李文桂，陳雅棠

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

蜥蜴利什曼原蟲（Leishma niatarentolae，Lt）是一種低等真核生物，介于原核和真核之間，可在26℃、低廉的培養(yǎng)基中，以前鞭毛體的形式進行培養(yǎng)，可忍耐高密度的細胞培養(yǎng)，倍增時間短（5～6 h），可產(chǎn)生高水平蛋白（0.1～30mg/L），這些蛋白可貯存在胞漿內(nèi)或分泌至培養(yǎng)基中。Breton等[1]將5×107蜥蜴利什曼原蟲的前鞭毛體腹腔注射BALB/c鼠，免疫后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾細胞增殖，分泌高水平IFN-γ，但不分泌IL-4，免疫后6周靜脈注射5×107杜氏利什曼原蟲（L.donovani）的前鞭毛體進行攻擊，攻擊后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠肝脾的寄生蟲負(fù)荷降低，提示用蜥蜴利什曼原蟲進行接種可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的保護力。

蜥蜴利什曼原蟲有36條染色體，通常缺乏GP63、LPG3和A2等毒力因子，可感染人和鼠，但對人體無致病性。它具有原核的基因表達體系和真核的蛋白折疊與修飾體系，有獨特的RNA編輯方式，所有內(nèi)源mRNA加上1段35個核苷酸的先導(dǎo)序列，能被蟲體特異的反義核酸所阻斷。Pirdel等[2]認(rèn)為它可作為一種新型疫苗載體。Ta?heri等[3]報道了一種利什曼原蟲-大腸埃希菌穿梭表達載體pLEXSY，該載體含有1.7kb的基因間區(qū)域（intergenicregion，IR），可在IR內(nèi)插入外源基因，外源基因可被載體內(nèi)部的RNA聚合酶Ⅱ識別和轉(zhuǎn)錄，因此可低水平表達外源蛋白；可以通過增加抗生素的濃度排除低拷貝數(shù)目的細胞，從而提高蛋白的表達水平。大量研究表明蜥蜴利什曼原蟲作為疫苗載體可表達嬰兒利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、剛地弓形蟲、人類免疫缺陷病毒1型、人乳頭瘤病毒16型、丙型肝炎病毒等，本文擬就這方面的研制現(xiàn)狀做簡要綜述。

1 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的嬰兒利什曼原蟲疫苗

1.1 重組Lt-A2疫苗

嬰兒利什曼原蟲（L.infuntum）可引起內(nèi)臟利什曼病，俗稱黑熱病。A2蛋白存在于利什曼原蟲的無鞭毛體內(nèi)，含有10個氨基酸的重復(fù)序列，隨著不同程度的重復(fù)，相對分子質(zhì)量可為45000～110000，在利什曼原蟲靶向內(nèi)臟的過程中起重要作用。Mizbani等[4]以pKSNEO-A2為模板擴增154bp的A2基因，插入pNEO-GFP得pNEO-GFPA2；將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選培養(yǎng)重組寄生蟲，Northern印跡顯示A2基因插入重組寄生蟲的基因組，免疫印跡顯示黑熱病患者血清識別重組寄生蟲表達的45000的A2蛋白；將5×106重組寄生蟲腹腔注射BALB/c鼠，免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG和IgG1升高，脾細胞分泌高水平的IFN-γ，此時靜脈注射1×107嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊，在攻擊后4周用實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)免疫鼠的肝脾寄生蟲負(fù)荷顯著降低。

1.2 重組Lt-A2-CPA-CPB疫苗

嬰兒利什曼原蟲的半胱氨酸蛋白酶（cyste?ineproteinase，CP）A/B（CPA/CPB）的相對分子質(zhì)量為24000，可參與利什曼原蟲自噬體的形成，在前鞭毛體向無鞭毛體的轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。Rafati等[5-8]的研究表明重組CP蛋白加弗氏佐劑或混合質(zhì)粒pCB6-CPA和pCB6-CPB腹腔注射BALB/c鼠均可有效對抗1×106嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體攻擊，提示重組CP是較好的疫苗候選分子。由于宿主MHC分子的多樣性和利什曼原蟲抗原結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，宿主將針對抗原的多個表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使得單一抗原成分誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的保護性免疫應(yīng)答效果往往較低，因此，將A2抗原和CPA-CPB抗原的編碼基因連接起來可能是一條較好途徑。Saljoughian等[9]將pEGFP-A2-CPA-CPB與pLEXY-neo2重組得pLEXSY-EGFPA2-CPA-CPB，將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；流式細胞儀檢測表明重組寄生蟲可表達EGFP-A2-CPA-CPB融合蛋白，免疫印跡發(fā)現(xiàn)黑熱病患者血清識別重組寄生蟲表達的相對分子質(zhì)量為103000的融合蛋白；將50μgpCD-A2-CPA-CPB肌肉注射BALB/c鼠，首次免疫后3周靜脈注射2×107重組寄生蟲進行加強，在首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG1和IgG2a升高，IgG1/IgG2a比值大于1，免疫鼠的脾細胞分泌高水平IFN-γ、IL-2和NO，但不分泌IL-10，此時靜脈注射107嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊，攻擊后8周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的肝脾病理變化明顯減輕，寄生蟲負(fù)荷顯著下降。Shah?bazi等[10]將2×107重組寄生蟲皮下注射比格犬，首次免疫后3周加強1次，首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫犬的血清IgG2a升高，外周血單核細胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，但不分泌IL-10，此時靜脈注射4×107嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊，攻擊后18個月用實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)免疫犬骨髓的寄生蟲負(fù)荷明顯降低。

1.3 重組Lt-KMP11-NTGP96疫苗

嬰兒利什曼原蟲的動基體膜蛋白11（kineto?plastid membrane protein 11，KMP11）是一種高度保守的膜表面蛋白，在前鞭毛體和無鞭毛體均有表達，可促進T細胞產(chǎn)生IFN-γ。Bhaumik等[11]將100μgpCMV-KMP11-IL-12肌肉注射BALB/c鼠可誘導(dǎo)Th1和Th2型混合性免疫應(yīng)答，并可有效對抗1×106杜氏利什曼原蟲的前鞭毛體攻擊。嬰兒利什曼原蟲的N端糖蛋白96（N-terminalglyco?protein96，NTGP96）屬于 HSP90家族，可參與蛋白質(zhì)的折疊和聚集，具有較強的佐劑活性。Nasiri等[12]以嬰兒利什曼原蟲的基因組DNA為模板分別擴增279bp的KMP11和1014bp的NTGP96基因，將其融合為1293bp的KMP11-NTGP96基因，插入 pJET1.2得 pJET-KMP11-NTGP96，與 pLEX?SY-neo2重組得pLEXSY-KMP11-NTGP96；將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；以從重組寄生蟲體內(nèi)抽提的基因組DNA為模板進行PCR可擴增出1293bp的KMP11-NTGP96融合基因，免疫印跡表明黑熱病患者血清識別重組寄生蟲表達的相對分子質(zhì)量為54000的KMP11-NTGP96融合蛋白；將2×107重組寄生蟲皮下注射BALB/c鼠，首次免疫后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG2a、IgG1升高，IgG2a/IgG1比值小于1，免疫鼠的脾細胞分泌高水平IFN-γ和低水平的IL-4，此時腹腔注射107嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊，攻擊后4周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的脾臟寄生蟲負(fù)荷下降2個數(shù)量級。

2 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的碩大利什曼原蟲疫苗

2.1 重組Lt-CPA-CPB疫苗

碩大利什曼原蟲（L.major）可引起皮膚利什曼病，俗稱東方癤。Zahedifard等[13]以pCB6-EGFPCPA-CPB為模板擴增2.3kb的EGFP-CPA-CPB基因，插入pLEXSY-neo2得到pLEXSY-EGFPCPA-CPB；將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，用50μg/mLG418篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；以從重組寄生蟲提取的總RNA為模板進行RT-PCR可擴增出EGFP-CPA-CPB融合基因，Southern印跡證實融合基因插入重組寄生蟲的基因組；將1×107重組寄生蟲腹腔注射BALB/c鼠，首次免疫后2周加強1次，首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG2a和IgG1升高，IgG2a/IgG1比值大于1，免疫鼠的脾細胞分泌高水平IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-4，IFN-γ/IL-4比值升高，此時足墊皮下注射2×105碩大利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊，攻擊后10周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的足墊腫脹明顯減輕，淋巴結(jié)的寄生蟲負(fù)荷下降2個數(shù)量級。

2.2 重組Lt-PpSP15疫苗

靜食白蛉的唾液蛋白15（Phlebotomus papata?sisalivary protein15，PpSP15）是一種有效的免疫分子。Katebi等[14]將397bp的PpSP15基因插入pEGFP-N3得pEGFP-PpSP15，與pLEXSY-neo重組得pLEXSY-PpSP15；將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；以從重組寄生蟲抽提的基因組DNA為模板進行PCR可擴增出397bp的PpSP15基因，免疫印跡表明東方癤患者血清識別重組寄生蟲表達的42000的EGFP-PpSP15蛋白；將2×107重組寄生蟲加CPG佐劑皮下注射免疫BALB/c鼠，首次免疫后3周加強1次，首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG2a/IgG1比值大于1，脾細胞分泌高水平IFN-γ、TNF-α和IL-17和低水平的IL-5，此時皮下注射2×105碩大利什曼原蟲的前鞭毛體進行攻擊，攻擊后11周用實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)免疫鼠淋巴結(jié)的寄生蟲負(fù)荷顯著降低，足墊腫脹明顯減輕。

2.3 重組Lt-LPG3疫苗

脂磷酸多糖 3（lipophosphoglycan，LPG3）基因編碼的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP94屬于HSP90家族，可參與抗原提呈，蛋白質(zhì)折疊、融合和分泌，具有一定的免疫原性。Pirdel等[2]將2316bp的LPG3基因插入pTZ57R得pTZ-LPG3，與pLEXSY-hyg2重組得pLEXSY-LPG3；將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；免疫印跡發(fā)現(xiàn)東方癤患者血清識別重組寄生蟲表達的97000的LPG3蛋白，但未進行保護力試驗。

3 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的剛地弓形蟲疫苗

剛地弓形蟲（Toxoplasmagondii，Tg）可引起弓形蟲病，其表膜存在表面抗原（surface antigen，SAG），其中SAG1（P30）是一種主要的表面抗原，僅在弓形蟲的速殖子階段表達，主要參與弓形蟲早期入侵過程，張洪花等[15]將20μg純化的P30組分抗原加弗氏佐劑腹腔注射昆明種小鼠，初次免疫后2、4周加強2次，初次免疫后5周腹腔注射300個弓形蟲RH株的包囊進行攻擊，發(fā)現(xiàn)免疫組存活時間比對照組延長1.2d。Peterson等[16]將20μg重組SAG1抗原加氫氧化鋁佐劑皮下注射NMR1鼠，初次免疫后2、4和6周加強3次，初次免疫后8周皮下注射100個弓形蟲RH株的包囊進行攻擊，攻擊后50d發(fā)現(xiàn)免疫組的存活率為44.4%（4/9），而對照組為 20%（1/5）。龔婭等[17]將5μg重組質(zhì)粒pCD-P30肌肉注射免疫BALB/c鼠，初次免疫后2周加強1次，發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG在初次免疫后2～6周增加，初次免疫后6周達較高水平。這些研究說明P30抗原是一種較好的免疫分子。許越等[18]以弓形蟲RH株基因組DNA為模板擴增957bp的P30基因，插入pMD18-T得pMD18-P30，與pLEXSY-neo重組得pLEXSY-P30；將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選陽性蟲株，培養(yǎng)7d，SDS-PAGE證實重組蟲株能夠表達相對分子質(zhì)量為33000的P30蛋白，保護力試驗正在進行中。

4 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的HIV-1疫苗

人免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficien?cy virustype1，HIV-1）是獲得性免疫缺陷綜合征的病原體。其gag基因編碼一個蛋白前體P55，經(jīng)蛋白酶裂解后形成衣殼蛋白P24、核衣殼蛋白P7和內(nèi)膜蛋白P14，主要參與HIV-1的感染和復(fù)制。Breton等[19]以pNL4.3為模板擴增1.6kb的gag基因，插入pSPα-Pro-Neo得pNeo-gag；將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；免疫印跡發(fā)現(xiàn)艾滋病患者血清識別重組寄生蟲表達的55000的Gag蛋白；將5×107重組寄生蟲腹腔注射BALB/c鼠1次，發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG在免疫后2～12周升高，免疫后8周達較高水平，免疫鼠的脾細胞在免疫后2～12周明顯增殖，免疫后12周達較高水平，ELISpot證實免疫鼠的脾IFN-γ+SFCs數(shù)目在免疫后2～12周增加，在免疫后2周達較高水平。

5 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的HPV16疫苗

5.1 重組Lt-E7疫苗

人乳頭瘤病毒16型（Human papillomavirus type16，HPV16）與人宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。HPV16的E7蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白，可干擾抑癌蛋白RB與轉(zhuǎn)錄因子E2F和P107的結(jié)合，使細胞周期發(fā)生紊亂，E7蛋白還可與P103、周期蛋白A和CDK2等細胞周期相關(guān)因子結(jié)合，使細胞發(fā)生癌變。Salehi等[20]將HPV16的E7基因插入pEGFPN1得pEGFP-E7，與pDrive重組得pDrive-EGFP-E7，與pLEXSY-neo重組得pLEXSY-EGFPE7；將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；以從重組寄生蟲抽提的基因組DNA為模板進行PCR可擴增出1kb的融合基因，免疫印跡發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清識別重組寄生蟲表達的39000的EGFP-E7融合蛋白；將100 μgpCD-E7皮下注射C57BL/6鼠，首次免疫后3和6周皮下注射2×107重組寄生蟲進行加強，首次免疫后9周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG2a升高，脾細胞分泌高水平IFN-γ，但不分泌IL-5，此時皮下注射5×106腫瘤細胞株TC-1進行攻擊，攻擊后2個月發(fā)現(xiàn)免疫組的腫瘤面積顯著小于對照組。

5.2 重組Lt-L1疫苗

HPV16的L1蛋白是主要衣殼蛋白，可自身聚合成病毒樣顆粒（virus-likeparticles，VLP）。Bol?hassani等[21]將 pGEM-L1 與 pLEXSY-1-blecherry3重組得pLEXSY-L1，將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，用50μg/mL博萊霉素篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；以從重組寄生蟲抽提的基因組DNA為模板進行PCR可擴增出1515bp的HPV16L1基因，免疫印跡表明宮頸癌患者血清識別重組寄生蟲表達的60000的L1蛋白；將10μg源自重組寄生蟲的L1蛋白腹腔注射C57BL/6鼠，首次免疫后2和4周加強2次，發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG和IgG2a在首次免疫后3～6周即可達到較高水平。

6 蜥蜴利什曼原蟲介導(dǎo)的HCV疫苗

丙型肝炎病毒（Hepatitis Ccirus，HCV）是丙型肝炎的病原體，E2412-415是HCVE2糖蛋白的合成肽。乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）是乙型肝炎的病原體，其基因組的S區(qū)基因分為前S1、前S2和S區(qū)，分別編碼包膜上的前S1、前S2蛋白和乙型肝炎表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen，HBsAg），三者合稱大分子蛋白，前S2蛋白和HBsAg合稱中分子蛋白，HBsAg稱小分子蛋白，大中小分子蛋白的相對分子質(zhì)量分別為39000、33000和24000。前S1和前S2蛋白在HBV感染肝細胞時起重要作用。SHBsAg是HBV的小表面抗原。Czarnota等[22]將HCV E2412-425表位與HBV和SHBsAg基因融合后，插入pLEXSY-1-blecherry3得pLEXSY-E2-SHBsAg，將其電穿孔轉(zhuǎn)化蜥蜴利什曼原蟲的TarⅡ株，篩選培養(yǎng)重組寄生蟲；免疫印跡發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者血清識別重組寄生蟲表達的30000的融合蛋白；將15μg源自重組寄生蟲的融合蛋白腹腔注射BALB/c鼠，首次免疫后2和4周加強2次，首次免疫后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的血清IgG升高，ELISpot表明免疫鼠的脾IFN-γ+SFCs數(shù)目顯著增加。

7 結(jié)語

重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗作為一種新型疫苗具有下述優(yōu)點：對人體無致病性；培養(yǎng)價格低廉，產(chǎn)量高（可達30mg/mL）；無內(nèi)毒素污染；可進行轉(zhuǎn)錄后修飾和重要的糖基化；能模擬自然感染過程，自發(fā)傳遞抗原，促進APC提呈抗原，優(yōu)先活化CD4+T細胞，傳遞完整的抗原譜，增強免疫系統(tǒng)的記憶；在宿主體內(nèi)長期存在，在感染發(fā)生時，迅速產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答和記憶性T細胞，表達的外源蛋白具有高度的生物學(xué)活性。

不可否認(rèn)的是重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗尚存在下述缺點：陽性寄生蟲株的篩選需要較長時間；前鞭毛體和無鞭毛體表達外源蛋白可能存在不同；可供選擇的表達載體較少；本身所含有的抗生素抗性基因可能對人體有害；疫苗與宿主之間的相互作用機制研究尚不深入；疫苗效果的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化評價體系尚未建立；表達產(chǎn)物與天然蛋白存在較大差異；表達產(chǎn)物可能對陽性寄生蟲株有害；表達蛋白的水平較低等。

重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗是一種新型疫苗，用于感染性疾病和腫瘤的防治及利什曼原蟲化療藥物的篩選，應(yīng)具有十分廣闊的前景。但將重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗發(fā)展成為一種理想疫苗亟待解決下述問題：疫苗表達蛋白的翻譯后修飾及調(diào)控；疫苗的免疫途徑、劑量、次數(shù)和間隔次數(shù)；疫苗高效啟動子；疫苗新的選擇標(biāo)志；重組多價蜥蜴利什曼原蟲疫苗；疫苗免疫機制等。相信隨著這些問題的闡明，重組蜥蜴利什曼原蟲疫苗用于臨床疾病的免疫治療指日可待。

參考文獻