòu)化

研究發(fā)現(xiàn)，水稻中的LATERAL ROOTLESS2（LRT2）是一個親環(huán)素類型的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶，介導(dǎo)了水稻OsIAA11的肽基脯氨酰異構(gòu)化，從而調(diào)節(jié)OsIAA11的穩(wěn)定性。lrt2突變削弱了OsTIR1和OsIAA11的相互作用，導(dǎo)致OsIAA11蛋白在體內(nèi)更多的積累。OsIAA11的突變能夠部分恢復(fù)lrt2突變體的側(cè)根發(fā)育的表型［30］。LRT2能夠促進(jìn)Aux/IAA蛋白的降解，從而傳遞生長素信號。

2.4 NO影響生長素核信號通路

一氧化氮（NO）作為植物中的第二信使，參與多種植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。外源生長素處理能夠誘導(dǎo)NO在不定根、側(cè)根以及根毛的形成過程中積累［31-32］。NO含量的增加能夠增強生長素響應(yīng)基因的表達(dá)，而NO的清除能夠抑制Aux/IAA蛋白的降解。進(jìn)一步研究表明，NO通過對TIR1的140位半胱氨酸進(jìn)行亞硝基化修飾來調(diào)節(jié)TIR1-Aux/IAA的相互作用從而影響Aux/IAA的降解［33］。這些研究結(jié)果表明，NO能夠響應(yīng)生長素信號，調(diào)節(jié)TIR1/AFBAux/IAA-AFB信號途徑，從而影響生長素引起的形態(tài)建成。

3 細(xì)胞表面起始的生長素信號通路

3.1 生長素的快速響應(yīng)現(xiàn)象

TIR1/AFB-Aux/IAA-ARF這一核內(nèi)信號通路清晰地解釋了生長素的感受、傳導(dǎo)和響應(yīng)過程，然而，細(xì)胞內(nèi)存在著一些生長素的快速響應(yīng)。生長素處理引起的細(xì)胞膜的去極化、離子的跨膜流動、細(xì)胞的快速長大、根部的鈣信號震蕩等等往往發(fā)生在生長素處理后數(shù)分鐘內(nèi)［34］。這些生長素的快速響應(yīng)很難通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實現(xiàn)，所以細(xì)胞表面起始的生長素信號通路存在的可能性被提出［34］。

3.2 生長素與氫離子泵活性調(diào)控

20世紀(jì)70年代，學(xué)者們提出細(xì)胞的酸生長理論，即生長素通過激活細(xì)胞膜上的H+-ATP酶，酸化細(xì)胞壁，從而促進(jìn)細(xì)胞生長［35］。研究發(fā)現(xiàn)，生長素處理促進(jìn)H+-ATP酶的磷酸化（對應(yīng)AHA2的947位蘇氨酸）［36］。磷酸化的H+-ATP酶能夠與14-3-3蛋白結(jié)合，從而激活H+轉(zhuǎn)運的活性［37］。黑暗生長的下胚軸經(jīng)生長素處理10 min后開始明顯的快速生長。釩酸鹽作為H+-ATP酶的抑制劑，會明顯抑制生長素處理引起的下胚軸的生長，表明H+-ATP酶的活性對于下胚軸的生長是必需的。生長素處理10 min后H+-ATP酶的947位蘇氨酸磷酸化明顯加強，并在20 min達(dá)到峰值。生長素處理并不影響H+-ATP酶的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，卻會引起鉀離子通道KAT1的表達(dá)上調(diào)，表達(dá)鉀離子通道在生長素調(diào)節(jié)下胚軸生長過程中同樣起作用［36］。

3.3 SAUR調(diào)控生長素響應(yīng)

Small auxin-up RNA（SAUR）是生長素快速響應(yīng)基因，這一家族在擬南芥中有79個成員，其中SAUR19和SAUR63被發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞生長的正向調(diào)節(jié)因子［38］。過表達(dá)SAUR19使植物呈現(xiàn)出下胚軸伸長、葉面積增加、頂端彎鉤的缺陷和向性反應(yīng)改變等生長素相關(guān)缺陷。而通過人工microRNA干擾的方法降低SAUR19的表達(dá)水平，幼苗則呈現(xiàn)下胚軸變短和葉面積變小的表型。進(jìn)一步研究表明，SAUR過表達(dá)引起的下胚軸伸長與質(zhì)外體pH的下降有關(guān)［39］。SAUR19促進(jìn)H+-ATP酶C末端自我抑制區(qū)的磷酸化，從而激活H+-ATP酶的活性。SAUR19與PP2C-D相互作用并抑制其活性，而PP2C-D則直接作用并抑制質(zhì)膜上的H+-ATP酶的活性。因此，生長素可能通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)SAUR19的表達(dá)量，并抑制PP2C-D的活性，使得Thr947被磷酸化的H+-ATP酶的數(shù)量增加，質(zhì)外體酸化，細(xì)胞壁松弛，引起細(xì)胞生長［39］。

3.4 RAC/ROP與生長素信號通路

生長素能夠激活小G蛋白RAC/ROP，從而促進(jìn)生長素響應(yīng)基因的表達(dá)。在原生質(zhì)體中過表達(dá)正常形式以及持續(xù)激活形式的煙草RAC/ROP，能夠激活生長素響應(yīng)基因的表達(dá)；而過表達(dá)顯性抑制形式的NtRAC1、RAC的負(fù)調(diào)節(jié)因子，或降低內(nèi)源的NtRAC1的表達(dá)量，則會抑制生長素響應(yīng)基因表達(dá)［40］。在植物體內(nèi)過表達(dá)NtRAC1或抑制內(nèi)源RAC/ROP的表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因材料呈現(xiàn)生長素信號的缺陷表型。生長素激活RAC/ROP，并招募Aux/IAA蛋白形成含有SCFTIR1和26S蛋白酶體的具有降解活性的蛋白小體，從而調(diào)控生長素信號響應(yīng)［26］。

生長素調(diào)控葉片鋪板細(xì)胞的極性生長。生長素合成突變體yucca1/2/4/6的子葉鋪板細(xì)胞的極性交錯分布明顯弱于野生型。ROP2和ROP4的雙突變體ROP2 RNAi rop4-1 呈現(xiàn)與yucca1/2/4/6類似的鋪板細(xì)胞表型。外源NAA處理能夠恢復(fù)yucca1/2/4/6的鋪板細(xì)胞生長缺陷，卻不能恢復(fù)ROP2 RNAi rop4-1的表型，表明ROP2和ROP6調(diào)控生長素介導(dǎo)的葉片鋪板細(xì)胞的極性發(fā)育［41］。

研究發(fā)現(xiàn)，受體激酶FERONIA（FER）通過跟ROP GEF1直接相互作用而激活下游的ROP2信號通路。fer-4突變體呈現(xiàn)一系列細(xì)胞生長缺陷的表型，包括根毛、表皮毛和鋪板細(xì)胞發(fā)育的缺陷。FER突變同時也影響了植物對生長素的響應(yīng)。外源NAA處理使得野生型的根毛數(shù)量變多，長度增加，根部和根毛的ROS信號增強。而fer-4突變體在NAA處理后根毛沒有明顯的變化，且根部的ROS含量沒有明顯的增加。通過在fer-4突變體中外源回補FER基因則能夠恢復(fù)對生長素的響應(yīng)［42］。磷脂酰肌醇錨定蛋白LORELEI like GPI-anchored protein1（LLG1）的突變體也被發(fā)現(xiàn)具有跟fer-4相似的生長素不敏感以及其他生長素相關(guān)的表型。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，LLG1作為FER的伴侶蛋白協(xié)助FER由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運，并作為共受體參與FER感受胞外信號［43］。這些結(jié)果表明FER/LLG1復(fù)合體通過激活ROP途徑而影響ROS的產(chǎn)生，從而調(diào)控根毛的發(fā)育。

3.5 ABP1/TMK信號通路

尋找并鑒定質(zhì)膜及內(nèi)膜所介導(dǎo)的生長素信號通路同樣是當(dāng)前的研究熱點。生長素結(jié)合蛋白（Auxin binding protein 1，ABP1）被鑒定到能夠結(jié)合生長素，且對NAA的親和力高于IAA［44］。ABP1對NAA的結(jié)合能力在pH 5.0至5.5的條件下最高，在pH 7.0時候結(jié)合能力弱。多數(shù)ABP1蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而部分ABP1蛋白會從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上釋放，并轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜。ABP1能夠與TMK相互作用，且生長素可以增強二者的互作［45］。關(guān)于ABP1體內(nèi)功能的研究一直受阻于沒有完全敲除的突變體。通過TILLING方法獲得的突變體abp1-5被廣泛用于ABP1功能的研究。然而，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，abp1-5的發(fā)育缺陷表型與突變位點并不連鎖，表明這些表型差異可能是由其他位點的突變造成的。通過基因組測序，發(fā)現(xiàn)abp1-5中存在眾多SNP突變，包括光敏色素phyB的缺失突變［46］。此外，ABP1的CRISPR敲除突變體abp1-c1和T-DNA插入突變體abp1-TD1相比野生型并沒有呈現(xiàn)明顯的生長素信號缺陷相關(guān)表型［47］。因此，對于ABP1是否是生長素的受體需要進(jìn)一步的研究。

4 SKP2A與生長素介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控

SKP2A是一個F-box蛋白，SKP2A通過促進(jìn)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2FC和DPB的降解來調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。生長素能夠引起E2FC和DPB，以及SKP2A自身的降解。放射性IAA的結(jié)合實驗證明SKP2A 具有生長素結(jié)合活性［48］。對于該信號通路的研究還有待于進(jìn)一步深入研究。

5 生長素信號通路進(jìn)化的保守性

生長素信號通路是何時出現(xiàn)的，并如何在植物進(jìn)化的過程中不斷由簡單到復(fù)雜進(jìn)行演化？苔蘚植物是最早進(jìn)化出的陸生植物，其中小立碗蘚被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究?；蚪M測序和生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，關(guān)于生長素的合成、運輸、感受及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因在小立碗蘚中同樣存在。而PpIAA與PpAFB相互作用，并且PpAFB的RNAi突變體呈現(xiàn)生長素不敏感的表型［49-50］。在地錢當(dāng)中，同樣存在著TIR1/AFB-Aux/IAA-ARF信號通路，這些信號組分調(diào)控地錢的細(xì)胞生長和分化［51］。這些研究結(jié)果表明最早的陸生植物已經(jīng)具備了生長素的核心信號通路。

6 展望

植物分子生物學(xué)的研究為理清生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制提供了大量的證據(jù)。然而，對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制方面依然有許多問題需要解決。

（1）TIR1/AFB-Aux/IAA-ARF復(fù)合體呈現(xiàn)出復(fù)雜的調(diào)控層次和模式，對其深入探索將有助于完整闡述生長素核內(nèi)信號通路和徹底解析生長素信號通路對于特異生長發(fā)育過程的調(diào)控。其中，TIR1/AFB蛋白的翻譯后修飾、Aux/IAA蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變和穩(wěn)定性和ARF蛋白的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控是值得關(guān)注的研究方向。

（2）生長素對細(xì)胞生長的作用隨濃度變化而反應(yīng)不同。低濃度的生長素促進(jìn)細(xì)胞生長，而高濃度的生長素會抑制細(xì)胞生長。另外，生長素對于根部和冠部細(xì)胞的生長呈現(xiàn)相反作用，并且表現(xiàn)出很大的敏感性差異。外源施加微摩爾濃度的生長素會促進(jìn)冠部細(xì)胞的生長，而低至納摩爾濃度的生長素對根細(xì)胞的生長具有明顯抑制作用。這些復(fù)雜的生長素調(diào)控模式的分子機制有待于進(jìn)一步的研究。

（3）對于生長素的快速響應(yīng)機制，目前在細(xì)胞膜去極化、跨膜離子流動、鈣信號震蕩、原生質(zhì)體快速生長等方面已經(jīng)積累了大量的研究成果。然而對這一響應(yīng)過程中生長素是如何被感知并傳導(dǎo)，目前尚不清楚，在這一方面，生長素受體的探究將是重要的環(huán)節(jié)。