胡倍源(綜述) 覃 偉 董瓊珠 欽倫秀,,3(審校)

(1復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040;2復旦大學生物醫(yī)學研究院 上海 200032;3復旦大學腫瘤轉(zhuǎn)移研究所 上海 200040)

原發(fā)性肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,全球范圍內(nèi)每年新發(fā)病例數(shù)超過85萬,病死人數(shù)高達70萬,其中一半發(fā)生在中國,發(fā)病率有逐年上升的趨勢,已成為我國惡性腫瘤第二大死因[1]。在所有原發(fā)性肝癌中,肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的類型,約占90%[2],具有易復發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡率高、預后差等特點。臨床上大多數(shù)HCC患者明確診斷時已是中、晚期,因而喪失了手術(shù)治療的時機。

索拉非尼作為一種抗腫瘤的新型多靶向性口服藥物,通過抑制酪氨酸激酶受體(如VEGFR、PDGFR、c-Kit和RET)和下游的 Raf 絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase)活性,從而發(fā)揮抑制腫瘤血管生成和促進腫瘤細胞凋亡等方面的作用[3]。Ⅲ期臨床試驗 SHARP和Oriental研究證實,索拉非尼(sorafenib)可以延長晚期肝癌患者生存期,并且在不同的國家地區(qū)、不同的肝病狀態(tài)被證明有明確的生存獲益,成為進展期HCC的標準一線療法。然而,HCC對其耐藥性的出現(xiàn)顯著影響療效。耐藥可分為原發(fā)性(HCC原本就對索拉非尼缺乏敏感性)和獲得性(開始敏感,治療過程中出現(xiàn)耐藥)兩類,但其機制尚不清楚且不盡相同。因而,進一步探討HCC對索拉非尼的耐藥機制具有一定的臨床價值。

索拉非尼耐藥相關(guān)信號通路目前,比較公認的參與索拉非尼耐藥的信號通路包括PI3K/Akt、JAK/STAT和Ras/Raf/MEK/ERK。有研究發(fā)現(xiàn)HCC細胞可通過上調(diào)EGFR及其配體引起下游通路Ras/Raf/MEK/ERK的持續(xù)活化,從而誘導索拉非尼原發(fā)性耐藥的產(chǎn)生[4-5]。PI3K/Akt及JAK/STAT等通路與肝癌的繼發(fā)性耐藥有關(guān)[6-7]。

Rudalska等[8]利用一種能夠直接在活體小鼠肝癌組織中進行shRNA篩選的系統(tǒng)(RNAi掃描)來鑒定可能參與肝癌耐藥的相關(guān)基因:敲除Mapk14(p38a)基因抑制了Mapk14依賴的MEK-ERK和Atf2信號通路的激活,進而增強索拉非尼對小鼠HCC的療效并延長了小鼠生存時間。與上述研究結(jié)果一致的是,Mapk14-Atf2信號通路的激活與接受索拉非尼治療的肝癌患者臨床療效欠佳密切相關(guān)。應(yīng)用Mapk14抑制劑可明顯改善肝癌患者對索拉非尼治療的敏感性,提高療效。Rui等[9]研究發(fā)現(xiàn)HCC細胞可通過分泌GRP78激活EGFR/SRC/STAT3信號通路,增強HCC細胞對索拉非尼的耐受性。Tomonari等[10]通過對比肝癌耐藥細胞與親代敏感細胞的膜表面蛋白表達差異,發(fā)現(xiàn)多重耐藥轉(zhuǎn)運蛋白MRP3的表達水平顯著升高,而經(jīng)典的耐藥相關(guān)信號轉(zhuǎn)導蛋白(如Akt/pAkt、mTOR/pmTOR和ERK/pERK)的量未出現(xiàn)明顯變化;敲除MRP3基因后,可恢復肝癌細胞對索拉非尼的敏感性。有研究表明,NUPR1通過激活下游RELB/IER3/RUNX2通路促進HCC細胞的生長、侵襲和增強其對索拉非尼的耐藥性[11]。MDIG可以通過抑制H3K9me3/p21的表達促進肝癌細胞的增殖及降低其對索拉非尼的敏感性[12]。FGF19及其受體FGFR4過表達能減少活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生和抑制細胞凋亡,從而導致肝癌細胞耐藥的發(fā)生[13]。由于肝癌細胞產(chǎn)生對索拉非尼耐藥性的機制復雜,單獨使用針對某一耐藥靶點的抑制劑往往療效甚微,而使用聯(lián)合方案又會帶來的巨大毒性作用和不良反應(yīng),故目前急需研發(fā)針對多耐藥靶點的抑制劑。

肝癌細胞自身改變對耐藥的影響

自噬 自噬被認為是細胞的一種防御和應(yīng)激調(diào)控機制,參與消除、降解和消化一些受損、變性、衰老及失去功能的細胞、細胞器和變性蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的過程[14]。He等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-21可通過激活Akt/PTEN通路,抑制肝癌細胞的自噬發(fā)生和促使肝癌細胞對索拉非尼產(chǎn)生耐藥。Wu等[16]也發(fā)現(xiàn)肝癌細胞可通過ADRB2介導的Akt依賴途徑破壞Beclin1/VPS34/Atg14復合體形成,抑制自噬的發(fā)生和誘導缺氧誘導因子1α (hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)的表達,進而對HCC細胞進行糖代謝重編程和誘導索拉非尼耐藥性的產(chǎn)生。然而,Luo等[17]發(fā)現(xiàn),PSMD10可通過促進肝癌細胞發(fā)生自噬,進而誘導肝癌細胞對索拉非尼或常規(guī)化療藥物產(chǎn)生耐藥。上述實驗結(jié)果提示,自噬在誘導肝癌細胞對索拉非尼耐藥過程中扮演著雙重角色,可能在腫瘤不同的進展階段發(fā)揮著不同的作用,也可能是由于不同受體激活下游不同通路導致自噬的促進或抑制,但具體選擇機制仍需進一步研究加以證實。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)概念于20世紀80年代早期由Elizabeth Hay提出[18],她觀察到在雞胚原條中上皮細胞向間充質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化。在EMT期間,上皮細胞失去相互連接和細胞極性,重組細胞骨架,改變細胞形態(tài)以及重編程某些基因表達。這種改變增強了細胞的運動能力,促進了侵襲表型的轉(zhuǎn)變[19]。EMT被普遍認為與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,亦有文章表明其與肺癌[20]、胰腺癌[21]、乳腺癌[22]等耐藥有關(guān)。近期有學者指出EMT在肝細胞癌耐藥中亦扮演著重要的角色。Xia等[23]通過比較復發(fā)和非復發(fā)HCC患者組織樣本中的microRNA表達情況,發(fā)現(xiàn)miR-216a/217的表達水平與EMT程度密切相關(guān)。過表達miR-216a/217的肝癌細胞通過減少靶基因PTEN和SMAD7的表達,激活了PI3K/Akt和TGF-β信號通路,從而促使肝癌細胞耐藥的發(fā)生和肝癌復發(fā)。此外,Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)Gal-1可通過激活PI3K/Akt通路,誘導HCC細胞發(fā)生EMT;相關(guān)臨床數(shù)據(jù)也表明,Gal-1的高表達與HCC不良預后及肝癌細胞耐藥密切相關(guān)。Chen等[25]發(fā)現(xiàn)血管生成素樣蛋白1(angiopoietin-like 1,ANGPTL1)可以阻斷MET受體-AKT/ERK-Egr-1-Slug信號通路,抑制肝癌細胞EMT及干性的表達,從而增加耐藥細胞對索拉非尼的敏感性,這一結(jié)果也間接提示EMT在肝癌對索拉非尼耐藥中發(fā)揮著重要作用。

鐵死亡 與傳統(tǒng)意義上的細胞凋亡和壞死不同,鐵死亡(ferroptosis)是由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物的過度積累而導致的細胞死亡形式。在細胞內(nèi),鐵參與線粒體中發(fā)生的氧化磷酸化過程,該過程產(chǎn)生ATP的同時也伴隨ROS的產(chǎn)生。當ROS水平超過細胞抗氧化能力時可導致氧化應(yīng)激反應(yīng),直接和間接損害細胞內(nèi)大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)),進而導致細胞損傷或死亡[26]。最近,一項研究顯示HCC細胞可通過增加金屬硫蛋白的生成,減少谷胱甘肽生成和削弱脂質(zhì)過氧化作用,抑制索拉非尼引起的鐵死亡,進而導致肝癌細胞耐藥[27]。這一新的發(fā)現(xiàn)可能為肝癌細胞的耐藥機制研究開辟新的方向。

腫瘤起始細胞 腫瘤起始細胞(tumor-initiating cells,T-ICs)是一群具有自我更新、多向分化潛能,且能啟動和重建腫瘤組織表型能力的癌細胞。大量研究均表明,T-ICs參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、復發(fā)和對放化療的耐受。Lo等[28]研究發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株中T-ICs的比例較敏感株顯著增加。Tovar等[29]同樣證實了耐藥細胞中T-ICs的比例增加,除此之外,他們還篩選出敏感株和耐藥株的差異表達基因。其中,胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)與纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)上調(diào)最為顯著,其下游Akt通路被激活后均可增強腫瘤細胞的干性和對索拉非尼產(chǎn)生耐藥。另有研究表明,C8orf可抑制NOTCH2信號通路,進而減弱肝癌起始細胞的自我更新能力和增強索拉非尼的敏感性[30]。目前關(guān)于T-ICs的定義還頗具爭議,用于分選肝癌起始細胞的表面標志物尚未明確,故現(xiàn)有治療都無法針對腫瘤干細胞進行殺傷,這些問題都將是未來研究的方向。

腫瘤微環(huán)境對肝癌耐藥影響

腫瘤相關(guān)基質(zhì)細胞 腫瘤與環(huán)境,兩者既相互依存、相互促進,又相互拮抗、相互斗爭。目前認為腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等有著密切聯(lián)系[31]。Chen等[32]發(fā)現(xiàn)在索拉非尼治療后,腫瘤內(nèi)缺氧增加,由缺氧誘導的基質(zhì)細胞衍生因子1α(stromal cell derived factor-1α,SDF1α)表達上調(diào),通過趨化因子SDF1α/CXCR4軸,HCC細胞可募集骨髓細胞,促進血管生成,還能直接調(diào)節(jié)EMT表型轉(zhuǎn)化,引起耐藥;另外還發(fā)現(xiàn)缺氧促進免疫抑制,瘤內(nèi)CD8+T淋巴細胞浸潤減少,程序性死亡配體1表達增加,調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)及M2型巨噬細胞數(shù)量增加,因此作者嘗試了PD-L1抑制劑、CXCR4抑制劑與索拉非尼聯(lián)用,取得了不錯的治療效果。Amalia等[33]發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白(Ln)-332,一種由肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)產(chǎn)生的異源三聚體糖基化蛋白,與肝癌細胞表面配體α3β1整合蛋白結(jié)合后,引起下游被索拉非尼泛素化的FAK發(fā)生磷酸化,進而引發(fā)耐藥。Zhou等[34]觀察到對患者和小鼠腫瘤模型使用索拉非尼治療后,其腫瘤相關(guān)中性粒細胞(tumor-associated neutrophils,TAN)顯著增多,伴隨CCL2 和 CCL17表達升高,使巨噬細胞以及Treg的遷移活性增加;隨后證實索拉非尼引起的缺氧可以通過HCC細胞的HIF1α/NF-κB/CXCL5通路募集TAN,TAN分泌細胞因子CCL2和CCL17,分別與巨噬細胞上的受體CCR2 以及Treg上的受體CCR4結(jié)合,募集巨噬細胞和Treg到HCC細胞周圍以促進其生長、進展和對索拉非尼耐受。

外泌體 外泌體(exosome)是細胞衍生的囊泡,可能存在于所有生物液體中,包括唾液、尿液、血液、腹水和腦脊髓液,體液如血清和血漿等,以及細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。外泌體直徑在30～100 nm,密度范圍在1.13～1.19 g/mL[35],成分復雜多變,如mRNA、microRNA、DNA、熱休克蛋白、酶、MHC受體、四糖蛋白、脂筏、細胞骨架元素及膜轉(zhuǎn)運蛋白等[36]。目前在乳腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、腎癌、卵巢癌中均有外泌體參與腫瘤耐藥過程的報道[37-40]。在肝癌方面,Zhen等[41]發(fā)現(xiàn)來自高侵襲性肝癌細胞的外泌體比來自低侵襲性肝癌細胞的外泌體有更強的效力,高侵襲性肝癌細胞外泌體激活了敏感細胞HGF/c-Met/Akt 信號通路,導致細胞凋亡被抑制,進而使敏感細胞對索拉非尼敏感性降低。外泌體作為近年研究的熱點,與肝癌耐藥方面的研究非常少,這與肝癌耐藥細胞誘導難度大、細胞外泌體分泌量少密切相關(guān)。隨著外泌體試劑盒的改進與誘導方法的改良,這一瓶頸可能會得到突破。

腫瘤血管選定 血管選定這一現(xiàn)象最早由Holash等[42]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中證實,腫瘤在早期階段利用組織中現(xiàn)有血管促進自身的生長。而Kuczynski等[43]首次發(fā)現(xiàn)肝癌最初只依賴于自己生成的血管,但隨著索拉非尼治療的開始,肝癌細胞可以通過“劫持”附近肝組織的正常血管為自己提供血供,從而避開了索拉非尼對血管生成的抑制。此外他們還發(fā)現(xiàn),血管選定過程是可逆的。在停用索拉非尼后,肝癌組織會重新使用自己生成的血管,而這個現(xiàn)象為解釋“耐藥后停藥一段時間,腫瘤可再次對原抗血管生成藥物產(chǎn)生反應(yīng)”提供了一種可能。miRNA測序和功能成像提示在血管選定期間腫瘤出現(xiàn)了EMT,說明腫瘤細胞的遷徙促使了這一現(xiàn)象發(fā)生,抑制腫瘤細胞的遷徙或許能為抗腫瘤耐藥提供一個新的選擇。

結(jié)語索拉非尼的原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥的機制不盡相同,涉及多分子、多通路。盡管目前已從腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境水平探討了影響索拉非尼的耐藥因素及其相應(yīng)機制,但大多數(shù)實驗局限在細胞和動物模型水平,其實驗結(jié)果能否外推到人體仍有待進一步證實。近期,一些新技術(shù)的出現(xiàn)(如細胞的3D打印技術(shù)和類器官培養(yǎng)技術(shù)等)將有助于我們更好地利用疾病模型或者藥物篩選平臺開展研究。此外,液體活檢技術(shù)的進步可以更準確地識別索拉非尼敏感性分子標志物,篩選索拉非尼最大獲益人群,也可預測索拉非尼耐藥出現(xiàn)的風險與時間節(jié)點,有利于尋找針對性干預和逆轉(zhuǎn)的新策略,指導臨床精準用藥,提高療效。同時,隨著休眠腫瘤細胞等概念的提出,以及胃腸菌群參與腫瘤耐藥過程的發(fā)現(xiàn),其必定會進一步明確肝癌耐藥的相關(guān)機制。