于鵬麗 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

能夠成功、準確地鑒定物種是對生物進行深入研究及其他相關科學研究的基礎。地球上的生物種類多樣，約有十多億種[1]，自采用林奈雙名法命名以來，被鑒定出的物種也不過170多萬種[2]。而由于傳統的物種分類方法主要是依據生物的表型和解剖學等特性，過度依賴分類學家的經驗，所以在物種鑒定中可能會出現差錯[3]。同時，由于分類學家的減少和艱巨的物種鑒定任務，人們迫切需要尋找一種準確、快速、簡便的分類方法，因此，以生物體固有的遺傳物質為基礎的研究逐步成為人們研究的熱點，并且到目前為止取得了很好的效果。早在1982年，Nanney就建議使用短的DNA序列對微生物物種進行鑒別[4]，隨后，科學家們開始用這種新的分子生物學方法對線蟲[5]、大象[6]和一些絕種的動物[7]等物種進行分類學研究。Floyd等[5]首次使用了分子條形碼(molecular barcode)這一概念。在前人研究的基礎上，Hebret等建立了基于線粒體細胞色素c氧化酶亞基I基因(cytochrome c oxidase subunit I gene,COI)為核心的全球動物鑒定系統，并正式提出了DNA條形碼(DNA barcode)的概念[8]。隨后，生命條形碼計劃(the Barcode of Life, BOL)成立并提議將以基因序列為基礎的DNA條形碼技術作為真核生物鑒定的標準[9]。2004年，生命條形碼聯盟(the Consortium for the Barcode of Life, CBOL)成立，旨在確立DNA條形碼的標準和建立一個綜合的DNA條形碼數據庫。隨著國際生命條形碼計劃(International Barcode of Life, iBOL)的發(fā)展，BOL進入了一個全新的階段，一大批DNA條形碼計劃的啟動和數據庫的建立為后續(xù)的科學研究打下了堅實的基礎[1,10],如：鱗翅類生命條形碼(Lepidoptera Barcode of Life,http://www.lepbarcoding.org/)、海洋生命條形碼(Marine Barcode of Life, http://www.marinebarcoding.org/)等。在國內，中科院早在2008年就與iBOL簽訂了合作關系，并成立了iBOL中國委員會[11]，隨后又成立了iBOL中國項目—南方中心(掛靠于中國科學院昆明動物所)和北方中心(掛靠于中國科學院動物研究所)，旨在加強國際間的合作和交流，促進我國的DNA條形碼技術的發(fā)展，為中國DNA條形碼事業(yè)提供平臺[12]。

1 DNA條形碼原理及技術流程

DNA條形碼(DNA Barcode)是指生物體內能夠代表該物種的、相對較短的一段標準的DNA堿基序列。DNA條形碼技術(DNA Barcoding)與零售業(yè)中的商品條形編碼(UPC)方法一樣，首先通過相關的實驗操作、借助先進的儀器設備獲得目標DNA條形碼序列，再采用合適的方法對這些序列進行比較分析，以實現對物種的分類和鑒定等。

DNA條形碼技術的操作步驟主要包括兩個大的方面：第一，實驗操作部分。該部分主要涉及樣品的采集、提取樣品DNA(包括DNA純/濃度的測定)、合成(設計)引物、PCR擴增、雙向測序；第二，數據分析部分。該部分主要涉及對雙向測序所得序列的校對與拼接、數據的處理與分析(如建立系統進化樹)、物種鑒定等，并將實驗中所得標準DNA條形碼序列上傳至數據庫。

2 DNA條形碼在農用動物中的應用

自2003年Hebert提出DNA條形碼這一概念以來，COI基因作為標準DNA條形碼已經被成功應用到動物的物種鑒定[13]、發(fā)現隱種[14]、分子進化和種群遺傳分析[15]、生物多樣性評價[16]、系統發(fā)育研究[17]等各個方面，但對農用動物(如豬、牛、羊等飼養(yǎng)最廣泛的家畜)的DNA條形碼研究仍然處于空缺狀態(tài)[18]。 目前的研究主要是探討其在家畜遺傳資源保護中的應用前景，而這些DNA條形碼片段能否對家畜進行種群鑒定和系統發(fā)育分析還需要更深入的研究[19]。目前DNA條形碼在農用動物中的應用主要是對肉類的成分鑒定。

我國是一個人口大國，每天對肉類的需求量都是一個可觀的數目，尤其是豬肉、牛肉、羊肉這些常見的農用動物肉類。隨著肉制品加工業(yè)的迅猛發(fā)展，一些問題就隨之而來：當消費者在市場上購買肉類產品，尤其是肉丸、肉干等深加工產品時，由于原始特征的缺失，很難確定其來源[20]，這就給一些不法商家?guī)砹丝沙酥畽C[21]：比如說以次充好、更換標簽等，這不僅涉及商業(yè)欺詐，甚至會威脅到消費者的身心健康，還有可能引發(fā)宗教問題[22]。常用的肉類鑒定方法有多種[23]，但因為操作復雜、價格昂貴等缺點而不能廣泛應用于日常的快速檢測工作中[24]，這就迫切需要一種不依賴原始表型的、準確的、快速的方法進行肉類鑒別。而基于PCR技術的DNA條形碼的出現解決了這一難題。田晨曦等[25]通過提取生鮮豬、牛、羊和鴨肉基因組DNA，建立了4種摻假模型，成功地檢測、判定了28批次的動物源性制品；Kitpipit等[26]選擇COI基因和12S rRNA基因并運用多重PCR技術成功鑒定了豬肉、羊肉等6種日常食用肉類；Kane和Hellberg[27]通過RT-PCR技術對豬、牛、羊肉等48份樣品進行檢測，發(fā)現其中有10份與商標不符；Haider等[28]運用COI基因PCR-RFLP方法成功鑒定了豬、牛、羊等8個物種，證明了DNA條形碼技術在禽畜肉類鑒別中的有效性。

農用動物DNA條形碼還用于藥用動物和動物源中藥的鑒定當中，并且已經建立了動物藥材的DNA條形碼數據庫[29]，這對臨床準確用藥、控制中藥廠的穩(wěn)定生產具有重要意義[30]。也有研究者利用細胞色素b基因(cytochrome b,Cyt b)全序列分析研究大額牛的母系起源與分類地位[31]、探討羚牛分類地位[32]、對哺乳動物進行物種鑒定[33]、對牛科的18個物種進行分析研究[34]等，但對農用動物品種的分類研究極為少見。同時，DNA條形碼技術也應用于畜牧產品[35]、畜牧獸醫(yī)[36]和農用動物寄生蟲學[37]等方面，有助于工作人員對農用動物的疾病進行預防和控制。

3 DNA條形碼在農用動物應用中的局限性和展望

大量研究已證明以COI等基因為基礎的DNA條形碼技術能夠很好地用于動物物種的分類鑒定，但它在農用動物中的鑒定還有很大的局限性。第一，數據庫中有關農用動物的DNA條形碼序列很少，甚至有些是錯誤的，缺乏大量的數據和標準作為支撐；第二，目前所用的農用動物大都是由專業(yè)養(yǎng)殖場經過大量的雜交育種篩選出來的，會出現基因滲入現象而使得一些不同物種或品種間擁有相同的DNA[38]，這就使以線粒體基因為基礎的DNA條形碼技術在這些動物中的鑒定受到限制；第三，有些類群同屬種間差異較小，DNA條形碼序列在種內和種間變異存在重疊的現象也給物種鑒定帶來了一定的困難[39]。

雖然DNA條形碼技術在農用動物的鑒定中存在一定的局限性，但它作為一種高效的、可靠的物種鑒定方法，在農用動物的鑒定中依然具有廣闊的應用前景。首先，我們要完善農用動物條形碼數據庫，增加條形碼的數量并保證其準確性，為后續(xù)的鑒定研究打好基礎。其次，與新一代測序技術相結合的復合條形碼技術(metabarcoding)，與瓊脂糖凝膠電泳[40]、多重PCR[41]、實時熒光定量PCR、基因芯片[42]、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)[43]、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、時間溫度梯度電泳(temporal temperature gradient gel electrophoresis,TTGE)等技術相結合[44]，可用于對農用動物的混合產品或基因雜交品種的鑒定，或者選擇進化速率較快的核基因作為條形碼進行鑒別[45]。同時，與形態(tài)學、分子生物學、細胞學等其他學科相結合，能更快、更準確地對物種進行鑒定[46-47]。

4 結語

DNA條形碼技術在農用動物的鑒定、畜牧業(yè)生產及肉類深加工等方面都有良好的發(fā)展前景，不僅解決了傳統分類方法應用的弊端，還大大提高了鑒定的速率和準確率。雖然DNA條形碼技術在農用動物中的應用目前還存在很多問題，但隨著DNA條形碼技術的不斷完善，新的測序技術和生物信息學等相關專業(yè)技術的快速發(fā)展，必將使DNA條形碼技術更好地得到應用，服務于人類。