董兆昱，郭雷鳴，程林峰

空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032

漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）在我國(guó)主要引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with re?nal syndrome，HFRS），是由鼠類傳播的一種急性病毒性傳染病[1]，臨床上以發(fā)熱、出血、急性腎功能損害和免疫功能紊亂為主要特征[2]。HFRS流行于世界上近40個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我國(guó)是HFRS疫情最嚴(yán)重的國(guó)家之一，主要表現(xiàn)在流行范圍廣、發(fā)病人數(shù)多、病死率較高。HFRS的傳染源和宿主動(dòng)物廣泛，傳播途徑多樣，主要危害青壯年，臨床上尚無特異有效的治療藥物，因此在我國(guó)HFRS的防治任務(wù)十分艱巨。

目前我國(guó)已研制出HTNV滅活疫苗，其推廣使用對(duì)預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題，主要是不能有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱，抗體滴度不高等，因而研發(fā)新型HTNV疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。我們僅就近年來國(guó)內(nèi)外HTNV新型基因工程疫苗的研究進(jìn)展做簡(jiǎn)要綜述。

1 HTNV基因組及其結(jié)構(gòu)蛋白

HTNV顆粒由核心和包膜組成，其基因組位于核心部分，為單股負(fù)鏈RNA。HTNV全基因組由11845個(gè)核苷酸組成，包括M、S、L共3個(gè)基因片段[3]。M基因全長(zhǎng)約3.7kb，只有一個(gè)長(zhǎng)開放讀框（openreadingframe，ORF），長(zhǎng)度約 3.4kb，編碼2個(gè)糖蛋白Gn和Gc的前體蛋白，前體蛋白中部有一個(gè)由5個(gè)氨基酸殘基（WAASA）組成的共翻譯切割點(diǎn)，在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)將前體蛋白切割成Gn和Gc蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量分別為72000和55000[4]。HTNV的Gn和Gc的結(jié)構(gòu)和功能決定了病毒的生物學(xué)特性，因此成為當(dāng)前最受關(guān)注的研究熱點(diǎn)。Schmaljohn等[5]發(fā)現(xiàn)HTNVGP上共有7個(gè)N糖基化位點(diǎn)，其中Gn上有5個(gè)天門冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)，Gc上有2個(gè)；研究還發(fā)現(xiàn)Gn和Gc上分別含有3個(gè)和1個(gè)保守型糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)對(duì)于維持病毒的生物學(xué)特性至關(guān)重要。HTNV的Gn和Gc上存在諸多中和抗原位點(diǎn)和血凝抗原位點(diǎn)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對(duì)感染動(dòng)物和HFRS患者有保護(hù)作用，因此成為HFRS基因工程疫苗研究的重要抗原蛋白[6]。徐志凱等[7]采用多株單克隆抗體（monoclonalanti?body，mAb）對(duì)HTNV的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，GP上不僅存在獨(dú)立的中和抗原位點(diǎn)和血凝抗原位點(diǎn)，也存在一些具有雙重功能的位點(diǎn)。

S基因全長(zhǎng)約1.7kb，包含一個(gè)長(zhǎng)ORF，長(zhǎng)度約1.3kb，編碼相對(duì)分子質(zhì)量約為50000的非糖基化蛋白NP[8]。HTNVNP的主要功能是包裹病毒基因組，該蛋白C端的高度保守序列可識(shí)別病毒基因組非編碼區(qū)基因并與之結(jié)合形成復(fù)合體，該復(fù)合體與RNA聚合酶一起組成病毒顆粒的核心。HTNVNP上含有多個(gè)特異性抗原位點(diǎn)。徐志凱等[7]采用10株mAb對(duì)HTNVNP做抗原位點(diǎn)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)NP上至少有12個(gè)抗原位點(diǎn)，其中7個(gè)組特異性抗原位點(diǎn)和1個(gè)亞組特異性抗原位點(diǎn)主要分布在2個(gè)區(qū)域內(nèi)，其他抗原位點(diǎn)則可能與上述抗原位點(diǎn)的分布有部分相同或重疊，這些抗原位點(diǎn)的重疊有些表現(xiàn)在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，有些則表現(xiàn)在空間結(jié)構(gòu)上[9]。HTNVNP具有很強(qiáng)的免疫原性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，所以也成為HTNV新型基因工程疫苗研究中的重要抗原蛋白。

L基因全長(zhǎng)約6.4kb，非編碼區(qū)較短，為36～43 bp，含有一個(gè)長(zhǎng)ORF，編碼病毒RNA依賴的RNA聚合酶，相對(duì)分子質(zhì)量約250000，與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)，并非病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[10]。HTNVRNA聚合酶分子很大，很難在大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，所以目前關(guān)于其生物學(xué)活性的研究很少。

2 HTNV亞單位疫苗

亞單位疫苗是指在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)保護(hù)性抗原基因，并將表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或多肽）制成疫苗。其優(yōu)點(diǎn)在于安全性和穩(wěn)定好，純度比較高，便于大規(guī)模生產(chǎn)。

多項(xiàng)研究表明，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[11-12]、酵母表達(dá)系統(tǒng)[13-14]和桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（baculovirus expression vector system，BEVS）[15-16]等均可表達(dá)HTNV的NP或GP，并具有較強(qiáng)的抗原性，免疫動(dòng)物后也取得了良好的保護(hù)效果。Figueiredo等[17]通過大腸桿菌BL21構(gòu)建了能表達(dá)HTNVNP的重組原核表達(dá)載體，將表達(dá)的NP免疫小鼠后，在其血清中可以檢測(cè)到針對(duì)NP的特異性抗體，證明表達(dá)的NP可作為HTNV的抗原蛋白加以研究和利用。Petraityte等[13]利用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定地大量表達(dá)了HTNVNP，將其用于ELISA檢測(cè)HFRS患者血清中的抗HTNVIgG和IgM抗體，特異性和準(zhǔn)確性分別達(dá)98%和99%，證明表達(dá)的NP具有良好的抗原性。Yoshimatsu等[18]用BEVS表達(dá)了HTNVNP和GP，將表達(dá)的NP或GP免疫小鼠后收集其血清或脾細(xì)胞并注射入小白鼠乳鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以部分保護(hù)乳鼠抵抗致死性的HTNV攻擊。Schmaljohn等[19]利用BEVS分別表達(dá)HTNV的NP和GP以及單獨(dú)表達(dá)Gn和Gc，并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果證實(shí)所有表達(dá)的重組抗原蛋白均能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并且全GP蛋白的免疫效果要強(qiáng)于Gn和Gc單獨(dú)免疫的效果，動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有抗原蛋白對(duì)乳鼠均有全部或部分抗HTNV攻擊的保護(hù)作用。Yoon等[11]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中表達(dá)的全長(zhǎng)或截短的HTNVNP在體外被酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase，CKⅡ）磷酸化，位點(diǎn)特異性誘變研究表明HTNVNP磷酸化可能發(fā)生在位點(diǎn)直接誘變的位置以外的未知位點(diǎn)。Ma等[20]通過IEDB（表位預(yù)測(cè)和分析工具最全面的集合）選擇15個(gè)8-mer肽，用IFN-γELISpot測(cè)定，在HTNV感染的小鼠的脾細(xì)胞中鑒定出新的GP衍生的CTL表位GP6 aa456～aa463，ELISPOT和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測(cè)定顯示該肽疫苗在免疫小鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)的IFN-γ應(yīng)答和有效的細(xì)胞毒性H2-Kb限制性CTL表位，表明HTNV亞單位疫苗具有臨床應(yīng)用價(jià)值。Ma等[42]發(fā)現(xiàn)FA9（HTNV核蛋白CD8+T細(xì)胞表位aa129～aa137）與 HLA-A*0201復(fù)合物顯示典型的MHCⅠ類折疊，誘導(dǎo)Tg小鼠IFN-γ、TNF-α、粒酶B和CD107a的高表達(dá)水平，表明FA9可以用于開發(fā)HTNV肽段疫苗。

雖然目前關(guān)于HTNV亞單位疫苗的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但也遇到了一些瓶頸問題，例如如何提高HTNV抗原蛋白尤其是GP的表達(dá)量，如何有效分泌和正確修飾重組抗原蛋白，如何純化并保持抗原蛋白活性，以及如何增強(qiáng)其刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答能力等。若能有效解決這些問題，將會(huì)大大促進(jìn)HTNV亞單位疫苗的進(jìn)一步發(fā)展。

3 HTNV核酸疫苗

核酸疫苗又稱為DNA疫苗或基因疫苗。通常以質(zhì)粒DNA為基礎(chǔ)，即將抗原基因克隆入質(zhì)粒DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)?？梢栽谡婧思?xì)胞中表達(dá)相應(yīng)抗原，其在體內(nèi)的抗原提呈過程與病毒感染相似，因此能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，尤其是以CTL殺傷功能為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)由重組質(zhì)粒編碼的蛋白抗原在體內(nèi)可以維持更長(zhǎng)效的免疫刺激，能夠有效地預(yù)防病毒等引起的傳染病。核酸疫苗的制備工藝簡(jiǎn)單，易于保存，同時(shí)可以避免出現(xiàn)毒力返祖、人群之間傳染及污染環(huán)境等危險(xiǎn)，安全性高，因此成為研發(fā)病毒疫苗的有效策略[19]。

Hooper等[21]將HTNV的M全長(zhǎng)基因克隆入pWRG7077表達(dá)載體構(gòu)建了重組核酸疫苗，用基因槍注射倉(cāng)鼠后，可以有效保護(hù)倉(cāng)鼠免受HTNV的攻擊，而且這些免疫倉(cāng)鼠還可以抵抗同樣引起HFRS的漢坦病毒屬的另外2個(gè)型別的病毒，即多布拉伐-貝爾格萊德病毒（Dobrava-Belgradevi?rus，DOBV）和漢城病毒（Seoulvirus，SEOV）的攻擊；將該重組核酸疫苗免疫恒河猴，可在猴血清中檢測(cè)到高滴度的中和抗體，這也是首次關(guān)于HTNV核酸疫苗免疫靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究報(bào)道。張芳琳等[22]用真核表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建了含有HTNVGc和S0.7kb基因的嵌合重組核酸疫苗并用其免疫小鼠，結(jié)果在小鼠血清中可檢測(cè)到針對(duì)Gc和NP的高滴度的特異性抗體以及低滴度的中和抗體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于正常小鼠，表明所構(gòu)建的嵌合重組核酸疫苗可以有效刺激機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Woo等[23]利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建了含有HTNVNP的重組核酸疫苗，免疫C57BL/6小鼠后可以刺激其產(chǎn)生針對(duì)NP的特異性抗體以及NP特異性的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并可以保護(hù)小鼠免受HTNV的攻擊。Jiang等[24]通過特異性抗體檢測(cè)和微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)，以及IFN-γELISpot和CTL毒性殺傷實(shí)驗(yàn)來評(píng)估BALB/c小鼠對(duì)基于Gn的DNA疫苗的免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，且疫苗具有長(zhǎng)期保護(hù)作用。

此外，多個(gè)研究小組還研究了不同型別的漢坦病毒的核酸疫苗，包括 HTNV[15,21,23]、SEOV[25-26]、PUUV（Puumalahantavirus）[27]、ANDV（Andesvi?rus）[28-29]與 SNV（Sin Nombre hantavirus）[30-31]，這些研究顯示構(gòu)建的核酸疫苗在倉(cāng)鼠、小鼠或獼猴等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭芯苷T導(dǎo)特異性的體液免疫應(yīng)答，并對(duì)動(dòng)物具有保護(hù)作用。因此，有研究者試圖通過將這些重組核酸疫苗進(jìn)行混合來研發(fā)HFRS多價(jià)疫苗。然而，Spik等[32]發(fā)現(xiàn)，將HTNV和PUUV的核酸疫苗通過基因槍分別注射小鼠時(shí)，可以刺激產(chǎn)生分別針對(duì)HTNV和PUUV的特異性抗體應(yīng)答，但是將二者混合后注射小鼠時(shí)僅能刺激產(chǎn)生針對(duì)PUUV的特異性抗體應(yīng)答，他們認(rèn)為這可能是不同的核酸疫苗之間存在相互干擾所致。Bou?dreau等[33]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通過肌肉電轉(zhuǎn)的方式接種混合疫苗時(shí)可以減少這種干擾，免疫后小鼠體內(nèi)可以檢測(cè)到分別針對(duì)HTNV和PUUV的特異性抗體應(yīng)答。關(guān)于基因槍注射與肌肉電轉(zhuǎn)在應(yīng)用于核酸疫苗免疫時(shí)的孰優(yōu)孰劣還須更深入的研究。McCoy等[34]發(fā)現(xiàn)HTNV與PUUV核酸疫苗單獨(dú)或作為組合通過多頭皮內(nèi)電穿孔裝置注射，不需要預(yù)先篩選組合疫苗，可以減輕遞送時(shí)的負(fù)面效應(yīng)，降低免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。

4 HTNV病毒活載體疫苗

病毒活載體疫苗是指將外源目的基因片段重組于病毒載體中，重組后的病毒載體導(dǎo)入機(jī)體后即可表達(dá)目的蛋白，通過刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答來達(dá)到預(yù)防某種疾病的目的。這類疫苗的優(yōu)點(diǎn)是安全性好，技術(shù)較為成熟。目前常用的病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體及痘苗病毒載體等。

多項(xiàng)研究證實(shí)用HTNV重組活載體疫苗免疫后的動(dòng)物可以有效抵抗HTNV的攻擊。Chu等[35]將編碼HTNVGP和NP的基因克隆到痘苗病毒載體中構(gòu)建重組痘苗病毒，用其免疫地鼠后可產(chǎn)生針對(duì)HTNV的中和抗體；再用HTNV攻擊免疫后的地鼠，并采用RT-PCR方法檢測(cè)地鼠肺臟和腎臟中的HTNV核酸，結(jié)果均為陰性，表明用HTNV重組痘苗病毒免疫可使地鼠獲得有效的保護(hù)。Yu等[36]構(gòu)建了帶有HTNVGP和rLV-M的重組假型慢病毒，用rLV-M免疫C57BL/6小鼠，動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示該疫苗可有效保護(hù)小鼠免受病毒攻擊。Cheng等構(gòu)建含HTNVGn和NP0.7kb片段（NPN端1～274aa）的重組腺病毒并用其免疫C57BL/6小鼠，發(fā)現(xiàn)可刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，中和抗體滴度達(dá)1∶40，而滅活疫苗對(duì)照組小鼠的中和抗體滴度僅為1∶20；進(jìn)一步用HTNV攻擊免疫后的小鼠，并采用ELISA檢測(cè)小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器組織中的病毒特異性抗原，結(jié)果均為陰性，表明用HTNV重組腺病毒免疫可使小鼠獲得有效的保護(hù)[37]。

雖然活載體疫苗可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并保護(hù)動(dòng)物免受病毒的攻擊，但是其最大的缺點(diǎn)是接受疫苗接種的個(gè)體體內(nèi)預(yù)先存在的抗病毒載體抗體會(huì)影響活載體疫苗的免疫效果。Schmaljohn等[38]通過構(gòu)建含有HTNVGP和NP的重組痘苗病毒免疫地鼠和沙鼠后取得了很好的保護(hù)效果，但該疫苗后續(xù)的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)痘苗病毒抗體陰性的志愿者接種后100%產(chǎn)生了針對(duì)HTNV的特異性中和抗體，而先前體內(nèi)存在痘苗病毒抗體的志愿者接種后僅有50%能產(chǎn)生針對(duì)HTNV的特異性中和抗體[39]，再加上活載體疫苗本身潛在的副作用風(fēng)險(xiǎn)，使得該疫苗的研制工作最終擱淺[40]。

5 HTNV病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒（virus-likeparticle，VLP）是由病毒的一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白組成的不含病毒核酸的空心顆粒。這些VLP可以自我組裝，與天然病毒的空間結(jié)構(gòu)高度相似，因而保持了病毒抗原蛋白的天然構(gòu)象并具有很好的免疫原性；同時(shí)由于不含病毒核酸，不能自我復(fù)制，因而不會(huì)出現(xiàn)毒力返祖，無感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，VLP是研制HTNV基因工程疫苗的一種安全、高效的候選疫苗。

目前關(guān)于HTNVVLP疫苗的研究還比較有限，但已有研究表明HTNV的結(jié)構(gòu)蛋白可以自我組裝形成VLP，并且具有良好的免疫原性。如Betenbaugh[33]等利用BEVSpFastBacDual分別構(gòu)建了含有HTNVM及S基因的rBV，將rBV共感染Sf9昆蟲細(xì)胞制備了HTNVVLP，免疫小鼠后可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的中和抗體。Li[35]等利用真核表達(dá)載體VH-dhfr/A9構(gòu)建了含有HTNVM及S基因的重組質(zhì)粒VH-dhfr/A9M及VH-dhfr/A9S，并通過共轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞的方式制備了HTNVVLP，用其免疫小鼠后可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Cheng[41]等將GPI錨定形式的GM-CSF或CD40L整合到HTNVVLP中以產(chǎn)生嵌合VLP，發(fā)現(xiàn)GM-CSF和CD40L摻入HTNVVLP誘導(dǎo)高水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并保護(hù)C57BL/6小鼠免受HTNV攻擊。

VLP作為基因工程候選疫苗，不僅僅用于HTNV疫苗的研制，也廣泛應(yīng)用于其他病毒疫苗的研制。目前VLP疫苗研制工作中最關(guān)鍵的問題在于如何大量表達(dá)和純化VLP，因此選擇一種合適的表達(dá)系統(tǒng)顯得尤為重要。

6 結(jié)語

綜上所述，HTNV新型基因工程疫苗的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但是距離實(shí)際應(yīng)用還相差很遠(yuǎn)。目前存在的主要問題包括目的蛋白的表達(dá)量還不高，各表達(dá)系統(tǒng)（產(chǎn)物）刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答水平還不理想。因此，進(jìn)一步篩選和優(yōu)化組合有效的保護(hù)性抗原，進(jìn)一步選擇合適的表達(dá)載體并優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)，并聯(lián)合應(yīng)用免疫佐劑，以提高目的基因刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的能力，都值得深入探索。

參考文獻(xiàn)