鄒海英，余 佶，余兆碩，張 敏，劉 芳，麻成金

(吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000)

椪柑又名蘆柑，汁多爽口，酸甜宜人，富含維生素、胡蘿卜素以及多種人體所需的礦物質(zhì)，其中尤以硒含量見長，是備受消費者喜愛的富硒水果之一.由新鮮椪柑果汁釀制而成的椪柑果醋不僅帶有椪柑特有的風(fēng)味，還具有抑菌、抗氧化、緩解疲勞、預(yù)防飲食型肥胖和高脂血癥等功效[1-2].由于椪柑中的柚皮苷和檸檬苦素類似物質(zhì)具有強烈苦味[3],椪柑制品也因味苦問題難以被廣泛接受，因此產(chǎn)品脫苦就顯得尤為重要.近些年來，國內(nèi)外對不同果汁的脫苦技術(shù)研發(fā)主要集中在酶脫苦法、樹脂排苦法、代謝脫苦法、包埋脫苦法等.[4-6]檸檬苦素類脫苦酶與柚苷酶等能專一脫除椪柑汁苦味，但存在價格偏高、特定選育困難等問題.活性炭脫苦因其安全性與經(jīng)濟性而被廣泛應(yīng)用，超聲波輔助活性炭脫苦的研究也日趨增多[7]，但活性炭吸附苦味的同時會使椪柑飲品中的pH值上升，導(dǎo)致其內(nèi)部發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生硫化物[8].苦味物質(zhì)的包埋劑β-環(huán)糊精可對活性炭脫苦處理后的椪柑果汁進行再脫苦，并包埋不良氣味.[9]本實驗以湘西椪柑為研究對象，在超聲波輔助活性炭吸附苦味物質(zhì)的基礎(chǔ)上，采用β-環(huán)糊精包埋法作進一步脫苦處理，并采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化脫苦后的椪柑果醋醋酸發(fā)酵工藝條件，為生產(chǎn)口味更佳的果醋產(chǎn)品、提高椪柑加工產(chǎn)品的附加值、推動湘西椪柑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供幫助.

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

新鮮椪柑：從吉首市農(nóng)貿(mào)市場購置，經(jīng)測定，糖酸比不小于11.1∶1，糖度11.7%.

試劑：安琪活性干酵母(湖北安琪酵母股份有限公司)；醋酸菌種(粉包，上海佳民釀造食品有限公司)；檸檬苦素標準品(國藥集團)；食用酒精、果漿酶、果膠酶、硅藻土、殼聚糖、活性炭、X16樹脂，食品級；無水乙醇、丙酮、二氯甲烷、濃硫酸、高氯酸、冰醋酸、對二甲胺基苯甲醛、FeCl3等，國產(chǎn)分析純.

主要儀器設(shè)備：XB124型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；pHSJ-4F型精密pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；FUMA-QYC200型變頻搖床(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司)；722型分光光度計(上海舜宇恒平有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程和操作要點 本實驗工藝流程為：新鮮椪柑—去皮—打漿—酶解—復(fù)合脫苦—過濾—調(diào)整糖度—酒精發(fā)酵—椪柑果酒—酒精度調(diào)整—加活化醋酸菌—醋酸液態(tài)發(fā)酵—滅菌—澄清過濾—椪柑果醋.操作要點：(1)酵母活化.按實驗用量稱取活性干酵母，在溫度38 ℃下保持水浴30 min后，將活化好的酵母液冷卻至30 ℃以下備用.(2)醋酸菌活化.將1%葡萄糖和1%酵母膏加入無菌水中加熱溶解滅菌，然后冷卻至70 ℃，加入4%無水乙醇制成液體活化培養(yǎng)基，然后將菌粉(0.005 g/mL)接入活化培養(yǎng)基中，于32 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，備用.(3)酶解.將果汁加熱至45 ℃恒溫，加入0.2%果漿酶和0.15%果膠酶進行酶解.(4)復(fù)合脫苦.將酶解后的果汁經(jīng)超聲波輔助吸附劑脫苦，再經(jīng)β-環(huán)糊精包埋復(fù)合脫苦，攪拌均勻后，過濾.(5)酒精發(fā)酵.酒精發(fā)酵工藝參照文獻[10]進行，參數(shù)作部分調(diào)整，椪柑果汁含糖量調(diào)整為10%，酵母用量0.05%，發(fā)酵溫度32 ℃，發(fā)酵時間7 d.(6)醋酸發(fā)酵.將椪柑果酒醪中酒精度調(diào)整為6%，pH值4.2左右，接入活化醋酸菌培養(yǎng)液，恒溫搖床震蕩至發(fā)酵結(jié)束.

1.2.2 吸附劑篩選與超聲波輔助脫苦實驗 首先，控制單一吸附劑(硅藻土、殼聚糖、活性炭)用量為1%，X16樹脂用量4%[11]，在溫度40 ℃攪拌脫苦60 min后比較脫苦率，并篩選較優(yōu)的吸附劑；其次，對比單一脫苦劑與超聲波輔助后脫苦率，評價超聲波應(yīng)用顯著性.超聲波條件為超聲功率100 W、處理60 min.

1.2.3 醋酸發(fā)酵單因素實驗 以總酸量為評價指標，選取醋酸菌接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速為考察因素進行單因素實驗，初步實驗條件選定為醋酸菌培養(yǎng)液接種量8%、發(fā)酵溫度32 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵時間5 d.

1.2.4 優(yōu)化實驗 采用Box-Behnken設(shè)計(BBD)，以總酸量為評價指標，選擇較優(yōu)因子優(yōu)化椪柑醋酸發(fā)酵的工藝參數(shù).

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 BBD用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件處理，因素顯著性分析用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理，且P<0.05時表明差異顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合脫苦實驗

2.1.1 不同吸附劑對椪柑果汁脫苦效果的影響 結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，用X16樹脂、硅藻土、殼聚糖、活性炭等4種脫苦劑分別對椪柑果汁進行脫苦，活性炭的效果最好，同時超聲波輔助均能顯著提高不同吸附劑的脫苦效果.這是因為超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)加劇了分子運動，促進了苦味物質(zhì)分子與吸附劑的有效結(jié)合.

2.1.2 不同脫苦技術(shù)的效果比較 分別用β-環(huán)糊精(組1)、“活性炭+超聲波輔助”(組2)、“活性炭+超聲波輔助+β-環(huán)糊精”(組3)，對椪柑果汁進行脫苦處理，結(jié)果如圖2所示.

由圖2可知，組1效果不明顯，組3效果優(yōu)于組2和組1，而組3和組2脫苦效果差異顯著.說明在超聲波輔助活性炭脫苦基礎(chǔ)上，應(yīng)用β-環(huán)糊精進行脫苦是有必要的.β-環(huán)糊精進一步包埋苦味與其他不良風(fēng)味，脫苦率達到74.37%，因此，本實驗選擇“活性炭+超聲波輔助+β-環(huán)糊精組”技術(shù)對椪柑果汁進行脫苦處理.

圖1 不同吸附劑和超聲波輔助脫苦效果Fig. 1 Debittering Effect of Different Adsorbents with and Without Ultrasonic Technology

圖2 不同脫苦技術(shù)的效果Fig. 2 Debittering Effect of Different Techniques

2.2 酒精發(fā)酵

[10]，在果汁含糖量10%、酵母添加量0.05%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間7 d的條件下進行酒精發(fā)酵，得椪柑果酒醪，酒精度實測值5.5%(V/V).

2.3 醋酸發(fā)酵單因素實驗

2.3.1 醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響 結(jié)果如圖3所示.由圖3可知：醋酸菌培養(yǎng)液接種量在4%～14%時，隨著發(fā)酵時間增加，總酸逐漸增加；第4天后，4%接種量的實驗組醋酸發(fā)酵仍保持較快增長速度，14%接種量實驗組醋酸菌代謝爭奪，總酸量反而略有下降，其余實驗組發(fā)酵速度減緩；各組在第5天后總酸量增長不明顯.因此，醋酸菌培養(yǎng)液接種量選擇6%～12%，發(fā)酵時間選擇5 d左右為宜.

圖3 醋酸接種量對醋酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of Inoculum Size of Acetic Acid Bacteria on Fermentation

圖4 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響Fig. 4 Effect of Temperature on Acetic Acid Fermentation

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對醋酸發(fā)酵的影響Fig. 5 Effect of Rotation Speed of Shaker on Acetic Acid Fermentation

2.3.2 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響 結(jié)果如圖4所示.由圖4可知：發(fā)酵溫度為28～32 ℃時，隨著溫度上升，總酸量快速升高；發(fā)酵溫度超過32 ℃后，發(fā)酵增速開始減緩；至34 ℃總酸量開始下降，高溫嚴重抑制了醋酸菌中氧化酶的活性.因此，醋酸發(fā)酵的溫度控制在32 ℃左右為宜.

2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對醋酸發(fā)酵的影響 結(jié)果如圖5所示.由圖5可知：搖床轉(zhuǎn)速在80～120 r/min時，隨著轉(zhuǎn)速上升，總酸量快速升高；至120 r/min后增速減緩；至160 r/min時，總酸量達最大值；此后總酸量開始下降.因此，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實際，醋酸發(fā)酵的搖床轉(zhuǎn)速控制在120～160 r/min為宜.

2.4 BBD優(yōu)化醋酸發(fā)酵實驗

2.4.1 BBD實驗設(shè)計 BBD優(yōu)化椪柑果醋醋酸發(fā)酵的實驗因素水平編碼見表1，BBD方案及結(jié)果見表2.

表1 BBD實驗因素水平編碼

表2 BBD方案及結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析.二次多元回歸模型方程為

Y= 5.20+0.15A+0.087B+0.13C+0.050D+0.022AB-0.095AC-0.033AD+

0.053BC-0.018BD+0.030CD+0.068A2-0.11B2-0.096C2-0.12D2.

2.4.2 優(yōu)化工藝模型方差分析及其顯著性檢驗 對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3.

表3 模型的方差分析結(jié)果

續(xù)表3

②顯著(0.01

由表3可知，該模型極顯著(P<0.05)且失擬項不顯著(P>0.05)，說明Design Expert 8.0.6軟件對優(yōu)化模型與實驗數(shù)據(jù)能進行較好的擬合，可用于椪柑果醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化的預(yù)測及分析.實驗因素對醋酸發(fā)酵的影響大小順序為A，C，B，D.舍棄不顯著的實驗因子，擬合公式可簡化為

Y=5.20+0.15A+0.087B+0.13C+0.050D-0.095AC-0.033AD+0.053BC+

0.030CD+0.068A2-0.11B2-0.096C2-0.12D2.

圖6 醋酸菌接種量與發(fā)酵溫度的響應(yīng)面分析Fig. 6 Response Surface Analysis of Inoculum Size and Fermen- tation Concentration of Acetic Acid Bacteria

2.4.3 響應(yīng)曲面分析 對椪柑果醋醋酸發(fā)酵過程影響較顯著的4個交互因子進行三維響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖6—8所示.結(jié)合方差分析和響應(yīng)曲面的陡度走勢及等高線密度，進一步表明了實驗因子對響應(yīng)值的影響關(guān)系，A-C和B-C均存在極顯著的交互作用，同時A-D和C-D交互作用顯著，說明椪柑果醋的醋酸發(fā)酵受4個因素作用明顯，驗證了考察因子選擇的正確性.

由圖6可知：發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度一定時，總酸量隨醋酸菌接種量的增加而增加；在底物充足的條件下，醋酸菌生長旺盛，持續(xù)產(chǎn)酸，發(fā)酵過程中應(yīng)該對醋酸菌接種量嚴格控制.由圖7可知，在發(fā)酵溫度一定時，總酸量隨發(fā)酵時間的增加而先增加后減小，反之亦然.圖8中兩因素的交互作用與圖7類似，此種情況下，選用響應(yīng)面預(yù)測優(yōu)勢明顯.

圖7 發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度的響應(yīng)面分析Fig. 7 Response Surface Analysis of Fermentation Time and Temperature

圖8 發(fā)酵溫度與搖床轉(zhuǎn)速的響應(yīng)面分析Fig. 8 Response Surface Analysis of Fermentation Temperature and Rotation Speed

2.4.4 醋酸發(fā)酵優(yōu)化條件與驗證 Expert-Design 8.0.6軟件分析結(jié)果表明，以椪柑酒醪為原料的醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化條件為：醋酸菌培養(yǎng)液接種量10.0% (mL)，搖床轉(zhuǎn)速122.13 r/min，發(fā)酵溫度32.73 ℃，發(fā)酵時間5.6 d.在此條件下，醋酸發(fā)酵的每100 mL果醋理論產(chǎn)酸量為5.64 g.充分考慮實際操作情況，將工藝參數(shù)修正為:醋酸菌培養(yǎng)液接種量10%(mL)，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵溫度33 ℃，發(fā)酵時間6 d.3組平行驗證實驗每100 mL果醋總酸實測值為5.52±0.032 g，與理論值差異不顯著，故采用BBD優(yōu)化的醋酸發(fā)酵條件，具有實用價值.

2.5 脫苦效果的感官評價

對果汁、果醋分別進行苦味的感官評價.感官評價按6個苦味等級進行打分：0分，完全不苦；1分，剛好可以感受到苦味；2分，微苦；3分，苦味較明顯；4分，苦味強烈；5分，苦味無法忍受.結(jié)果見表4.

表4 苦味感官評價

注：不同字母代表組間苦味有顯著差異.

由表4可知：未脫苦果醋與未脫苦果汁的苦味差異不顯著，但未脫苦果醋的苦味比未脫苦果汁高；同時脫苦果醋與脫苦果汁苦味差異不顯著，但脫苦果醋的苦味也比脫苦果汁要高.這可能是柚皮苷、檸檬苦素等苦味物質(zhì)在醋酸發(fā)酵過程中進一步縮合，使得苦味加重的原因.2種產(chǎn)品脫苦前后相比苦味均有顯著差異，脫苦后果醋的苦味更接近脫苦的果汁，這充分說明前期脫苦有效避免了發(fā)酵過程中苦味的進一步生成，實驗所采用的復(fù)合脫苦技術(shù)是有效的，對椪柑果醋的苦味脫除有較大應(yīng)用價值.

3 結(jié)論

(1)本工藝以新鮮椪柑為原料，榨汁后經(jīng)復(fù)合脫苦、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等工序制得脫苦型椪柑果醋.用BBD優(yōu)化得到的果醋發(fā)酵參數(shù)為：醋酸菌培養(yǎng)液接種量10%(mL)，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵溫度33 ℃，發(fā)酵時間6 d.此條件下，所得果醋成品色澤鮮亮，苦澀感少，酸味協(xié)調(diào)，每100 mL果醋總酸實測值為5.52 g，差異不顯著，說明整體工藝參數(shù)合理.

(2)脫苦實驗結(jié)果表明，應(yīng)用復(fù)合脫苦技術(shù)后，果醋脫苦率可達74.37%，復(fù)合脫苦技術(shù)對椪柑果醋中的苦味剔除感官評價效果較為理想，具有較大應(yīng)用價值，但也存在復(fù)合脫苦處理時間較長、增加超聲波設(shè)備等問題，需進一步合理優(yōu)化.

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