黃 強(綜述) 周 梁(審校)

(復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031)

外泌體是直徑30～100 nm、起源于多泡體(multivesicular Body,MVB)的細胞外囊泡。其具有磷脂雙分子層結構,表面表達CD9、CD63等具有特征性的標志蛋白,外泌體內包裹著包括mRNA、ncRNA、蛋白質和脂質等在內的物質。起初,研究者們認為外泌體是轉運細胞內代謝產(chǎn)物的工具,但是目前越來越多的證據(jù)顯示外泌體在介導細胞間通訊[1]、調節(jié)免疫反應[2]、誘導腫瘤細胞耐藥[3]和轉移[4]等方面發(fā)揮著巨大作用,更印證了Paget[5]提出的“種子與土壤”假說[6]。而頭頸部惡性腫瘤作為全身常見的惡性腫瘤之一,化療耐藥、淋巴結轉移等問題一直困擾著廣大臨床工作者和研究人員,因此本文就目前關于外泌體在鼻咽癌、舌癌、喉癌以及口腔鱗癌等頭頸部惡性腫瘤中的研究進展作一綜述。

外泌體與鼻咽癌鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是鼻咽部上皮組織常見的惡性腫瘤,在我國兩廣地區(qū)具有較高的發(fā)病率[7],大于60%的NPC患者就診時已經(jīng)有局部淋巴結浸潤[8]。因此,更加深刻地認識NPC的內在機制變得尤為關鍵。目前在NPC外泌體方面的研究成果較多,外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展、演化以及診斷和預后方面都具有極為重要的作用

外泌體miRNA與NPC miRNA是一類具有高度保守性的長度在20～24 nt之間的內源性非編碼RNA,能夠通過降解或抑制靶mRNA調節(jié)轉錄后水平的基因表達。在腫瘤發(fā)生發(fā)展演化中扮演了十分重要的角色。眾所周知,NPC與EBV感染密切相關,而Pegtel等[9]率先發(fā)現(xiàn)病毒miRNA可通過外泌體運輸?shù)姆绞絺鬟f給未被病毒感染的細胞。Gourzones等[10]也證實在裸鼠種植模型和患者血清中都能較為特異性地探測到EBV感染的NPC細胞分泌的含有mir-BART7-3p的外泌體,這些發(fā)現(xiàn)有望成為潛在的鑒別NPC和非NPC的腫瘤生物標記物。

NPC細胞通過釋放富含miRNA的外泌體促使其適應不斷變化的微環(huán)境。Harmati等[11]使用阿霉素以及光敏劑Ag-Tio2刺激NPC細胞株5-8F,均可顯著增加外泌體數(shù)量并能改變外泌體中miRNA的表達譜,而其中變化幅度最顯著的均是作為癌基因而存在的miRNA。這提示在外界環(huán)境不佳的條件下,腫瘤細胞可以通過釋放有利于腫瘤進展的miRNA從而促進其惡性表型以及轉移形成等過程。

外泌體miRNA參與調控NPC細胞增殖、侵襲以及免疫調節(jié)從而促進腫瘤發(fā)展。Ye等[12]通過miRNA芯片技術比較了NPC患者血清以及TW03細胞系來源的外泌體,發(fā)現(xiàn)均存在miR-24-3p、miR-891a、miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-1908的顯著升高,生物信息學分析推測這些miRNA可能參與了MARK1信號通路的下調,從而影響了細胞的增殖和分化。其中TW03細胞系來源的外泌體可通過抑制T細胞增殖和Th1/Th17細胞分化以及誘導促進Treg細胞的產(chǎn)生,從而削弱T細胞的功能,并通過促進CD4+或者CD8+細胞釋放促炎因子 IL-1β、IL-6和IL-10以及減少IFNγ、IL-2、IL-17等抑炎因子等來調控腫瘤免疫微環(huán)境。后續(xù)實驗[13]則證實了與T細胞增殖分化等密切相關的纖維母細胞生長因子11(fibroblast growth factor 11,FGF11) 是miR-24-3p的直接靶點,外泌體miR-24-3p可通過抑制FGF11的表達從而抑制T細胞功能。相反地,通過靶向miR-24-3p的RNA海綿特異性敲低外泌體miR-24-3p的表達水平可以恢復T細胞增殖和Th1/Th17細胞分化的能力。這均說明了外泌體miRNA在NPC發(fā)生、發(fā)展以及演化過程中發(fā)揮著重要作用。

外泌體LMP1與NPC 潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)被認為是EBV感染B淋巴細胞過程中最為重要的癌基因,并與細胞生長調控以及增殖過程密切相關[14]。Dukers等[15]首先揭示了LMP1與外泌體之間的潛在聯(lián)系。而Meckes等[16]經(jīng)過進一步實驗,發(fā)現(xiàn)NPC源性外泌體內高表達的LMP1不僅可以增加受體細胞及受體細胞外泌體內表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的含量,而且高表達的LMP1與EGFR的外泌體被內皮細胞、成纖維細胞等攝取后通過激活ERK和PI3K/Akt信號通路參與細胞增殖等過程。這提示外泌體LMP1可以影響外泌體組分及其性狀,參與并直接調控腫瘤細胞增殖等惡性進程。

另外從間接調控方面來看,Aga等[17]發(fā)現(xiàn)LMP1能增加外泌體內缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)的表達,而HIF-1α是腫瘤細胞惡性轉化以及發(fā)展中的關鍵轉錄因子,直接促進了腫瘤發(fā)展;Ceccarelli等[18]則證實NPC細胞中LMP1的表達能顯著增加腫瘤細胞外泌體中纖維母細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)的表達,而后者被認為是具有促進血管生成作用的潛在促癌因子。

這些研究均證實外泌體LMP1能從直接調控和間接調控兩方面影響著NPC的進展。鑒于此,靶向LMP1的治療顯得尤為關鍵。有研究[19]發(fā)現(xiàn),在LMP1定向分揀進入外泌體的過程中CD63扮演著重要的角色,用CRISPR/Cas9技術敲除CD63后發(fā)現(xiàn)細胞外泌體中LMP1的含量明顯下降。這指明了一種阻斷LMP1下游信號通路的策略,同時也為治療NPC提供了一種新的思路。

外泌體Galectin9與NPC 半乳凝素9(galectin-9,Gal-9)在調節(jié)T細胞生物學作用、自身免疫以及炎性反應中具有重要作用[20]。有研究[21-22]證實,EBV感染的NPC細胞產(chǎn)生富含Gal-9的外泌體,而Gal-9是成熟Th1細胞膜表面死亡受體Tim-3的特異性激動劑[23],兩者結合可介導成熟Th1細胞的凋亡過程。Klibi等[22]發(fā)現(xiàn)通過阻斷外泌體中的Gal-9/Tim-3的相互作用,可以顯著減緩對Th1細胞的抑制并增強其抗腫瘤作用。說明外泌體Gal-9在促進調節(jié)性T細胞生長、誘導成熟的CD4+Th1+凋亡方面具有重要作用,提示腫瘤細胞可能通過產(chǎn)生外泌體以逃脫免疫監(jiān)視[24],這也預示著此種策略可作為治療NPC的免疫療法之一。

外泌體其他內容物與NPC Shi等[25]證實間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)可以產(chǎn)生高表達纖維母細胞生長因子19(fibroblast growth factor 19,FGF19)的外泌體,與NPC細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其可以通過FGF19-FGFR4依賴的級聯(lián)式ERK信號通路影響NPC細胞間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的過程,從而參與到腫瘤細胞惡性進展的過程中。這也更加深刻地指明除了腫瘤本身產(chǎn)生的外泌體對其的作用外,間充質干細胞來源的外泌體等因素對腫瘤的影響。

除此之外,在NPC細胞外泌體中還存在種類繁多的與其發(fā)生發(fā)展密切相關的因子,包括HS1相關蛋白X-1(HAX-1)[26]、HIF-1α[17]、LMP1相關mRNA[27]、基質金屬蛋白酶13(MMP-13)[28]等。這些因子在傳遞病毒蛋白、參與細胞轉移、調控腫瘤演化發(fā)展以及免疫調節(jié)等方面發(fā)揮了重要的作用,相互作用,共同推動了NPC的惡性進展[21]。

外泌體與口腔鱗癌口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤的24%[29],淋巴結轉移是導致患者五年生存率較低的主要因素。而腫瘤來源的外泌體被認為腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境進行交流的重要方式,并參與到細胞增殖轉移、遷移浸潤等一系列影響之中[30-31]。

外泌體miRNA與口腔鱗癌 Sakha等[32]發(fā)現(xiàn)高度轉移的OSCC細胞株HOC313-LM來源的外泌體可通過激活ERK和AKT信號通路誘導細胞增殖,并發(fā)現(xiàn)外泌體中高表達的miRNA-1246通過直接靶向DENND2D基因(DENN/MADD domain containing 2D)增強了轉移性較差的細胞株HOC313-P的細胞遷移能力。Li等[33]通過miRNA測序發(fā)現(xiàn)不同氧濃度條件下OSCC外泌體差異miRNA之中,miRNA-21的表達水平差異最為顯著,并發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA-21在降低細胞E-鈣黏蛋白表達的同時顯著增加了Snail和波形蛋白的表達水平。這些研究提示外泌體特異性miRNA在口腔鱗癌細胞遷移以及上皮間質轉化中具有重要作用,有可能與腫瘤轉移密切相關。

Dickman等[34]通過RT-qPCR技術發(fā)現(xiàn)在OSCC外泌體中miRNA-142-3p的表達水平明顯高于細胞內。當細胞內miRNA-142-3p的濃度升高時,通過靶向作用于轉化生長因子-β受體1(transforming growth factor-beta receptor 1,TGFBR1)下調細胞內TGFBR1的表達水平使得諸如克隆形成、增殖生長等惡性表征減弱。這提示miRNA在細胞和外泌體內表達水平不同,miRNA分揀進入外泌體是具有特異性的,即腫瘤細胞將具有惡性特征的miRNA分揀進入外泌體,然后傳遞給其他腫瘤細胞以及基質細胞等從而影響和改變腫瘤細胞的一系列惡性行為。

其他 據(jù)既往研究[35-36]證實,腫瘤細胞攝取和內化外泌體取決于細胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (heparin sulfate proteoglycans,HSPGs),而肝素可以競爭性結合HSPGs的共受體。Sento等[37]通過肝素處理OSCC后發(fā)現(xiàn),肝素可通過阻斷腫瘤細胞與外泌體的融合內化,阻斷外泌體對腫瘤細胞增殖分化等影響,這也為臨床治療OSCC提供了一個新的思路。

外泌體與舌癌盡管目前手術和放化療水平的進展迅速,但舌癌患者仍然具有高居不下的轉移率和死亡率[38],舌癌細胞來源的外泌體在其中占有重要的地位。

外泌體CAV1與舌癌 小窩蛋白1(caveolin-1,CAV1)在多種類型的細胞中均有表達[39],文獻[40]報道CAV1在介導腫瘤細胞增殖、侵襲等惡性行為方面具有重要作用。Vered等[41]發(fā)現(xiàn),舌鱗癌細胞株HSC-3能產(chǎn)生富含CAV1的外泌體,能將CAV1通過外泌體運輸?shù)男问綇哪[瘤細胞橫向轉移至腫瘤微環(huán)境中。這說明含有CAV1的外泌體在舌鱗癌發(fā)生發(fā)展中可能具有重要的作用。

外泌體蛋白質與舌癌 有研究者[42]通過研究舌鱗癌Tca8113細胞和正?？谇火つぜ毎饷隗w之間的蛋白組學表達差異,發(fā)現(xiàn)腫瘤拒絕抗原1(gp96)和纖維母細胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)蛋白具有最顯著的差異。目前研究[43]證實,gp96參與抗原遞呈過程,在抗腫瘤特異性免疫反應中具有重要作用,推測腫瘤細胞可能通過產(chǎn)生富含gp96的外泌體排除自身抗原,從而逃避免疫監(jiān)視;而FGFR2在口腔鱗癌[44]和胃癌、直腸癌[45]等腫瘤中均存在表達,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和演化中具有重要的促進作用。

其他 廖貴清等[46]較先從舌鱗癌細胞株Tca8113培養(yǎng)上清液中分離純化外泌體,并通過體外抗瘤試驗表明,負載外泌體的樹突狀細胞(dendritic cell,DC)誘導的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對Tca8113細胞的殺傷率明顯強于未負載外泌體的對照組。提示外泌體在抗原遞呈等腫瘤免疫領域具有很強的應用前景,有望形成新型的腫瘤疫苗。

外泌體與喉癌目前外泌體在喉癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)研究中的報道相對較少。Wang等[47]通過研究發(fā)現(xiàn),LSCC患者血清中外泌體miRNA-21和HOTAIR的表達水平與患者臨床分級、T分期以及淋巴結轉移密切相關,更重要的是通過miRNA-21和HOTAIR的聯(lián)合檢驗能夠篩查可能罹患LSCC的患者,具有較高的敏感性和特異性。這預示著miRNA-21和HOTAIR的聯(lián)合檢驗可以作為潛在的LSCC患者診斷的標志物以及預后評價的指標之一。外泌體與LSCC之間的聯(lián)系有待于進行更多的基礎及臨床研究來揭示。

結語頭頸部惡性腫瘤作為全球第六大惡性腫瘤,較高的發(fā)病率及較差的預后一直以來制約著患者的生活水平和壽命[48]。雖然發(fā)現(xiàn)外泌體的時間不長,但外泌體在頭頸部惡性腫瘤以及其他腫瘤中潛在的研究價值卻越來越受到關注。外泌體內各種“貨物”通過細胞間物質交換、傳遞參與了頭頸部惡性腫瘤的增殖遷移、耐藥轉移以及免疫調節(jié)等各個生物學過程,推動了腫瘤的惡性發(fā)展,這有助于更加深刻地認識頭頸部惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的內在機制。與此同時,研究者們一直致力于篩選頭頸部惡性腫瘤患者血清等體液中存在的外泌體作為合理穩(wěn)定的生物標志物以期能進行早期篩查、靶向治療和預后判斷等方面。

盡管外泌體在頭頸部惡性腫瘤中的研究日益豐富,但是仍然存在許多問題亟待解決。就外泌體本身而言,外泌體是否依據(jù)其形態(tài)和功能具有更細致的分類是擺在眾多研究者面前的重要問題[49];外泌體被細胞攝取后外泌體內的成分是否一定能夠發(fā)揮作用也值得我們進一步探尋[50]。而在頭頸部惡性腫瘤的診治方面,外泌體作為生物標志物在特異性、敏感性、穩(wěn)定性和臨床適用性等方面是否優(yōu)于傳統(tǒng)的血清標志物;利用外泌體作為頭頸部惡性腫瘤化療藥物載體給藥是否存在抗原性以及毒性等問題都有待論證。這些問題都值得我們進一步探索外泌體以及外泌體在頭頸部惡性腫瘤中的作用。