，　，　，　　，　　

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，　廣州 510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室，　廣州 510006；3.中藥材國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣州綜合試驗(yàn)站(CARS-21-16)，　廣州 510006；4.廣東省南藥規(guī)范化種植與綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心　廣州 510006)

廣金錢草(Desmodiumstyracifolium(Osbeck) Merr.)為豆科山螞蝗屬(Desmodium)植物，為兩廣地區(qū)常用大宗中藥材，始載于《嶺南草藥志》，以龍鱗草記載，1977 年《中華人民共和國(guó)藥典》收錄并定名為“廣金錢草”。以干燥地上部分入藥，具有利濕退黃、利尿通淋的功效，主要用于治療黃疸尿赤、熱淋、石淋、小便澀痛、水腫尿少等癥[1]。因?yàn)閺V金錢草療效確切，其年消耗量越來(lái)越大，野生資源不能滿足人們醫(yī)療保健的需要和制藥企業(yè)對(duì)中藥材原料的需求[2]，開展大面積人工種植勢(shì)在必行。生產(chǎn)上廣金錢草主要依靠種子繁殖，目前關(guān)于種子生產(chǎn)方面的研究報(bào)道較少，僅限于種子硬實(shí)、萌發(fā)[3]等，未見種子采收期的研究，其落果性很強(qiáng)，收獲期過早或過晚都會(huì)影響種子產(chǎn)量和質(zhì)量，從而影響種苗的質(zhì)量，最終降低藥材產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，本研究以采收時(shí)間對(duì)廣金錢草種子質(zhì)量和產(chǎn)量影響研究為目標(biāo)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)種子成熟過程中生理變化，綜合多項(xiàng)指標(biāo)確定廣金錢草種子最佳采收期，為廣金錢草種子生產(chǎn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1　實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1　實(shí)驗(yàn)地自然概況

本試驗(yàn)于廣州市廣東藥科大學(xué)藥用植物園實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行(113°42′E，22°52′N)。土壤基本狀況：pH值7.22，有機(jī)質(zhì)2.00%，其中含氨態(tài)氮7.4 mg/kg，速效磷60 mg/kg，速效鉀60 mg/kg，肥力中等。屬于南亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫22 ℃，年降水量1 736 mm，年蒸發(fā)量1 700～1 800 mm，年日照時(shí)數(shù)1 800～2 100 h。

1.2　供試材料

供試用廣金錢草種子購(gòu)自廣西省玉林市藥材市場(chǎng)，濃硫酸浸泡9 min[3]，發(fā)芽率為92%，將處理好的種子與干凈河沙按照1∶3比例混合，于2014年4月中旬撒播，進(jìn)行正常大田管理，6月中旬移栽，共移栽100株。從盛花期開始10～35 d，每隔5 d收集種子1次，按照全株分別采集，10次重復(fù)。

1.3　儀　器

UV-2450紫外分光光度計(jì)(日本島津儀器有限公司)； TG 16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智儀器有限公司)； DK-S 26電熱恒溫水浴鍋、DHG電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏儀器有限公司)；JA 2603 B萬(wàn)分之一電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1　種子千粒重、發(fā)芽率測(cè)定

表1不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子的形態(tài)變化

盛花期后天數(shù)(d)果莢顏色長(zhǎng)度(mm)寬度(mm)種皮顏色比例(%)種子形狀綠：84．33±8．7610綠色1．22±0．07Dd0．86±0．05Dd黃：9．67±4．81近圓形黃褐：6．00±1．53綠：44．38±5．2915綠色1．47±0．05Cc1．03±0．04Cc黃：46．85±0．88近圓形黃褐：8．77±2．03綠：20．33±7．5420黃綠1．75±0．02Bb1．23±0．02Bb黃：66．00±6．43腎形黃褐：13．67±0．67綠：13．67±8．0125黃1．87±0．04AaB1．32±0．03Aba黃：73．67±8．11腎形黃褐：12．67±2．03綠：6．00±2．0830黃褐1．92±0．02Aa1．35±0．02Aa黃：79．67±3．28腎形黃褐：14．33±1．20綠：6．01±1．0235黃褐1．90±0．05AaB1．33±0．03Aba黃：78．32±3．33腎形黃褐：15．67±2．00

注：表中大寫字母表示差異極顯著p<0.01，小寫字母表示差異顯著p<0.05。下同。

按《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 3543.1—3543.7)[4]進(jìn)行。

種子千粒重：隨機(jī)選取自然風(fēng)干種子1 000粒稱重，重復(fù)3次。

種子發(fā)芽率：以濾紙作為發(fā)芽床，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻擺放100粒種子，放入光照培養(yǎng)箱(恒溫25 ℃)進(jìn)行培養(yǎng)，各設(shè)5次重復(fù)。10 d為發(fā)芽期界限，胚根露出1 mm視為發(fā)芽。

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)(第10天)/供試種子總數(shù)×100%。

2.2　種子含水量測(cè)定

將5.00 g風(fēng)干的種子稱重，放入105 ℃烘箱烘至恒重，取出后放在干燥器內(nèi)冷卻稱重，公式如下[5]。

含水量(%)=(W2-W3)/(W2-W1)×100%

W1為最后一次恒重時(shí)稱量瓶的質(zhì)量，W2為未進(jìn)行烘干前稱量瓶加種子的質(zhì)量，W3為烘干后稱量瓶加種子的質(zhì)量。

2.3　生理生化指標(biāo)測(cè)定

可溶性糖和淀粉含量參考高俊鳳[6]的方法測(cè)定，SOD活性參考李合生[7]的方法測(cè)定，POD活性參考李玲的方法測(cè)定[8]。

3　結(jié)果與分析

3.1　不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子形態(tài)變化

不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子的長(zhǎng)度、寬度與種皮顏色都發(fā)生了顯著變化(表1)。盛花期10～15 d，果莢顏色鮮綠色，20 d后果莢轉(zhuǎn)黃綠色，25 d果莢褪綠，轉(zhuǎn)變黃色，30～35 d，果莢轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，果殼干縮。盛花期10～20 d種子長(zhǎng)度和寬度迅速增加，30 d達(dá)到最大值。廣金錢草種子的顏色有綠、黃、黃褐3種顏色，3種顏色在不同發(fā)育時(shí)期的比例不同，盛花期10 d種子種皮以綠色為主，種子含水量較高，種子容易破碎。隨著種子發(fā)育綠色種皮種子比例迅速下降，直到盛花期30 d降低到最低值6.00%；黃色種皮種子比例呈現(xiàn)相反變化趨勢(shì)，盛花期10 d最低9.67%，30 d達(dá)到最大值78.32%。種子形狀隨種子發(fā)育的變化不是很明顯，從盛花期20 d呈現(xiàn)成熟種子的腎形，此后維持穩(wěn)定不變。

由圖1可以看出，在盛花期10～25 d，廣金錢草種子呈現(xiàn)出迅速增長(zhǎng)期，25～35 d增長(zhǎng)緩慢。說(shuō)明盛花期第10～25天是廣金錢草種子形態(tài)建成的關(guān)鍵時(shí)期。

3.2　不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子含水量變化

由圖2可以看出，廣金錢草種子不同發(fā)育時(shí)期種子含水量發(fā)生了顯著變化，盛花期10～15 d，含水量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，第15天達(dá)到54.02%，之后含水量迅速下降，第35天含水量降至17.26%，此時(shí)種子內(nèi)干物質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于自由水含量，硬度增加，不容易破碎。

圖1　不同發(fā)育時(shí)期種子大小變化

圖2　不同發(fā)育時(shí)期種子含水量變化

3.3　采收時(shí)間對(duì)廣金錢草種子質(zhì)量及產(chǎn)量影響

由表2可以看出，種子發(fā)芽率在盛花期10～15 d天變化不大，盛花期20 d迅速上升，第35天達(dá)到最大值，為79.67%。在盛花期15～35 d種子千粒重均極顯著高于第10天，表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但差異不顯著。而單株產(chǎn)量表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，盛花期第30天最高，達(dá)13.07 g/株，是35 d的2.07倍。

表2采收時(shí)間對(duì)廣金錢草種子質(zhì)量及產(chǎn)量影響

盛花期后天數(shù)(d)發(fā)芽率(%)千粒重(g)單株產(chǎn)量(g/株)1014．00±0．58D1．23±0．03Bb6．41±0．87Bc1517．00±1．15D1．54±0．07Aa9．84±1．39ABb2034．00±2．65C1．59±0．02Aa9．74±0．42ABb2554．67±2．73B1．65±0．03Aa11．78±0．87Aab3074．33±2．94A1．67±0．04Aa13．07±1．41Aa3579．67±5．24A1．65±0．04Aa6．30±0．31Bc

3.4　不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子內(nèi)含物的變化

3.4.1不同發(fā)育時(shí)期的種子中可溶性糖含量變化

由圖3可以看出，廣金錢草種子發(fā)育早期，盛花期10～15 d種子中可溶性糖含量增長(zhǎng)緩慢，第10天可溶性糖含量?jī)H為0.10 mg/g，隨著種子進(jìn)一步生長(zhǎng)，種子中可溶性糖含量迅速上升，20～35 d顯著高于10～15 d(p<0.05)，盛花期20 d較15 d增長(zhǎng)了102%，20～30 d增長(zhǎng)緩慢，35 d略有降低。

圖3　不同發(fā)育時(shí)期種子可溶性糖含量變化

3.4.2不同發(fā)育時(shí)期種子中可溶性蛋白含量變化

不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子中可溶性蛋白含量變化見圖4，盛花期10 d可溶性蛋白含量為0.30 mg/g，隨種子發(fā)育其可溶性蛋白含量逐漸增加，15～35 d顯著高于10 d(p<0.05)，盛花期35 d達(dá)到最大值，可溶性蛋白含量為0.36 mg/g。

3.5　不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子抗氧化酶活性變化

3.5.1不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子SOD活性變化

由圖5可以看出，廣金錢草種子在發(fā)育過程中，SOD活性呈現(xiàn)出降低-升高-降低的“S”形變化趨勢(shì)。盛花期10～15 d，SOD活性變化不大，15 d以后迅速增強(qiáng)，30 d達(dá)到最大值，而后逐漸降低。

圖4　不同發(fā)育時(shí)期種子可溶性蛋白含量變化

圖5　不同發(fā)育時(shí)期種子SOD活性變化

3.5.2不同發(fā)育時(shí)期廣金錢草種子POD活性變化

從圖6可以看出，隨著廣金錢草種子的發(fā)育，POD活性呈規(guī)律性變化，盛花期10～25 d POD活性逐漸上升，25～35 d POD活性有所下降，35 d達(dá)到最低值。

圖6　不同發(fā)育時(shí)期種子POD活性變化

4　小結(jié)與討論

4.1　廣金錢草種子發(fā)育過程中形態(tài)變化分析

種子的發(fā)育一般有體積膨大、干物質(zhì)充實(shí)和種子成熟3個(gè)階段，種子內(nèi)部干物質(zhì)隨著發(fā)育進(jìn)程逐漸積累，種皮顏色也隨著種子的成熟而逐漸變化[9]。通過對(duì)廣金錢草種子發(fā)育過程中種子形態(tài)的觀測(cè)，盛花期15～25 d，種子大小增長(zhǎng)最為迅速，10 d內(nèi)種子面積增長(zhǎng)了約1.62倍，之后種子大小的增長(zhǎng)速度減緩，因此，廣金錢草形態(tài)建成期為盛花期15～25 d。從種皮顏色來(lái)看，廣金錢草種子存在綠、黃、黃褐3種顏色，隨著發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，黃色及黃褐色顏色種子比例逐漸增加。從種子形狀來(lái)看，發(fā)育早期(盛花期20 d)已基本具備成熟種子所呈現(xiàn)的腎形，此后一直保持不變，說(shuō)明種子形態(tài)在整個(gè)種子發(fā)育過程中非常穩(wěn)定。從發(fā)芽率來(lái)看，盛花期10～15 d，種子發(fā)芽率變化不大，20～35 d迅速升高。

依據(jù)果莢顏色、種皮顏色、種子硬度可將廣金錢草種子成熟過程劃分為： 1) 綠莢期。果莢和種子呈綠色，種子容易破碎； 2) 黃莢前期。果莢轉(zhuǎn)黃綠色，種子漸漸變硬； 3) 黃莢后期。果莢褪綠轉(zhuǎn)變黃色，種子硬度增加。 4) 完熟期。果莢干縮，黃褐色，黃色種子比例增加。 5) 過熟期。果莢容易脫落。廣金錢草是無(wú)限花序，下部花先開，種子成熟度不一致的現(xiàn)象普遍存在，種子千粒重、發(fā)芽率也存在較大差異，采收時(shí)成熟度不一致，若等所有種子都在完熟期采收會(huì)造成早熟的種子進(jìn)入過熟期，導(dǎo)致脫落，造成經(jīng)濟(jì)損失。

4.2　廣金錢草種子質(zhì)量及產(chǎn)量變化分析

種子質(zhì)量直接影響藥材質(zhì)量，而采收時(shí)間影響種子質(zhì)量。李帥等[10]通過觀察黃芩盛花期花后18～33 d種子的發(fā)芽率、千粒重、種子活力發(fā)現(xiàn)，盛花期后24 d發(fā)芽率達(dá)到82%，千粒重達(dá)到1.9 g，活力指數(shù)為103.25，達(dá)到生產(chǎn)要求。而花后30 d種子千粒重達(dá)到1.98 g，活力指數(shù)達(dá)到149.88，均達(dá)到最高值，33 d種子有明顯脫落現(xiàn)象，確定盛花期后24～30 d為黃芩種子最佳采收期。夏枯草以果穗顏色為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)果穗全黃時(shí)立即采收，種子千粒重、發(fā)芽率均達(dá)到最大值[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期對(duì)廣金錢草種子產(chǎn)量和質(zhì)量影響較大。其中發(fā)芽率以盛花期30～35 d極顯著高于其他時(shí)期，千粒重從盛花期25～35 d均大于1.60 g，以30 d最高，未達(dá)到顯著差異。單株產(chǎn)量從盛花期10～30 d表現(xiàn)為顯著上升的趨勢(shì)，30 d極顯著高于10～20 d，35 d在采收果莢過程中極容易脫落，造成大量損失，因此，單株產(chǎn)量極顯著降低。

4.3　廣金錢草種子發(fā)育過程中含水量及內(nèi)含物質(zhì)含量變化

在廣金錢草種子發(fā)育過程中含水量呈先上升后下降的趨勢(shì)，盛花期10～15 d呈上升趨勢(shì)，15～30 d后大幅度降低，30～35 d后變化幅度較小。種子可溶性糖含量在盛花期10～15 d變化不大，15～20 d后迅速上升，20～35 d幾乎維持不變?？扇苄缘鞍缀吭诜N子整個(gè)發(fā)育時(shí)期變化幅度較小，說(shuō)明廣金錢草種子可溶性糖在不斷的積累和轉(zhuǎn)化，而可溶性糖的積累速度及積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于可溶性蛋白。這一研究結(jié)果與齊永平[12]的研究結(jié)果類似，但與馬春暉等[13]的研究結(jié)果相反。

SOD和POD是抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，種子發(fā)育過程中獲得脫水耐性、抗氧化損傷等作用，廣金錢草種子發(fā)育過程中SOD和POD活性均表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，SOD活性高峰期在盛花期30 d，POD活性高峰期在盛花期25 d。說(shuō)明種子發(fā)育初期SOD、POD活性的升高有利于保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，使其免受活性氧或其他自由基的傷害，這種積累與種子成熟進(jìn)程保持一致[14-15]。

結(jié)合廣金錢草種子發(fā)育過程中形態(tài)變化、發(fā)芽率、千粒重、產(chǎn)量、含水量及內(nèi)含物的變化，可知盛花期30 d種子發(fā)芽率高，千粒重最大，單株產(chǎn)量最高，可溶性糖含量達(dá)到最大值，SOD活性最高，因此，盛花期30 d為種子的最佳采收期。

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(本欄目責(zé)任編輯：曾勇、周忠燕、趙丹)