史 云(綜述) 于 敏 莫 煒(審校)

(復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系-復(fù)旦大學(xué)代謝和分子醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室 上海 200032)

基因編輯技術(shù)是對基因組 DNA 進行特異的修飾,使DNA發(fā)生定點突變、多位點同時突變、基因插入以及基因缺失等,并在DNA分子水平進行準確的編輯。目前,在基因組定點修飾方面已有了突破性進展,發(fā)現(xiàn)了一種新的基因組定點編輯技術(shù)——規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)結(jié)構(gòu)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-associated protien 9,Cas 9)系統(tǒng),利用 RNA 指導(dǎo)核酸Cas 9對基因組DNA進行定點修飾,這種基因編輯技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于人體細胞、斑馬魚、小鼠及植物等物種的功能基因組學(xué)研究[1]。

CRISPR/Cas 9基因組編輯技術(shù)不受生物體干細胞系的影響,理論上在任何種類生物中都能實現(xiàn)定向、準確的基因改造。在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域,該技術(shù)可以快速構(gòu)建動物和細胞模型;在農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域中,這項技術(shù)可以用于改造植物基因組 DNA 序列,使其滿足人們的需求,如改良玉米、水稻等農(nóng)作物;在臨床醫(yī)療中,CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)可以更加精準而深入地探索疾病發(fā)病機制,研究靶基因的生物功能,提高基因治療的療效。因此,CRISPR/Cas 9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)具有非常廣闊的應(yīng)用價值。本文綜述了 CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的來源、結(jié)構(gòu)、作用原理和其在現(xiàn)代生物學(xué)研究和基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)Ishino等[2]于1987年首次在K12大腸埃希菌(E.coli)的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了功能尚不明確的重復(fù)間隔DNA序列。隨后,大量的相似重復(fù)間隔DNA序列陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。2002年,Jansen與Mojica將這些相似重復(fù)間隔 DNA序列命名為CRISPR,并首次提出了Cas概念[3],報道指出有40%的細菌基因組和90%的古細菌基因組中含有這些重復(fù)序列。2005年,研究者又發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)中的很多間隔序列與宿主菌染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源,推測細菌可能通過CRISPR系統(tǒng)以類似于真核生物的RNA干擾(RNA interference,RNAi)方式抵抗外源核酸序列的入侵,CRISPR基因能夠被轉(zhuǎn)錄,并且Cas基因可以編碼具有核酸酶功能和解旋酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[4]。2007年,Barrangou 等[5]首次發(fā)現(xiàn)并證明細菌可能利用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵。2008年,Marraffini等[6]又發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移,首次利用實驗驗證了 CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的免疫功能。2013年,研究者首次利用CRISPR系統(tǒng)對人293T細胞EMX1 (empty spiracles homeobox 1)和PVALB(parvalbumin)基因以及小鼠來源神經(jīng)瘤母細胞(mouse neuroblastoma N2a cells,Nero 2A)和酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase,Th)進行了定點突變。CRISPR系統(tǒng)能高效編輯基因序列,已分別在人類細胞、小鼠細胞和斑馬魚中成功對部分基因進行編輯[7-9]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)CRISPR是一個多樣性的DNA序列家族,它們具有相同的結(jié)構(gòu),即由一系列長度為20～50 bp的重復(fù)序列(repeat)串聯(lián),中間被一系列長度為26～72 bp的特殊序列(spacer)隔開,構(gòu)成repeat-spacer-repeat的結(jié)構(gòu)模式。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)可分為7～8個亞型,每個亞型包含2～6個不同的特異性Cas基因,其中有6個核心Cas基因Cas1～6廣泛存在于這些Cas亞型中,但是只有Cas1和Cas2存在于所有CRISPR系統(tǒng)中,Cas1還是一個普遍的標志基因。研究者在Cas蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)了核酸外切酶和內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域以及解旋酶、RNA 和 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域等[10-11]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機制目前已發(fā)現(xiàn)3種類型的CRISPR系統(tǒng),其中研究較深入的是第2種類型。CRISPR基因座首先轉(zhuǎn)錄出pre-crRNA (pre-CRISPR-derived RNA)和tracrRNA (trans-activating RNA)。pre-crRNA由RNase Ⅲ和一些未知的酶催化為成熟 crRNA (CRISPR-derived RNA),后者通過堿基配對與tracrRNA 結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物,即single-guide RNA (sg RNA)。Cas 9是一種雙鏈DNA核酸酶,sgRNA通過堿基互補配對原則定位到DNA上的特定位點,招募 Cas 9核酸酶切割DNA,切斷的DNA被細胞內(nèi)修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)的過程中會產(chǎn)生突變,從而達到定點改變基因組的目的,即形成雙鏈斷裂(double strand break,DSB),引發(fā)生物內(nèi)源的非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ) 修復(fù)或同源重組(homologous recombination,HR)修復(fù)。在缺乏同源性染色體模板時,DNA損傷主要通過NHEJ進行修復(fù),這是一種差錯率非常高的修復(fù),會導(dǎo)致在修復(fù)位點或修復(fù)位點附近產(chǎn)生堿基的插入或缺失,如果突變發(fā)生在目的基因的編碼區(qū),就會使目的基因發(fā)生移碼突變,從而達到敲除目的基因的效果[12-14]。第2種方式是在同源性染色體模板存在情況下,通過HR的方式進行精確修復(fù),也可以對特定的核苷酸位點進行替換,從而實現(xiàn)插入特定基因序列的目的。

CRISPR/Cas9的應(yīng)用

建立細胞模型 最近,CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)與誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPS)重編程技術(shù)已經(jīng)成為近年來生命科學(xué)領(lǐng)域兩大熱門技術(shù),誘導(dǎo)iPS轉(zhuǎn)化的成功極大地促進了轉(zhuǎn)化研究,誘導(dǎo)細胞重編程有多種策略,最新的策略包括Oct3/4基因、轉(zhuǎn)錄因子Sox2、原癌基因c-Myc和 Krüppel樣因子4 (抑癌基因Klf4)這4種轉(zhuǎn)錄因子基因引入細胞,誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化成iPS,產(chǎn)生的iPS與胚胎干細胞相似[15]。iPS可作為藥物開發(fā)和高通量復(fù)合物篩選的實驗?zāi)Ｐ图毎鸞16-17]。先進的 DNA測序技術(shù)能夠測出患者體內(nèi)突變的基因序列,而CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)能夠驗證該突變基因與疾病的相關(guān)性。研究證明 CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)可用于對某些遺傳病患者的iPS進行基因修復(fù),修復(fù)后的iPS經(jīng)誘導(dǎo),定向分化成目的組織或器官,從而逐漸取代病變組織或器官。

這種策略已被應(yīng)用到巴斯綜合征的研究,這是一種由X染色體遺傳的心臟病,由Tafazzin基因突變造成。Tafazzin基因編碼線粒體?；D(zhuǎn)移酶,參與合成的雙磷脂酰甘油對心臟結(jié)構(gòu)和功能及其他器官都具有重要作用[18]。Wang 等[19]已經(jīng)研究出能生成巴斯綜合征的“誘導(dǎo)多能性”細胞,然后通過“heart-in-a-chip”模型系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)Tafazzin基因突變影響心肌細胞的組裝和收縮。這些基因突變的因果效應(yīng)驗證了,來源于健康捐贈者的細胞用CRISPR/Cas 9編輯后,生成了Tafazzin基因突變體的iPS,該細胞與巴斯綜合征來源的 iPS產(chǎn)生類似作用[20-21]。此外,iPS可作為巴斯綜合征測試的候選治療藥物。

建立動物模型 為了在動物體內(nèi)模仿人類疾病模型,科學(xué)家們使用CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)生成攜帶突變基因的動物模型,該突變基因的編輯可用于構(gòu)造許多人類疾病,包括酪氨酸血癥[22]、肺癌[23]、肌營養(yǎng)不良的小鼠模型[24]和猴模型[25]。這些疾病的動物模型可用于研究致病機制和測試治療方案。這些動物模型也被用于驗證CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)能否修復(fù)突變基因。Yin等[26]利用尾靜脈注射法將帶有CRISPR和sg RNA的一條單鏈DNA供體注射到患有Ⅰ型酪氨酸血癥的小鼠體內(nèi),以此來探索CRISPR/Cas 9技術(shù)能否治愈該種疾病。Ⅰ型酪氨酸血癥又稱“先天性酪氨酸血癥”,是一種因延胡索二酰乙酰乙酸水解酶 (recombinant fumarylacetoacetate hydrolase,Fah) 基因突變而導(dǎo)致的富馬酰乙酰乙酸鹽水解酶缺乏引起酪氨酸代謝異常、嚴重肝損傷及腎小管缺陷的常染色體隱性遺傳性臨床綜合征。作者發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas 9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯使野生型Fah基因可以表達,能夠挽救部分肝細胞,基因編輯并沒有發(fā)生在所有肝細胞內(nèi),而是隨機編輯肝細胞,編輯后的正常肝細胞得以生存、生長,然后重新填充肝臟[26]。這項研究利用基因編輯技術(shù)選擇性地進行基因修復(fù),且部分修復(fù)成功,這為在體內(nèi)使用這種技術(shù)治療疾病提供了新思路。

CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)可能成為一種治療遺傳疾病的方法。杜氏肌營養(yǎng)不良癥 (duchenne muscular dystrophy,DMD)是一種含致命基因的肌肉萎縮性疾病,由DMD基因制造出一種重要的肌肉萎縮蛋白(dystrophin),導(dǎo)致骨骼肌不斷退化,出現(xiàn)肌肉無力或萎縮,導(dǎo)致行走不便[27]。Eric等[28]和Amy等[29]使用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)攜帶CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的基因為DMD患病小鼠清除有害的 DNA 序列并修復(fù)DMD基因,從而恢復(fù)心肌細胞和肌肉干細胞的功能。

CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)已被用于破壞HIV整合進入宿主的一個至關(guān)重要的基因[30-31]。Khalili等[30]通過尾靜脈注射法將CRISPR/Cas 9系統(tǒng)注射到宿主動物體內(nèi),用于破壞HIV感染的一個重要受體途徑CCR5,研究結(jié)果顯示多器官中HIV病毒表達量有所下降,這為CRISPR/Cas 9治療病毒感染疾病提供了新思路。

生物療法 豬的器官(包括心臟、角膜、肝臟、腎等)與人高度相似,被認為是最有可能成為移植到人體的異種器官[32]。CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)能夠在生物體內(nèi)高效敲除多個基因,這種能力使得該技術(shù)運用于各項研究中[33]。Church實驗室利用 CRISPR/Cas 9技術(shù)去除豬體內(nèi)的62個內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因,從而獲得無逆轉(zhuǎn)錄病毒器官的豬,使其適用于異體移植。Elliiott等[34]證明膠囊包裹的豬胰島細胞移植到Ⅰ型糖尿患者體內(nèi)能夠產(chǎn)生胰島素。

經(jīng)CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)去除內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的豬可以作為生物療法的來源。人血清白蛋白可用于治療休克和肝衰竭,然而昂貴的費用和低產(chǎn)量限制了其在臨床上的使用;而經(jīng)基因編輯的豬有望成為人血清白蛋白的重要來源,當(dāng)然從豬體內(nèi)的白蛋白中分離人血清白蛋白還面臨很大的挑戰(zhàn)。Zhang等[35]利用 CRISPR/Cas 9技術(shù)編輯將豬體內(nèi)編輯血清白蛋白的基因換成了人血清白蛋白的 cDNA。經(jīng)過這種改造的豬雖然只用于為人類提供人血清白蛋白,這也為其他生物療法提供了策略,如在被馴化的動物體內(nèi)生產(chǎn)人源化的多克隆抗體。

結(jié)語CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)編輯的iPS對人類疾病有巨大的治療潛力,特別是單基因突變引起的疾病?；颊邅碓吹膇PS通過CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)進行編輯后,在體外篩選之后再回輸?shù)交颊叩捏w內(nèi),可取代特異性病變的組織或者器官。此外,CRISPR/Cas 9技術(shù)對人類器官進行編輯以及再生療法為生物療法開辟了新的道路。

CRISPR/Cas 9基因編輯系統(tǒng)需要病毒載體將攜帶有Cas 9和sg RNA的基因序列帶入細胞或組織,因此需要一個既安全又高效的DNA傳遞系統(tǒng)來保證基因編輯的安全性[36]。Anc80是一種腺病毒相關(guān)的質(zhì)粒,為基因的傳遞提供了安全的載體,在肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜中已經(jīng)得到驗證[37],動物顯微注射和細胞轉(zhuǎn)染也獲得成功。還需要進一步尋找一種能快速傳遞CRISPR系統(tǒng)到目的器官并具有修復(fù)效應(yīng)的DNA片段。CRISPR/Cas 9系統(tǒng)為構(gòu)建更加安全高效的基因定點修飾技術(shù)提供了廣闊的平臺,雖然尚處于起始階段,但已表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。