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        重組蜥蜴利什曼原蟲載體疫苗的研制現(xiàn)狀

        2018-03-30 05:01:16李文桂陳雅棠
        生物技術(shù)通訊 2018年3期
        關(guān)鍵詞:血清

        李文桂,陳雅棠

        重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所,重慶 400016

        蜥蜴利什曼原蟲(Leishma niatarentolae,Lt)是一種低等真核生物,介于原核和真核之間,可在26℃、低廉的培養(yǎng)基中,以前鞭毛體的形式進行培養(yǎng),可忍耐高密度的細胞培養(yǎng),倍增時間短(5~6 h),可產(chǎn)生高水平蛋白(0.1~30mg/L),這些蛋白可貯存在胞漿內(nèi)或分泌至培養(yǎng)基中。Breton等[1]將5×107蜥蜴利什曼原蟲的前鞭毛體腹腔注射BALB/c鼠,免疫后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾細胞增殖,分泌高水平IFN-γ,但不分泌IL-4,免疫后6周靜脈注射5×107杜氏利什曼原蟲(L.donovani)的前鞭毛體進行攻擊,攻擊后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠肝脾的寄生蟲負(fù)荷降低,提示用蜥蜴利什曼原蟲進行接種可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的保護力。

        蜥蜴利什曼原蟲有36條染色體,通常缺乏GP63、LPG3和A2等毒力因子,可感染人和鼠,但對人體無致病性。它具有原核的基因表達體系和真核的蛋白折疊與修飾體系,有獨特的RNA編輯方式,所有內(nèi)源mRNA加上1段35個核苷酸的先導(dǎo)序列,能被蟲體特異的反義核酸所阻斷。Pirdel等[2]認(rèn)為它可作為一種新型疫苗載體。Ta?heri等[3]報道了一種利什曼原蟲-大腸埃希菌穿梭表達載體pLEXSY,該載體含有1.7kb的基因間區(qū)域(intergenicregion,IR),可在IR內(nèi)插入外源基因,外源基因可被載體內(nèi)部的RNA聚合酶Ⅱ識別和轉(zhuǎn)錄,因此可低水平表達外源蛋白;可以通過增加抗生素的濃度排除低拷貝數(shù)目的細胞,從而提高蛋白的表達水平。大量研究表明蜥蜴利什曼原蟲作為疫苗載體可表達嬰兒利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、剛地弓形蟲、人類免疫缺陷病毒1型、人乳頭瘤病毒16型、丙型肝炎病毒等,本文擬就這方面的研制現(xiàn)狀做簡要綜述。

        1 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的嬰兒利什曼原蟲疫苗

        1.1 重組Lt-A2疫苗

        嬰兒利什曼原蟲(L.infuntum)可引起內(nèi)臟利什曼病,俗稱黑熱病。A2蛋白存在于利什曼原蟲的無鞭毛體內(nèi),含有10個氨基酸的重復(fù)序列,隨著不同程度的重復(fù),相對分子質(zhì)量可為45000~110000,在利什曼原蟲靶向內(nèi)臟的過程中起重要作用。Mizbani等[4]以pKSNEO-A2為模板擴增154bp的A2基因,插入pNEO-GFP得pNEO-GFPA2;將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選培養(yǎng)重組寄生蟲,Northern印跡顯示A2基因插入重組寄生蟲的基因組,免疫印跡顯示黑熱病患者血清識別重組寄生蟲表達的45000的A2蛋白;將5×106重組寄生蟲腹腔注射BALB/c鼠,免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG和IgG1升高,脾細胞分泌高水平的IFN-γ,此時靜脈注射1×107嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊,在攻擊后4周用實時熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)免疫鼠的肝脾寄生蟲負(fù)荷顯著降低。

        1.2 重組Lt-A2-CPA-CPB疫苗

        嬰兒利什曼原蟲的半胱氨酸蛋白酶(cyste?ineproteinase,CP)A/B(CPA/CPB)的相對分子質(zhì)量為24000,可參與利什曼原蟲自噬體的形成,在前鞭毛體向無鞭毛體的轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。Rafati等[5-8]的研究表明重組CP蛋白加弗氏佐劑或混合質(zhì)粒pCB6-CPA和pCB6-CPB腹腔注射BALB/c鼠均可有效對抗1×106嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體攻擊,提示重組CP是較好的疫苗候選分子。由于宿主MHC分子的多樣性和利什曼原蟲抗原結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,宿主將針對抗原的多個表位產(chǎn)生免疫反應(yīng),使得單一抗原成分誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的保護性免疫應(yīng)答效果往往較低,因此,將A2抗原和CPA-CPB抗原的編碼基因連接起來可能是一條較好途徑。Saljoughian等[9]將pEGFP-A2-CPA-CPB與pLEXY-neo2重組得pLEXSY-EGFPA2-CPA-CPB,將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;流式細胞儀檢測表明重組寄生蟲可表達EGFP-A2-CPA-CPB融合蛋白,免疫印跡發(fā)現(xiàn)黑熱病患者血清識別重組寄生蟲表達的相對分子質(zhì)量為103000的融合蛋白;將50μgpCD-A2-CPA-CPB肌肉注射BALB/c鼠,首次免疫后3周靜脈注射2×107重組寄生蟲進行加強,在首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG1和IgG2a升高,IgG1/IgG2a比值大于1,免疫鼠的脾細胞分泌高水平IFN-γ、IL-2和NO,但不分泌IL-10,此時靜脈注射107嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊,攻擊后8周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的肝脾病理變化明顯減輕,寄生蟲負(fù)荷顯著下降。Shah?bazi等[10]將2×107重組寄生蟲皮下注射比格犬,首次免疫后3周加強1次,首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫犬的血清IgG2a升高,外周血單核細胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α,但不分泌IL-10,此時靜脈注射4×107嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊,攻擊后18個月用實時熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)免疫犬骨髓的寄生蟲負(fù)荷明顯降低。

        1.3 重組Lt-KMP11-NTGP96疫苗

        嬰兒利什曼原蟲的動基體膜蛋白11(kineto?plastid membrane protein 11,KMP11)是一種高度保守的膜表面蛋白,在前鞭毛體和無鞭毛體均有表達,可促進T細胞產(chǎn)生IFN-γ。Bhaumik等[11]將100μgpCMV-KMP11-IL-12肌肉注射BALB/c鼠可誘導(dǎo)Th1和Th2型混合性免疫應(yīng)答,并可有效對抗1×106杜氏利什曼原蟲的前鞭毛體攻擊。嬰兒利什曼原蟲的N端糖蛋白96(N-terminalglyco?protein96,NTGP96)屬于 HSP90家族,可參與蛋白質(zhì)的折疊和聚集,具有較強的佐劑活性。Nasiri等[12]以嬰兒利什曼原蟲的基因組DNA為模板分別擴增279bp的KMP11和1014bp的NTGP96基因,將其融合為1293bp的KMP11-NTGP96基因,插入 pJET1.2得 pJET-KMP11-NTGP96,與 pLEX?SY-neo2重組得pLEXSY-KMP11-NTGP96;將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;以從重組寄生蟲體內(nèi)抽提的基因組DNA為模板進行PCR可擴增出1293bp的KMP11-NTGP96融合基因,免疫印跡表明黑熱病患者血清識別重組寄生蟲表達的相對分子質(zhì)量為54000的KMP11-NTGP96融合蛋白;將2×107重組寄生蟲皮下注射BALB/c鼠,首次免疫后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG2a、IgG1升高,IgG2a/IgG1比值小于1,免疫鼠的脾細胞分泌高水平IFN-γ和低水平的IL-4,此時腹腔注射107嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊,攻擊后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾臟寄生蟲負(fù)荷下降2個數(shù)量級。

        2 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的碩大利什曼原蟲疫苗

        2.1 重組Lt-CPA-CPB疫苗

        碩大利什曼原蟲(L.major)可引起皮膚利什曼病,俗稱東方癤。Zahedifard等[13]以pCB6-EGFPCPA-CPB為模板擴增2.3kb的EGFP-CPA-CPB基因,插入pLEXSY-neo2得到pLEXSY-EGFPCPA-CPB;將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,用50μg/mLG418篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;以從重組寄生蟲提取的總RNA為模板進行RT-PCR可擴增出EGFP-CPA-CPB融合基因,Southern印跡證實融合基因插入重組寄生蟲的基因組;將1×107重組寄生蟲腹腔注射BALB/c鼠,首次免疫后2周加強1次,首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG2a和IgG1升高,IgG2a/IgG1比值大于1,免疫鼠的脾細胞分泌高水平IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-4,IFN-γ/IL-4比值升高,此時足墊皮下注射2×105碩大利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊,攻擊后10周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的足墊腫脹明顯減輕,淋巴結(jié)的寄生蟲負(fù)荷下降2個數(shù)量級。

        2.2 重組Lt-PpSP15疫苗

        靜食白蛉的唾液蛋白15(Phlebotomus papata?sisalivary protein15,PpSP15)是一種有效的免疫分子。Katebi等[14]將397bp的PpSP15基因插入pEGFP-N3得pEGFP-PpSP15,與pLEXSY-neo重組得pLEXSY-PpSP15;將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;以從重組寄生蟲抽提的基因組DNA為模板進行PCR可擴增出397bp的PpSP15基因,免疫印跡表明東方癤患者血清識別重組寄生蟲表達的42000的EGFP-PpSP15蛋白;將2×107重組寄生蟲加CPG佐劑皮下注射免疫BALB/c鼠,首次免疫后3周加強1次,首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG2a/IgG1比值大于1,脾細胞分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-17和低水平的IL-5,此時皮下注射2×105碩大利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊,攻擊后11周用實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)免疫鼠淋巴結(jié)的寄生蟲負(fù)荷顯著降低,足墊腫脹明顯減輕。

        2.3 重組Lt-LPG3疫苗

        脂磷酸多糖 3(lipophosphoglycan,LPG3)基因編碼的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP94屬于HSP90家族,可參與抗原提呈,蛋白質(zhì)折疊、融合和分泌,具有一定的免疫原性。Pirdel等[2]將2316bp的LPG3基因插入pTZ57R得pTZ-LPG3,與pLEXSY-hyg2重組得pLEXSY-LPG3;將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;免疫印跡發(fā)現(xiàn)東方癤患者血清識別重組寄生蟲表達的97000的LPG3蛋白,但未進行保護力試驗。

        3 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的剛地弓形蟲疫苗

        剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii,Tg)可引起弓形蟲病,其表膜存在表面抗原(surface antigen,SAG),其中SAG1(P30)是一種主要的表面抗原,僅在弓形蟲的速殖子階段表達,主要參與弓形蟲早期入侵過程,張洪花等[15]將20μg純化的P30組分抗原加弗氏佐劑腹腔注射昆明種小鼠,初次免疫后2、4周加強2次,初次免疫后5周腹腔注射300個弓形蟲RH株的包囊進行攻擊,發(fā)現(xiàn)免疫組存活時間比對照組延長1.2d。Peterson等[16]將20μg重組SAG1抗原加氫氧化鋁佐劑皮下注射NMR1鼠,初次免疫后2、4和6周加強3次,初次免疫后8周皮下注射100個弓形蟲RH株的包囊進行攻擊,攻擊后50d發(fā)現(xiàn)免疫組的存活率為44.4%(4/9),而對照組為 20%(1/5)。龔婭等[17]將5μg重組質(zhì)粒pCD-P30肌肉注射免疫BALB/c鼠,初次免疫后2周加強1次,發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG在初次免疫后2~6周增加,初次免疫后6周達較高水平。這些研究說明P30抗原是一種較好的免疫分子。許越等[18]以弓形蟲RH株基因組DNA為模板擴增957bp的P30基因,插入pMD18-T得pMD18-P30,與pLEXSY-neo重組得pLEXSY-P30;將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選陽性蟲株,培養(yǎng)7d,SDS-PAGE證實重組蟲株能夠表達相對分子質(zhì)量為33000的P30蛋白,保護力試驗正在進行中。

        4 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的HIV-1疫苗

        人免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficien?cy virustype1,HIV-1)是獲得性免疫缺陷綜合征的病原體。其gag基因編碼一個蛋白前體P55,經(jīng)蛋白酶裂解后形成衣殼蛋白P24、核衣殼蛋白P7和內(nèi)膜蛋白P14,主要參與HIV-1的感染和復(fù)制。Breton等[19]以pNL4.3為模板擴增1.6kb的gag基因,插入pSPα-Pro-Neo得pNeo-gag;將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;免疫印跡發(fā)現(xiàn)艾滋病患者血清識別重組寄生蟲表達的55000的Gag蛋白;將5×107重組寄生蟲腹腔注射BALB/c鼠1次,發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG在免疫后2~12周升高,免疫后8周達較高水平,免疫鼠的脾細胞在免疫后2~12周明顯增殖,免疫后12周達較高水平,ELISpot證實免疫鼠的脾IFN-γ+SFCs數(shù)目在免疫后2~12周增加,在免疫后2周達較高水平。

        5 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的HPV16疫苗

        5.1 重組Lt-E7疫苗

        人乳頭瘤病毒16型(Human papillomavirus type16,HPV16)與人宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。HPV16的E7蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白,可干擾抑癌蛋白RB與轉(zhuǎn)錄因子E2F和P107的結(jié)合,使細胞周期發(fā)生紊亂,E7蛋白還可與P103、周期蛋白A和CDK2等細胞周期相關(guān)因子結(jié)合,使細胞發(fā)生癌變。Salehi等[20]將HPV16的E7基因插入pEGFPN1得pEGFP-E7,與pDrive重組得pDrive-EGFP-E7,與pLEXSY-neo重組得pLEXSY-EGFPE7;將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;以從重組寄生蟲抽提的基因組DNA為模板進行PCR可擴增出1kb的融合基因,免疫印跡發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清識別重組寄生蟲表達的39000的EGFP-E7融合蛋白;將100 μgpCD-E7皮下注射C57BL/6鼠,首次免疫后3和6周皮下注射2×107重組寄生蟲進行加強,首次免疫后9周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG2a升高,脾細胞分泌高水平IFN-γ,但不分泌IL-5,此時皮下注射5×106腫瘤細胞株TC-1進行攻擊,攻擊后2個月發(fā)現(xiàn)免疫組的腫瘤面積顯著小于對照組。

        5.2 重組Lt-L1疫苗

        HPV16的L1蛋白是主要衣殼蛋白,可自身聚合成病毒樣顆粒(virus-likeparticles,VLP)。Bol?hassani等[21]將 pGEM-L1 與 pLEXSY-1-blecherry3重組得pLEXSY-L1,將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,用50μg/mL博萊霉素篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;以從重組寄生蟲抽提的基因組DNA為模板進行PCR可擴增出1515bp的HPV16L1基因,免疫印跡表明宮頸癌患者血清識別重組寄生蟲表達的60000的L1蛋白;將10μg源自重組寄生蟲的L1蛋白腹腔注射C57BL/6鼠,首次免疫后2和4周加強2次,發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG和IgG2a在首次免疫后3~6周即可達到較高水平。

        6 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的HCV疫苗

        丙型肝炎病毒(Hepatitis Ccirus,HCV)是丙型肝炎的病原體,E2412-415是HCVE2糖蛋白的合成肽。乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是乙型肝炎的病原體,其基因組的S區(qū)基因分為前S1、前S2和S區(qū),分別編碼包膜上的前S1、前S2蛋白和乙型肝炎表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg),三者合稱大分子蛋白,前S2蛋白和HBsAg合稱中分子蛋白,HBsAg稱小分子蛋白,大中小分子蛋白的相對分子質(zhì)量分別為39000、33000和24000。前S1和前S2蛋白在HBV感染肝細胞時起重要作用。SHBsAg是HBV的小表面抗原。Czarnota等[22]將HCV E2412-425表位與HBV和SHBsAg基因融合后,插入pLEXSY-1-blecherry3得pLEXSY-E2-SHBsAg,將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株,篩選培養(yǎng)重組寄生蟲;免疫印跡發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者血清識別重組寄生蟲表達的30000的融合蛋白;將15μg源自重組寄生蟲的融合蛋白腹腔注射BALB/c鼠,首次免疫后2和4周加強2次,首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG升高,ELISpot表明免疫鼠的脾IFN-γ+SFCs數(shù)目顯著增加。

        7 結(jié)語

        重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗作為一種新型疫苗具有下述優(yōu)點:對人體無致病性;培養(yǎng)價格低廉,產(chǎn)量高(可達30mg/mL);無內(nèi)毒素污染;可進行轉(zhuǎn)錄后修飾和重要的糖基化;能模擬自然感染過程,自發(fā)傳遞抗原,促進APC提呈抗原,優(yōu)先活化CD4+T細胞,傳遞完整的抗原譜,增強免疫系統(tǒng)的記憶;在宿主體內(nèi)長期存在,在感染發(fā)生時,迅速產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答和記憶性T細胞,表達的外源蛋白具有高度的生物學(xué)活性。

        不可否認(rèn)的是重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗尚存在下述缺點:陽性寄生蟲株的篩選需要較長時間;前鞭毛體和無鞭毛體表達外源蛋白可能存在不同;可供選擇的表達載體較少;本身所含有的抗生素抗性基因可能對人體有害;疫苗與宿主之間的相互作用機制研究尚不深入;疫苗效果的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化評價體系尚未建立;表達產(chǎn)物與天然蛋白存在較大差異;表達產(chǎn)物可能對陽性寄生蟲株有害;表達蛋白的水平較低等。

        重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗是一種新型疫苗,用于感染性疾病和腫瘤的防治及利什曼原蟲化療藥物的篩選,應(yīng)具有十分廣闊的前景。但將重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗發(fā)展成為一種理想疫苗亟待解決下述問題:疫苗表達蛋白的翻譯后修飾及調(diào)控;疫苗的免疫途徑、劑量、次數(shù)和間隔次數(shù);疫苗高效啟動子;疫苗新的選擇標(biāo)志;重組多價蜥蜴利什曼原蟲疫苗;疫苗免疫機制等。相信隨著這些問題的闡明,重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗用于臨床疾病的免疫治療指日可待。

        參考文獻

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