方莉，劉瑤，張永香，梁佳美，許媛，陳瑩，鄭陽(yáng)

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川 南充 637000)

氯吡格雷為目前臨床血小板受體P2Y12抑制劑[1]，在體內(nèi)主要依賴CYP2C19酶活化后轉(zhuǎn)化為活性產(chǎn)物，經(jīng)二硫鍵不可逆地連接到血小板表面二磷酸腺苷(ADP)受體P2Y12上，通過(guò)抑制ADP受體依賴性的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物的形成來(lái)抑制血小板的聚集[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，CYP2C19酶存在多種突變等位基因,在中國(guó)人群中，CYP2C19*2和CYP2C19*3兩種類型是主要的兩種變異類型，這兩種突變基因型均能造成CYP2C19酶活性的減低或完全喪失，從而對(duì)氯吡格雷療效產(chǎn)生重要影響。且有數(shù)據(jù)顯示[4]，至少攜帶一種突變型基因的患者再發(fā)心肌梗死，支架內(nèi)血栓等疾病的發(fā)生率明顯高于基因型為野生型的患者。許多研究表明[5]，氯吡格雷運(yùn)用于部分患者時(shí)，其抗血小板作用降低或無(wú)抗血小板作用，該現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗 。2010年3月，美國(guó)FDA發(fā)布警告，建議臨床醫(yī)師在給患者使用氯吡格雷之前進(jìn)行CYP2C19多態(tài)性檢測(cè)，以便于了解患者對(duì)氯吡格雷的代謝能力，及時(shí)調(diào)整用藥方案[6-7]。對(duì)存在氯吡格雷抵抗的患者，可適當(dāng)增加用藥劑量或者換用新藥，如替格瑞洛和普拉格雷等新型抗血小板藥物。臨床在使用氯吡格雷之前，對(duì)CYP2C19基因多態(tài)性的檢測(cè)，有利于臨床醫(yī)師合理的選擇藥物，從而降低心血管不良事件的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 臨床病例

選擇2014年7月至2016年4月，本院心內(nèi)科住院患者353例作為研究對(duì)象?；颊吣挲g23～89歲，平均65歲；男性233例(66.01%)，女性120例(33.99%)。

1.2 材料與設(shè)備

1.2.1 試劑 核酸提取試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)、CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)。

1.2.2 儀器設(shè)備 生物安全柜(Biobase山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)、高速冷凍離心機(jī)(5730R， Eppendorf)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(SLAN96，上海宏石醫(yī)療科技有限公司)、全自動(dòng)雜交儀(BaiO?e-Hyb，上海百傲科技股份有限公司)、生物芯片識(shí)讀儀(BaiO?BE-2.0，上海百傲科技股份有限公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè) (1)血液采集和處理：采集2 mL靜脈血于EDTA抗凝管，充分混勻，將標(biāo)本放置在標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱中，由專業(yè)人員在30 min內(nèi)送檢，若未能及時(shí)送檢的標(biāo)本，離心后在2～8 ℃下保存，避免反復(fù)凍融。按照上海百傲科技股份有限公司核酸提取試劑說(shuō)明書從全血標(biāo)本中提取基因組DNA。(2)PCR擴(kuò)增：將提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件為50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 5 min。(3)雜交顯色：用雜交顯色試劑盒在BaiO?e-Hyb全自動(dòng)雜交儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交顯色。(4)掃描讀片及結(jié)果：在生物芯片識(shí)讀儀上讀片并判斷基因型。如圖1、圖2所示，代謝分為EM(*1/*1)，IM(*1/*2、*1/*3)，PM(*2/*2、*2/*3、*3/*3)。

表1 PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系

1.3.2 檢測(cè)后用藥情況 結(jié)合353例患者的病歷，對(duì)患者性別、年齡及CYP2C19 基因檢測(cè)前后氯吡格雷使用情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將檢測(cè)后用藥方案的改變分為3組：A組為增加氯吡格雷用藥的劑量；B組為氯吡格雷與阿司匹林、西洛他唑等聯(lián)合用藥；C組為停止使用氯吡格雷，換用替格瑞洛、普拉格雷等新藥。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表述，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP2C19基因型分布

入選的353例患者中，CYP2C19基因型分布情況見(jiàn)表2，*1/*1型和*1/*2型所占比例大，分別為43.91%和36.54%，*3/*3型比例最小，僅為0.28%。CYP2C19代謝型分布見(jiàn)表3，慢代謝和中間代謝所占比例達(dá)56.09%。

表3 353例患者CYP2C19代謝型分布

2.2 臨床符合率

入選的353例患者中，臨床醫(yī)師在CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)后，共有62例患者及時(shí)調(diào)整了氯吡格雷的使用，其中IM有39例，PM有23例。與IM相比，PM患者的符合率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.85，P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 CYP2C19基因代謝型與臨床用藥符合率

注：符合率=用藥方案改變例數(shù)/該代謝型總例數(shù)。

2.3 臨床用藥方案

入選的353例患者中，臨床在CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)后，將用藥方案的改變分為3組：A組，B組,C組，對(duì)于IM和PM患者而言，A組，B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A組χ2=1.41，P>0.05；χ2=1.98，P>0.05)，C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.13,P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 CYP2C19基因代謝型與用藥方案的分布

3 討論

氯吡格雷作為一種常見(jiàn)的抗血小板藥物，其代謝受CYP2C19基因多態(tài)性的影響，不同患者對(duì)氯吡格雷的治療反應(yīng)性不同[8]。CYP2C19是CYP450酶第二亞家族中的重要成員，其遺傳多態(tài)性影響氯吡格雷介導(dǎo)的血小板抑制作用，主要不良心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，以及冠心病患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療[9]。研究表明[10]，基因芯片對(duì)中國(guó)人常見(jiàn)細(xì)胞色素酶CYP2C19基因突變位點(diǎn)檢出率高，可滿足臨床CYP2C19基因檢測(cè)要求。

簡(jiǎn)斌等[11]對(duì)云南地區(qū)部分居民進(jìn)行CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EM占41.70%，IM占43.80%，PM占15.5%；基因型以*1/*1和*1/*2居多，*3/*3型極少。劉琦等[12]對(duì)大連地區(qū)漢族部分居民進(jìn)行CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EM占43.84%，IM占45.14%，PM占11.02%；基因型以*1/*1和*1/*2居多，*3/*3型極少。陳枝挺等[13]對(duì)福建地區(qū)部分居民進(jìn)行CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EM占50.00%，IM占39.20%，PM占10.80%；基因型以*1/*1和*1/*2居多，*3/*3型極少。

本研究中，353例患者中EM占43.91%，IM占42.78%，PM占13.31%；基因型以*1/*1和*1/*2為主，*3/*3最少見(jiàn)，與簡(jiǎn)斌，劉琦，陳枝挺等的研究結(jié)果相符，由此可見(jiàn)，CYP2C19基因多態(tài)性分布無(wú)明顯的地域差異。

攜帶CYP2C19功能喪失性等位基因(PM和IM患者)可導(dǎo)致氯吡格雷抗血小板作用減弱，增加急性冠狀綜合征患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后6個(gè)月的主要心血管不良事件發(fā)生率[14]。替格瑞洛能明顯減少經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后主要不良心血管事件，并不增加主要出血[15]。

與IM相比，PM患者的符合率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組和B組中，IM和PM無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組中，IM和PM有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，對(duì)于IM患者以增加氯吡格雷劑量和氯吡格雷與阿司匹林、西洛他唑等聯(lián)合用藥這兩種用藥方案為主；對(duì)于PM患者，可以換用替格瑞洛等新藥，同時(shí)加強(qiáng)血小板功能，防止出血。對(duì)于增加劑量而抗血小板效果不佳者，可考慮聯(lián)合用藥或更換藥物[16]。但有研究[17]顯示這些新藥會(huì)增加患者出血的風(fēng)險(xiǎn)，且上市時(shí)間較短，可能存在一些未知的不良反應(yīng)，故使用時(shí)應(yīng)予以注意[18]。韋琪等觀察兩種不同的P2Y12受體抑制劑治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征的療效，結(jié)果表明：應(yīng)用替格瑞洛較加量氯吡格雷對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者血小板抑制作用更強(qiáng)，但會(huì)增加呼吸困難的發(fā)生率[19]。另外，替格瑞洛用于氯吡格雷抵抗急性心肌梗死患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后，抗血小板功能顯著，但對(duì)肝腎功能有一定影響[20]。

由于CYP2C19基因所表達(dá)的酶不僅代謝氯吡格雷，還對(duì)苯妥英，奧美拉唑等藥物有代謝作用。因此，CYP2C19基因型檢測(cè)也可幫助指導(dǎo)臨床對(duì)這些藥物的應(yīng)用[21]。然而影響氯吡格雷代謝情況的不只是基因型這一種因素， 實(shí)際上氯吡格雷抵抗存在著基因水平、分子水平、臨床水平等諸多影響因素[22]。因此，臨床上應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)估，以此來(lái)找到適合患者的用藥方案。

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