，　，　，　，　劉勝,2

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，　長(zhǎng)沙 410018；2.湖南省環(huán)境資源植物開(kāi)發(fā)與利用研究中心，　長(zhǎng)沙 410018)

植物修復(fù)具有高效、環(huán)保和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊應(yīng)用前景的重金屬污染治理方法[1]。篩選出合適的修復(fù)植物是推廣應(yīng)用該方法的前提。礦山自然生長(zhǎng)的豆科植物是優(yōu)良的修復(fù)植物資源，因?yàn)榕c其它植物相比，它們不但能夠適應(yīng)礦山重金屬污染環(huán)境，而且能夠有效固氮、提高土壤肥力，從而更好地治理礦山污染。

野大豆(Glycinesoja) 是栽培大豆 (G.max)的近緣種，具有抗旱、耐旱、耐堿鹽等優(yōu)點(diǎn)，是大豆品種改良的野生資源庫(kù)；該植物還具有良好的固氮能力，并被列為我國(guó)國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物；因而該植物具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)，甚至戰(zhàn)略價(jià)值[2]。尤其值得一提的是，該植物能夠在錳礦礦區(qū)正常生長(zhǎng)、開(kāi)花結(jié)實(shí)[3-4]，是一種有開(kāi)發(fā)價(jià)值的錳污染修復(fù)植物。目前，該植物的研究主要集中于品種改良[5-6]、形態(tài)解剖[7-8]、生物學(xué)與生態(tài)學(xué)特性[9-10]及群體的遺傳分化[11-12]等方面，錳脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響方面的研究較少。

種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)是植物對(duì)環(huán)境脅迫最敏感的時(shí)期，其特征反映了植物對(duì)脅迫的耐性[13]。種子的萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)特征是植物對(duì)脅迫的直接反應(yīng)，是適應(yīng)脅迫的重要特征。萌發(fā)過(guò)程中幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶活性等的改變?cè)谝欢ǔ潭壬戏从撤N子萌發(fā)過(guò)程中代謝、生長(zhǎng)情況。這些特征是揭示植物適應(yīng)環(huán)境的重要依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究錳脅迫對(duì)野大豆種子萌發(fā)特性以及幼苗生理生化特征的影響，揭示該植物適應(yīng)錳脅迫的生理生化機(jī)制。研究結(jié)果可為栽培大豆抗性品種的選育以及野大豆應(yīng)用于錳污染治理的實(shí)踐提供第一手資料。

1　材料與方法

1.1　材料采集

種子采集時(shí)間為2016年11月下旬野大豆種子成熟季節(jié)，地點(diǎn)為湖南省湘潭錳礦區(qū)，該礦開(kāi)采始于100多年前，是我國(guó)最早的錳礦基地，20世紀(jì)80年代之前錳礦開(kāi)采的主要方式為露天開(kāi)采。錳礦開(kāi)采完畢后，部分地段將礦渣與客土混合，然后任其自然恢復(fù)?，F(xiàn)場(chǎng)調(diào)查顯示，該恢復(fù)地有大面積野大豆分布。選擇礦區(qū)100個(gè)植株采集成熟種子，為使種子覆蓋面更廣，各植株間株距超過(guò)2 m。種子采集后放于紙質(zhì)采集袋，帶回實(shí)驗(yàn)室于室溫下儲(chǔ)藏備用。

1.2　萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

挑選顆粒整齊飽滿、大小均一、無(wú)傷害的種子開(kāi)展發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。種子在0.2%的KMnO4中消毒10 min后，用蒸餾水沖洗后晾干。萌發(fā)實(shí)驗(yàn)在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行，在其中設(shè)置6個(gè)錳濃度模擬土壤錳脅迫梯度 (0.005，1，5，8，12 mmol/L和15 mmol/L)。各處理濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，共30個(gè)處理(培養(yǎng)皿)。每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置30粒種子，共計(jì)900粒種子。由于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野大豆在25 ℃下萌發(fā)較好，萌發(fā)實(shí)驗(yàn)選擇在25 ℃的人工氣候箱中進(jìn)行，光周期為12 h白天/12 h黑夜。每天向培養(yǎng)皿中添加去離子水以維持培養(yǎng)液原有水平。種子萌發(fā)期間，每天觀察并記錄發(fā)芽情況。萌發(fā)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展至無(wú)新種子萌發(fā)，共持續(xù)12 d。第8天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，12 d測(cè)定發(fā)芽率。萌發(fā)完畢后，測(cè)定根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、芽鮮重、根鮮重、根干重、芽干重等指標(biāo)。

1.3　測(cè)定方法

1) 萌發(fā)指標(biāo)。

發(fā)芽能力指標(biāo)參照《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》[14]來(lái)計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，具體計(jì)算方法如下：

發(fā)芽率(%)=第8天內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=第4天內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt) (式中，Dt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為在t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù))；

活力指數(shù)(VI)=GI×S(式中，GI為發(fā)芽指數(shù)，S為幼苗高度)。

2) 生物量相關(guān)指標(biāo)。

幼苗芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮重、干重的測(cè)定：萌發(fā)第12天時(shí)，每處理隨機(jī)選取10株幼苗，采用精度為0.1 mm的游標(biāo)卡尺分別測(cè)量幼苗芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)；并用濾紙吸去表面水分后稱量鮮重，然后再于95 ℃下殺青10 min，65 ℃下烘至恒重。

根冠比=根 (地下部分)干重/芽 (地上部分)干重[15]。

3) 幼苗生理生化特性測(cè)定。

于處理第8天測(cè)定種子萌發(fā)過(guò)程中的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量。第10天測(cè)定幼苗的超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化物酶 (POD) 活性和丙二醛 (MDA) 含量。

可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[16]，可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法[16]，游離脯氨酸含量的測(cè)定采用茚三酮顯色法[16]，超氧化歧物酶活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑 (NBT) 光化還原法[16]，過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[16]。

表2錳脅迫對(duì)野大豆幼苗生長(zhǎng)的影響

濃度(mmol/L)芽長(zhǎng)(mm)根長(zhǎng)(mm)芽鮮重(mg)根鮮重(mg)芽干重(mg)根干重(mg)根冠比0．00543．17±2．36b38．33±4．61cd51．47±6．60b17．20±1．81c5．08±0．38bc1．99±0．14c0．391±0．010c145．00±2．64b43．67±2．89bcd58．17±5．21b22．10±3．09bc5．29±0．66bc2．11±0．26c0．398±0．013c552．33±5．85ab69．67±5．31a89．86±8．61a39．03±4．31a7．99±1．30ab4．52±0．74ab0．566±0．014ab861．67±2．09a58．33±4．01ab90．23±9．19a34．77±1．82ab8．97±2．60a5．43±1．57a0．605±0．028a1250．33±8．32ab36．00±4．35d66．00±9．64b19．67±1．67bc7．44±1．63abc5．76±1．26a0．773±0．017a1541．33±5．50b34．67±1．24d58．40±4．85b14．43±2．71c5．93±0．25b3．06±0．13bc0．516±0．013bc

1.4　數(shù)據(jù)處理

種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)各指標(biāo)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對(duì)不同處理間的差異顯著性進(jìn)行多重比較，并用Sigma Plot 12.5軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)

種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)受錳脅迫的直接影響。表1顯示，不同錳濃度下野大豆種子發(fā)芽率在35.0%～72.5%之間，隨著錳濃度的增高，野大豆種子發(fā)芽率呈先增加后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照相比，在錳濃度為5，8，12，15 mmol/L時(shí)，發(fā)芽率分別下降15.79%、36.84%、47.37%、50.87%，說(shuō)明一定濃度的錳抑制野大豆種子發(fā)育，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)表現(xiàn)出與發(fā)芽率一致的趨勢(shì)(表1)?；盍χ笖?shù)綜合了種子發(fā)芽速率和生長(zhǎng)量，能較好地反映種子萌發(fā)質(zhì)量。表1顯示，野大豆種子活力指數(shù)隨著錳濃度的增加呈先上升后下降趨勢(shì)，在錳濃度為8 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，然后下降；與對(duì)照相比，較低錳濃度 (1，5，8，12 mmol/L)下，其值均顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照增加8.00%、52.81%、59.20%、7.72%；錳濃度為15 mmol/L時(shí)，其值則較對(duì)照降低36.87%。

表1錳脅迫對(duì)野大豆種子萌發(fā)的影響

濃度(mmol/L)發(fā)芽勢(shì)(%)發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)活力指數(shù)0．00531．25±2．88c71．25±2．92a8．24±0．07a565．60±7．18d136．25±3．53a72．50±1．89a7．61±0．21ab610．86±6．02c532．50±3．53b60．00±1．30b6．71±0．11ab864．29±5．16b821．25±2．89d45．00±4．18c7．20±0．18ab900．46±5．77a1221．25±2．50d37．50±1．89d7．11±0．41ab609．28±2．36c1518．75±2．73e35．00±1．32d4．90±0．46b357．05±3．81e

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(p<0.05)，下同。

幼苗生長(zhǎng)是植物對(duì)錳脅迫響應(yīng)的綜合體現(xiàn)。表2顯示，隨著錳濃度的增加，野大豆幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)均呈先增加后降低的趨勢(shì)，均在5 mmol/L與8 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，然后逐漸下降。與對(duì)照相比，較低錳濃度(1，5，8，12 mmol/L)時(shí)其值均較高，而較高濃度(15 mmol/L)時(shí)則較低。幼苗的鮮重、干重以及根冠比均表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，說(shuō)明錳脅迫下野大豆幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)、高濃度抑制生長(zhǎng)的規(guī)律。野大豆在高濃度錳脅迫下根與芽生長(zhǎng)的抑制效果較為明顯，尤其是對(duì)根的脅迫。

2.2　可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量的變化

可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸不僅是組成細(xì)胞等結(jié)構(gòu)的主要成分，也是增加滲透性物質(zhì)的重要組成成分，是植物抗性的重要指標(biāo)。圖1顯示，野大豆幼苗的可溶性糖含量隨著錳濃度的升高呈上升趨勢(shì)。其中，錳離子濃度為1 mmol/L時(shí)最低，其值為0.57 mg/g(FW)，在錳離子濃度為12 mmol/L時(shí)最高，其值為0.95 mg/g(FW)；與對(duì)照相比，除1 mmol/L時(shí)較低外，其余各濃度均有一定程度增加。

圖1還顯示，野大豆幼苗可溶性蛋白含量隨著錳濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)錳濃度為1 mmol/L時(shí)最高，錳濃度為15 mmol/L時(shí)最低；與對(duì)照相比，最高可溶性蛋白含量較對(duì)照增加10.36%，在錳濃度為15 mmol/L時(shí)比對(duì)照減少了13.59%。

野大豆幼苗脯氨酸含量也呈先增加后降低的趨勢(shì)，但整體均高于對(duì)照。在錳濃度為5 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值9.72μg/kg，比對(duì)照高出90.21% (圖1)，隨后在錳濃度為8，12，15 mmol/L時(shí)有所下降，但仍分別比對(duì)照增加了38.58%、29.63%、12.83%。

2.3　抗氧化酶活性和膜脂過(guò)氧化

SOD、POD為植物體內(nèi)重要的抗氧化酶。圖2顯示，隨著錳濃度增加，野大豆SOD活性呈上升趨勢(shì)；與對(duì)照相比，其含量分別增加4.27%、6.45%、52.99%、79.48%和146.44%(圖2)。

圖2顯示，野大豆幼苗POD活性隨錳濃度增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。在8 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，比對(duì)照增加8.13%，隨后逐漸下降；與對(duì)照相比，在12 mmol/L時(shí)顯著低于對(duì)照，當(dāng)錳濃度達(dá)到15 mmol/L時(shí)，POD活性比對(duì)照減少了80.30%。

圖1　錳脅迫對(duì)野大豆種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖(A)、可溶性蛋白(B)和脯氨酸(C)含量的影響

圖2　錳脅迫對(duì)野大豆幼苗超氧化物歧化酶(A)、過(guò)氧化物酶(B)的影響

丙二醛 (MDA) 是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量的變化可作為檢測(cè)逆境條件下膜系統(tǒng)受損程度的指標(biāo)。圖3顯示，隨著錳濃度的增加，野大豆幼苗丙二醛含量呈先降低后增加的趨勢(shì)；與對(duì)照相比，在12 mmol/L時(shí)顯著高于對(duì)照，比對(duì)照增加44.44%(圖3)。

圖3　錳脅迫對(duì)野大豆幼苗丙二醛含量的影響

3　討　論

3.1　種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)

種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)是植物生活史中對(duì)外界環(huán)境變化最敏感的階段，能夠較好地反映植物的適應(yīng)能力[17]；發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)均為衡量種子活力的基礎(chǔ)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)野大豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)隨著錳濃度的升高均呈下降趨勢(shì)，這與張秀玲等[18]對(duì)鹽脅迫下野大豆的研究、趙紅玉等[19]對(duì)Cu、Cd、Pb、Zn等4種重金屬脅迫下紅豆草(Onobrychisviciaefolia)、白三葉(Trifoliumrepens)、檸條(Caraganakorshinskii)、胡枝子(Lespedezabicolor)4種豆科植物的研究結(jié)果一致。這說(shuō)明重金屬脅迫下植物發(fā)芽受到抑制是一種普遍現(xiàn)象。

本研究顯示，錳脅迫對(duì)野大豆的生長(zhǎng)表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)和高濃度抑制的效應(yīng)。這與張芬琴等[20]、梁文斌等[21]、張秀玲等[18]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明適量的重金屬可促進(jìn)植物幼苗生長(zhǎng)。本研究還顯示，根受到的抑制程度明顯高于芽，這與張芬琴等[20]、梁文斌等[21]的研究結(jié)果一致，而張秀玲等[18]則發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下野大豆芽受到的抑制程度明顯高于根，這說(shuō)明不同重金屬對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響不一致。例如，過(guò)量的錳引起幼苗中分生細(xì)胞減少，而根尖分生區(qū)是直接接觸錳且易受錳毒危害的部位[21]，因此錳毒對(duì)幼苗胚根的抑制程度大于胚芽，而野大豆胚根和胚芽對(duì)鹽脅迫的敏感程度有所不同，胚芽大于胚根，因而胚芽受到的影響較大。關(guān)于不同重金屬對(duì)植物幼苗生長(zhǎng)的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.2　可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量

可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸均為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。受到重金屬脅迫時(shí)，植物通過(guò)生成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞正常代謝環(huán)境，以減輕重金屬毒害[22]。可溶性糖作為植物碳代謝的物質(zhì)之一，與植物重金屬抗性密切相關(guān)。本研究顯示，野大豆幼苗可溶性糖含量呈現(xiàn)出隨著錳濃度的升高而上升的趨勢(shì)。這與張小艾等[23]、蔣和平等[24]的研究結(jié)果一致。其原因可能是低濃度錳尚不能刺激野大豆發(fā)生防御性反應(yīng)，而是直接破壞了可溶性糖分子結(jié)構(gòu)或抑制可溶性糖合成，導(dǎo)致其含量降低；隨著錳濃度的升高，植物的自我保護(hù)機(jī)制促進(jìn)糖的合成，以滿足幼苗生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

可溶性蛋白含量是植物體內(nèi)酶系統(tǒng)穩(wěn)定的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，野大豆幼苗可溶性蛋白含量呈先上升后下降趨勢(shì)。這與張靜等[25]的研究結(jié)果一致。其原因可能是可溶性蛋白含量的變化是植物響應(yīng)重金屬毒害的一種解毒機(jī)制，而錳的過(guò)量積累則導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞、蛋白質(zhì)變性，使高濃度下可溶性蛋白含量下降[1]。

脯氨酸是一種滲透保護(hù)劑，具有維持細(xì)胞滲透壓、清除活性氧、保護(hù)蛋白質(zhì)及細(xì)胞膜的作用，植物體內(nèi)積累的游離脯氨酸含量與重金屬耐性緊密相關(guān)[26-27]。本研究顯示錳脅迫下野大豆脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。這與張虎等[28]的研究結(jié)果一致。其原因可能是低濃度錳脅迫下，為抵抗外界傷害，植物體積累脯氨酸；而高濃度錳脅迫下植物受毒害程度增加，滲透調(diào)節(jié)平衡被打破，細(xì)胞無(wú)法修復(fù)，導(dǎo)致脯氨酸含量有所下降。

3.3　抗氧化酶活性和膜脂過(guò)氧化

SOD可催化超氧化物陰離子自由基(O2·-)發(fā)生歧化反應(yīng)，有效阻止氧自由基在植物細(xì)胞內(nèi)的積累，從而減輕毒害作用[29]。錳是超氧化物歧化酶的重要組成元素以及活化劑，可促使超氧化物歧化酶活性增強(qiáng)。POD則利用各種基質(zhì)作為電子供體將H2O2還原為水，從而減輕超氧化物的毒害作用。本研究結(jié)果顯示野大豆幼苗的超氧化物歧化酶活性隨著錳濃度的升高而上升，過(guò)氧化物酶活性隨著錳濃度的增加先升高后下降。這與於丙軍等[30]以及張虎等[28]的研究結(jié)果一致。這表明低錳脅迫刺激植物體內(nèi)保護(hù)酶活性提高，以抵御氧自由基對(duì)植物的傷害，提高幼苗在錳脅迫下的自我調(diào)節(jié)能力和耐性；隨著錳脅迫程度的繼續(xù)加強(qiáng)，細(xì)胞抗氧化能力逐漸減弱。

丙二醛是植物在環(huán)境脅迫下脂質(zhì)過(guò)氧化而產(chǎn)生的一種具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，是一種受傷害的指標(biāo)[31]，細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化傷害程度可通過(guò)分析膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的含量來(lái)評(píng)價(jià)。本研究中野大豆幼苗丙二醛含量隨錳濃度的增加呈下降-上升的趨勢(shì)。這與於丙軍等[30]、王松華等[32]的研究結(jié)果一致。其原因可能是在低濃度錳脅迫下，由于保護(hù)酶系統(tǒng)的啟動(dòng)，保護(hù)酶對(duì)丙二醛起到了一定的抑制作用，其含量有所降低；隨著重金屬濃度繼續(xù)增大，保護(hù)酶逐漸降低，丙二醛抑制作用減弱。

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(本欄目責(zé)任編輯：周介雄、戴燚)