董兆昱,郭雷鳴,程林峰
空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室,陜西 西安 710032
漢灘病毒(Hantaan virus,HTNV)在我國(guó)主要引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with re?nal syndrome,HFRS),是由鼠類傳播的一種急性病毒性傳染病[1],臨床上以發(fā)熱、出血、急性腎功能損害和免疫功能紊亂為主要特征[2]。HFRS流行于世界上近40個(gè)國(guó)家和地區(qū),我國(guó)是HFRS疫情最嚴(yán)重的國(guó)家之一,主要表現(xiàn)在流行范圍廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率較高。HFRS的傳染源和宿主動(dòng)物廣泛,傳播途徑多樣,主要危害青壯年,臨床上尚無特異有效的治療藥物,因此在我國(guó)HFRS的防治任務(wù)十分艱巨。
目前我國(guó)已研制出HTNV滅活疫苗,其推廣使用對(duì)預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題,主要是不能有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱,抗體滴度不高等,因而研發(fā)新型HTNV疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。我們僅就近年來國(guó)內(nèi)外HTNV新型基因工程疫苗的研究進(jìn)展做簡(jiǎn)要綜述。
HTNV顆粒由核心和包膜組成,其基因組位于核心部分,為單股負(fù)鏈RNA。HTNV全基因組由11845個(gè)核苷酸組成,包括M、S、L共3個(gè)基因片段[3]。M基因全長(zhǎng)約3.7kb,只有一個(gè)長(zhǎng)開放讀框(openreadingframe,ORF),長(zhǎng)度約 3.4kb,編碼2個(gè)糖蛋白Gn和Gc的前體蛋白,前體蛋白中部有一個(gè)由5個(gè)氨基酸殘基(WAASA)組成的共翻譯切割點(diǎn),在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)將前體蛋白切割成Gn和Gc蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量分別為72000和55000[4]。HTNV的Gn和Gc的結(jié)構(gòu)和功能決定了病毒的生物學(xué)特性,因此成為當(dāng)前最受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。Schmaljohn等[5]發(fā)現(xiàn)HTNVGP上共有7個(gè)N糖基化位點(diǎn),其中Gn上有5個(gè)天門冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn),Gc上有2個(gè);研究還發(fā)現(xiàn)Gn和Gc上分別含有3個(gè)和1個(gè)保守型糖基化位點(diǎn),這些糖基化位點(diǎn)對(duì)于維持病毒的生物學(xué)特性至關(guān)重要。HTNV的Gn和Gc上存在諸多中和抗原位點(diǎn)和血凝抗原位點(diǎn),能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,對(duì)感染動(dòng)物和HFRS患者有保護(hù)作用,因此成為HFRS基因工程疫苗研究的重要抗原蛋白[6]。徐志凱等[7]采用多株單克隆抗體(monoclonalanti?body,mAb)對(duì)HTNV的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),GP上不僅存在獨(dú)立的中和抗原位點(diǎn)和血凝抗原位點(diǎn),也存在一些具有雙重功能的位點(diǎn)。
S基因全長(zhǎng)約1.7kb,包含一個(gè)長(zhǎng)ORF,長(zhǎng)度約1.3kb,編碼相對(duì)分子質(zhì)量約為50000的非糖基化蛋白NP[8]。HTNVNP的主要功能是包裹病毒基因組,該蛋白C端的高度保守序列可識(shí)別病毒基因組非編碼區(qū)基因并與之結(jié)合形成復(fù)合體,該復(fù)合體與RNA聚合酶一起組成病毒顆粒的核心。HTNVNP上含有多個(gè)特異性抗原位點(diǎn)。徐志凱等[7]采用10株mAb對(duì)HTNVNP做抗原位點(diǎn)分析時(shí),發(fā)現(xiàn)NP上至少有12個(gè)抗原位點(diǎn),其中7個(gè)組特異性抗原位點(diǎn)和1個(gè)亞組特異性抗原位點(diǎn)主要分布在2個(gè)區(qū)域內(nèi),其他抗原位點(diǎn)則可能與上述抗原位點(diǎn)的分布有部分相同或重疊,這些抗原位點(diǎn)的重疊有些表現(xiàn)在一級(jí)結(jié)構(gòu)上,有些則表現(xiàn)在空間結(jié)構(gòu)上[9]。HTNVNP具有很強(qiáng)的免疫原性,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,所以也成為HTNV新型基因工程疫苗研究中的重要抗原蛋白。
L基因全長(zhǎng)約6.4kb,非編碼區(qū)較短,為36~43 bp,含有一個(gè)長(zhǎng)ORF,編碼病毒RNA依賴的RNA聚合酶,相對(duì)分子質(zhì)量約250000,與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān),并非病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[10]。HTNVRNA聚合酶分子很大,很難在大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),所以目前關(guān)于其生物學(xué)活性的研究很少。
亞單位疫苗是指在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)保護(hù)性抗原基因,并將表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì)或多肽)制成疫苗。其優(yōu)點(diǎn)在于安全性和穩(wěn)定好,純度比較高,便于大規(guī)模生產(chǎn)。
多項(xiàng)研究表明,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[11-12]、酵母表達(dá)系統(tǒng)[13-14]和桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(baculovirus expression vector system,BEVS)[15-16]等均可表達(dá)HTNV的NP或GP,并具有較強(qiáng)的抗原性,免疫動(dòng)物后也取得了良好的保護(hù)效果。Figueiredo等[17]通過大腸桿菌BL21構(gòu)建了能表達(dá)HTNVNP的重組原核表達(dá)載體,將表達(dá)的NP免疫小鼠后,在其血清中可以檢測(cè)到針對(duì)NP的特異性抗體,證明表達(dá)的NP可作為HTNV的抗原蛋白加以研究和利用。Petraityte等[13]利用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定地大量表達(dá)了HTNVNP,將其用于ELISA檢測(cè)HFRS患者血清中的抗HTNVIgG和IgM抗體,特異性和準(zhǔn)確性分別達(dá)98%和99%,證明表達(dá)的NP具有良好的抗原性。Yoshimatsu等[18]用BEVS表達(dá)了HTNVNP和GP,將表達(dá)的NP或GP免疫小鼠后收集其血清或脾細(xì)胞并注射入小白鼠乳鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以部分保護(hù)乳鼠抵抗致死性的HTNV攻擊。Schmaljohn等[19]利用BEVS分別表達(dá)HTNV的NP和GP以及單獨(dú)表達(dá)Gn和Gc,并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行研究,結(jié)果證實(shí)所有表達(dá)的重組抗原蛋白均能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,并且全GP蛋白的免疫效果要強(qiáng)于Gn和Gc單獨(dú)免疫的效果,動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有抗原蛋白對(duì)乳鼠均有全部或部分抗HTNV攻擊的保護(hù)作用。Yoon等[11]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中表達(dá)的全長(zhǎng)或截短的HTNVNP在體外被酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase,CKⅡ)磷酸化,位點(diǎn)特異性誘變研究表明HTNVNP磷酸化可能發(fā)生在位點(diǎn)直接誘變的位置以外的未知位點(diǎn)。Ma等[20]通過IEDB(表位預(yù)測(cè)和分析工具最全面的集合)選擇15個(gè)8-mer肽,用IFN-γELISpot測(cè)定,在HTNV感染的小鼠的脾細(xì)胞中鑒定出新的GP衍生的CTL表位GP6 aa456~aa463,ELISPOT和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測(cè)定顯示該肽疫苗在免疫小鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)的IFN-γ應(yīng)答和有效的細(xì)胞毒性H2-Kb限制性CTL表位,表明HTNV亞單位疫苗具有臨床應(yīng)用價(jià)值。Ma等[42]發(fā)現(xiàn)FA9(HTNV核蛋白CD8+T細(xì)胞表位aa129~aa137)與 HLA-A*0201復(fù)合物顯示典型的MHCⅠ類折疊,誘導(dǎo)Tg小鼠IFN-γ、TNF-α、粒酶B和CD107a的高表達(dá)水平,表明FA9可以用于開發(fā)HTNV肽段疫苗。
雖然目前關(guān)于HTNV亞單位疫苗的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展,但也遇到了一些瓶頸問題,例如如何提高HTNV抗原蛋白尤其是GP的表達(dá)量,如何有效分泌和正確修飾重組抗原蛋白,如何純化并保持抗原蛋白活性,以及如何增強(qiáng)其刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答能力等。若能有效解決這些問題,將會(huì)大大促進(jìn)HTNV亞單位疫苗的進(jìn)一步發(fā)展。
核酸疫苗又稱為DNA疫苗或基因疫苗。通常以質(zhì)粒DNA為基礎(chǔ),即將抗原基因克隆入質(zhì)粒DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒,該重組質(zhì)??梢栽谡婧思?xì)胞中表達(dá)相應(yīng)抗原,其在體內(nèi)的抗原提呈過程與病毒感染相似,因此能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答,尤其是以CTL殺傷功能為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)由重組質(zhì)粒編碼的蛋白抗原在體內(nèi)可以維持更長(zhǎng)效的免疫刺激,能夠有效地預(yù)防病毒等引起的傳染病。核酸疫苗的制備工藝簡(jiǎn)單,易于保存,同時(shí)可以避免出現(xiàn)毒力返祖、人群之間傳染及污染環(huán)境等危險(xiǎn),安全性高,因此成為研發(fā)病毒疫苗的有效策略[19]。
Hooper等[21]將HTNV的M全長(zhǎng)基因克隆入pWRG7077表達(dá)載體構(gòu)建了重組核酸疫苗,用基因槍注射倉(cāng)鼠后,可以有效保護(hù)倉(cāng)鼠免受HTNV的攻擊,而且這些免疫倉(cāng)鼠還可以抵抗同樣引起HFRS的漢坦病毒屬的另外2個(gè)型別的病毒,即多布拉伐-貝爾格萊德病毒(Dobrava-Belgradevi?rus,DOBV)和漢城病毒(Seoulvirus,SEOV)的攻擊;將該重組核酸疫苗免疫恒河猴,可在猴血清中檢測(cè)到高滴度的中和抗體,這也是首次關(guān)于HTNV核酸疫苗免疫靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究報(bào)道。張芳琳等[22]用真核表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建了含有HTNVGc和S0.7kb基因的嵌合重組核酸疫苗并用其免疫小鼠,結(jié)果在小鼠血清中可檢測(cè)到針對(duì)Gc和NP的高滴度的特異性抗體以及低滴度的中和抗體,同時(shí)發(fā)現(xiàn)免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于正常小鼠,表明所構(gòu)建的嵌合重組核酸疫苗可以有效刺激機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Woo等[23]利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建了含有HTNVNP的重組核酸疫苗,免疫C57BL/6小鼠后可以刺激其產(chǎn)生針對(duì)NP的特異性抗體以及NP特異性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,并可以保護(hù)小鼠免受HTNV的攻擊。Jiang等[24]通過特異性抗體檢測(cè)和微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn),以及IFN-γELISpot和CTL毒性殺傷實(shí)驗(yàn)來評(píng)估BALB/c小鼠對(duì)基于Gn的DNA疫苗的免疫應(yīng)答,發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,且疫苗具有長(zhǎng)期保護(hù)作用。
此外,多個(gè)研究小組還研究了不同型別的漢坦病毒的核酸疫苗,包括 HTNV[15,21,23]、SEOV[25-26]、PUUV(Puumalahantavirus)[27]、ANDV(Andesvi?rus)[28-29]與 SNV(Sin Nombre hantavirus)[30-31],這些研究顯示構(gòu)建的核酸疫苗在倉(cāng)鼠、小鼠或獼猴等實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭芯苷T導(dǎo)特異性的體液免疫應(yīng)答,并對(duì)動(dòng)物具有保護(hù)作用。因此,有研究者試圖通過將這些重組核酸疫苗進(jìn)行混合來研發(fā)HFRS多價(jià)疫苗。然而,Spik等[32]發(fā)現(xiàn),將HTNV和PUUV的核酸疫苗通過基因槍分別注射小鼠時(shí),可以刺激產(chǎn)生分別針對(duì)HTNV和PUUV的特異性抗體應(yīng)答,但是將二者混合后注射小鼠時(shí)僅能刺激產(chǎn)生針對(duì)PUUV的特異性抗體應(yīng)答,他們認(rèn)為這可能是不同的核酸疫苗之間存在相互干擾所致。Bou?dreau等[33]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)通過肌肉電轉(zhuǎn)的方式接種混合疫苗時(shí)可以減少這種干擾,免疫后小鼠體內(nèi)可以檢測(cè)到分別針對(duì)HTNV和PUUV的特異性抗體應(yīng)答。關(guān)于基因槍注射與肌肉電轉(zhuǎn)在應(yīng)用于核酸疫苗免疫時(shí)的孰優(yōu)孰劣還須更深入的研究。McCoy等[34]發(fā)現(xiàn)HTNV與PUUV核酸疫苗單獨(dú)或作為組合通過多頭皮內(nèi)電穿孔裝置注射,不需要預(yù)先篩選組合疫苗,可以減輕遞送時(shí)的負(fù)面效應(yīng),降低免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。
病毒活載體疫苗是指將外源目的基因片段重組于病毒載體中,重組后的病毒載體導(dǎo)入機(jī)體后即可表達(dá)目的蛋白,通過刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答來達(dá)到預(yù)防某種疾病的目的。這類疫苗的優(yōu)點(diǎn)是安全性好,技術(shù)較為成熟。目前常用的病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體及痘苗病毒載體等。
多項(xiàng)研究證實(shí)用HTNV重組活載體疫苗免疫后的動(dòng)物可以有效抵抗HTNV的攻擊。Chu等[35]將編碼HTNVGP和NP的基因克隆到痘苗病毒載體中構(gòu)建重組痘苗病毒,用其免疫地鼠后可產(chǎn)生針對(duì)HTNV的中和抗體;再用HTNV攻擊免疫后的地鼠,并采用RT-PCR方法檢測(cè)地鼠肺臟和腎臟中的HTNV核酸,結(jié)果均為陰性,表明用HTNV重組痘苗病毒免疫可使地鼠獲得有效的保護(hù)。Yu等[36]構(gòu)建了帶有HTNVGP和rLV-M的重組假型慢病毒,用rLV-M免疫C57BL/6小鼠,動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示該疫苗可有效保護(hù)小鼠免受病毒攻擊。Cheng等構(gòu)建含HTNVGn和NP0.7kb片段(NPN端1~274aa)的重組腺病毒并用其免疫C57BL/6小鼠,發(fā)現(xiàn)可刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,中和抗體滴度達(dá)1∶40,而滅活疫苗對(duì)照組小鼠的中和抗體滴度僅為1∶20;進(jìn)一步用HTNV攻擊免疫后的小鼠,并采用ELISA檢測(cè)小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器組織中的病毒特異性抗原,結(jié)果均為陰性,表明用HTNV重組腺病毒免疫可使小鼠獲得有效的保護(hù)[37]。
雖然活載體疫苗可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,并保護(hù)動(dòng)物免受病毒的攻擊,但是其最大的缺點(diǎn)是接受疫苗接種的個(gè)體體內(nèi)預(yù)先存在的抗病毒載體抗體會(huì)影響活載體疫苗的免疫效果。Schmaljohn等[38]通過構(gòu)建含有HTNVGP和NP的重組痘苗病毒免疫地鼠和沙鼠后取得了很好的保護(hù)效果,但該疫苗后續(xù)的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),對(duì)痘苗病毒抗體陰性的志愿者接種后100%產(chǎn)生了針對(duì)HTNV的特異性中和抗體,而先前體內(nèi)存在痘苗病毒抗體的志愿者接種后僅有50%能產(chǎn)生針對(duì)HTNV的特異性中和抗體[39],再加上活載體疫苗本身潛在的副作用風(fēng)險(xiǎn),使得該疫苗的研制工作最終擱淺[40]。
病毒樣顆粒(virus-likeparticle,VLP)是由病毒的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白組成的不含病毒核酸的空心顆粒。這些VLP可以自我組裝,與天然病毒的空間結(jié)構(gòu)高度相似,因而保持了病毒抗原蛋白的天然構(gòu)象并具有很好的免疫原性;同時(shí)由于不含病毒核酸,不能自我復(fù)制,因而不會(huì)出現(xiàn)毒力返祖,無感染風(fēng)險(xiǎn)。因此,VLP是研制HTNV基因工程疫苗的一種安全、高效的候選疫苗。
目前關(guān)于HTNVVLP疫苗的研究還比較有限,但已有研究表明HTNV的結(jié)構(gòu)蛋白可以自我組裝形成VLP,并且具有良好的免疫原性。如Betenbaugh[33]等利用BEVSpFastBacDual分別構(gòu)建了含有HTNVM及S基因的rBV,將rBV共感染Sf9昆蟲細(xì)胞制備了HTNVVLP,免疫小鼠后可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的中和抗體。Li[35]等利用真核表達(dá)載體VH-dhfr/A9構(gòu)建了含有HTNVM及S基因的重組質(zhì)粒VH-dhfr/A9M及VH-dhfr/A9S,并通過共轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的方式制備了HTNVVLP,用其免疫小鼠后可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Cheng[41]等將GPI錨定形式的GM-CSF或CD40L整合到HTNVVLP中以產(chǎn)生嵌合VLP,發(fā)現(xiàn)GM-CSF和CD40L摻入HTNVVLP誘導(dǎo)高水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并保護(hù)C57BL/6小鼠免受HTNV攻擊。
VLP作為基因工程候選疫苗,不僅僅用于HTNV疫苗的研制,也廣泛應(yīng)用于其他病毒疫苗的研制。目前VLP疫苗研制工作中最關(guān)鍵的問題在于如何大量表達(dá)和純化VLP,因此選擇一種合適的表達(dá)系統(tǒng)顯得尤為重要。
綜上所述,HTNV新型基因工程疫苗的研究雖然取得了一些進(jìn)展,但是距離實(shí)際應(yīng)用還相差很遠(yuǎn)。目前存在的主要問題包括目的蛋白的表達(dá)量還不高,各表達(dá)系統(tǒng)(產(chǎn)物)刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答水平還不理想。因此,進(jìn)一步篩選和優(yōu)化組合有效的保護(hù)性抗原,進(jìn)一步選擇合適的表達(dá)載體并優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng),并聯(lián)合應(yīng)用免疫佐劑,以提高目的基因刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的能力,都值得深入探索。
參考文獻(xiàn)