楊金來，吳良如，潘雁紅,楊慧敏，鐘 浩, 修誠(chéng)明

(1.國(guó)家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州 310012； 2.浙江省竹子高效加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012；3.福建6·18協(xié)同創(chuàng)新院竹產(chǎn)業(yè)(建甌)分院，福建 建甌 353100)

中國(guó)現(xiàn)有竹林面積 601 萬hm2，以毛竹林為主(約占2/3)[1]，主要生長(zhǎng)于福建、浙江、江西、湖南等省份[2]。毛竹林主要生產(chǎn)竹筍、竹葉和竹材等產(chǎn)品，其中竹筍和竹葉[3]富含蛋白，是一種潛在的天然可再生的綠色植物蛋白源。新鮮竹筍含水量約為90%，其蛋白含量高為1.49%～4.04%，平均值為2.65%，干物質(zhì)蛋白含量非常豐富[4-5]。徐圣友等[6]分析了不同品種竹筍的蛋白質(zhì)，其干物質(zhì)含量為19.01%～30.66%，其中安徽皖南毛竹為19.01%。劉永等[7]提取了肇慶竹葉中的蛋白，其提取率為9.86%。因此，研究竹筍和竹葉蛋白情況對(duì)于其進(jìn)一步高值化利用具有一定的指導(dǎo)意義。杭州余杭地區(qū)，其毛竹筍[8]共含有1 014個(gè)蛋白點(diǎn)，等電點(diǎn)主要集中在pH=6～7，相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在45～116 kDa；雷竹筍[9]僅含有812個(gè)蛋白點(diǎn)數(shù)，等電點(diǎn)集中于pH=9～10，相對(duì)分子質(zhì)量集中于45～116 kDa。

竹筍好吃，但生吃有麻感，而建甌市毛竹筍就可以生吃，因筍肉顏色比一般的毛竹筍肉白，當(dāng)?shù)厝怂追Q白筍。建甌市具有獨(dú)特的氣候環(huán)境和良好的土質(zhì)，其毛竹粗大，生長(zhǎng)出來的竹筍肉質(zhì)鮮嫩、通體潔白、口感脆甜。因此，非常有必要進(jìn)一步研究建甌白筍的蛋白情況。研究以建甌白筍及其竹葉(圖1)為原料提取出總蛋白，并進(jìn)行了總蛋白的雙向電泳實(shí)驗(yàn)。

圖1 建甌白筍及其竹葉Fig.1 Jianou Bai Moso bamboo shoots and leaves

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

主要材料：建甌白筍和竹葉(同1棵竹子)采自福建省建甌市房道鎮(zhèn)連地村；5 mg·mL-1牛血清(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)；二硫蘇糖醇(DTT)、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、過硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、正丁醇、碘乙酰胺(IAA)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、普通瓊脂糖、乙醇、冰醋酸、硫代硫酸鈉、硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、Na2EDTA·H2O等均為AR；Bradford 染液(595 nm)、Tris 飽和酚、RB 裂解液、PMSF(p0754)、蛋白提取緩沖液(500 mmol·L-1Tris-HCl，pH=8.65；50 mmol·L-1EDTA；100 mmol·L-1KCl；2 mmol·L-1DTT)等由上海生工提供；干膠條(24 cm，pH 3～10，GE)，IPG Buffer pH 3～10 (GE)，2D電泳樣品提取緩沖液系列(上海生工，PL039)、2D Equilibration Buffer(上海生，SD6030)。

主要儀器：UV1800型分光光度儀(上海美譜達(dá)儀器有限公司)，等電聚焦儀(GE ETTAN IPGPHOR3)，DALT-SIX SDS-PAG電泳儀(GE Healthcare)，掃描儀(MICROTEK ScanMaker i800)等。

1.2 方法

1.2.1總蛋白提取與純化 取1.5 g建甌白筍(竹葉)充分液氮研磨后，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管，加入10 mL蛋白提取緩沖液，再加10 mL Tris飽和酚，充分振蕩后于冰上保溫，每隔5 min振蕩1次，總共4次。然后4 ℃離心20 min(6 000 r·min-1)，將上層酚相轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。在離心管中加入與酚相同體積的蛋白提取緩沖液，充分振蕩后于冰上保溫，每隔5 min振蕩1次，總共6次，4℃離心30 min(5 000 r·min-1)，將上層酚相轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。加入5倍酚體積的醋酸銨甲醇溶液對(duì)蛋白進(jìn)行沉淀，充分振蕩后置于冰上保溫，每隔5 min振蕩1次，總共6次，-20 ℃沉淀過夜。蛋白質(zhì)離心30 min(4 ℃，5 000 r·min-1)，除去上清液，加入5 mL甲醇對(duì)蛋白進(jìn)行洗滌，除去蛋白中的色素及鹽，離心30 min (4 ℃，5 000 r·min-1)，再加入5 mL、4 mL丙酮對(duì)蛋白洗滌2次，離心20 min(4 ℃，12 000 r·min-1)后，溶解備用(竹筍蛋白3.0 mL，竹葉蛋白8.0 mL)。

1.2.2蛋白定量 以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bradford法[10]測(cè)定建甌白筍及其竹葉蛋白濃度并定量，用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)。

1.2.3雙向電泳 量取一定體積的竹筍及其竹葉蛋白，保證上樣量為1 200 μg，進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)[8-9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白定量

圖2 BSA濃度與吸光度的線性關(guān)系Fig.2 The linear relationship between the absorbance and concentration of BSA

采用元素分析法測(cè)定新鮮建甌白筍及其竹葉總蛋白，其含水量分別為90.49%和52.40%。將50℃烘干的竹筍片和竹葉分別粉碎成粉狀用于元素分析測(cè)定，結(jié)果表明，干竹筍粉和竹葉粉的總蛋白含量分別為27.60%和14.60%，其新鮮建甌白筍及其竹葉總蛋白含量分別為2.62%和6.95%。為了進(jìn)一步得到建甌白筍及其竹葉蛋白樣品的濃度并定量，采用紫外分光光度法測(cè)定了2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5 mg·mL-1BSA溶液的吸光度(595 nm)，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知， BSA的濃度與吸光度值之間存在良好的線性關(guān)系，y=0.0235x+0.2785 (R2=0.9951)。因此，采用該方法對(duì)建甌白筍及其竹葉蛋白樣品的濃度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表1所示。由表1可知，4組建甌白筍及其竹葉蛋白樣品的吸光度測(cè)定的RSD值分別為0.84%和1.28%，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好，其吸光度的平均值分別為0.540和0.513。然后，由方程y=0.0235x+0.2785計(jì)算出竹筍和竹葉蛋白樣品的濃度分別為11.13和9.98 mg·mL-1，提取量分別為33.4 mg和79.8 mg，提取率分別為2.23%和5.32%。因此。蛋白雙向電泳實(shí)驗(yàn)所需上樣量分別為107.8和120.2 μL。

表1 建甌白筍及其竹葉蛋白樣品的測(cè)定Tab.1 Determination on protein concentration of the Jianou Moso bamboo shoots and leaves

2.2 雙向電泳

建甌白筍及其竹葉總蛋白的雙向電泳如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可知，建甌白筍總蛋白含有1 626個(gè)蛋白點(diǎn)，而竹葉總蛋白含有900個(gè)蛋白點(diǎn)。建甌白筍為毛竹筍的1種，其蛋白點(diǎn)數(shù)明顯高于杭州市余杭區(qū)的毛竹冬筍(1 014個(gè))[8]和覆蓋雷竹筍(812個(gè))[9]。由圖4A可知，在pH=5～7時(shí)，建甌白筍及其竹葉蛋白點(diǎn)較多，分別為1 102個(gè)和589個(gè)，占總蛋白點(diǎn)的67.8%和65.4%，說明2種蛋白的等電點(diǎn)主要在pH=5～7。當(dāng)pH<5時(shí)，建甌白筍及其竹葉蛋白點(diǎn)僅為177個(gè)(10.9%)和168個(gè)(18.7%)，說明2種蛋白在該范圍分布較少，其中在pH=4～5時(shí)，竹葉酸性蛋白點(diǎn)數(shù)(164)高于白筍(143)。當(dāng)pH>7時(shí)，建甌白筍及其竹葉蛋白點(diǎn)為347個(gè)(21.3%)和143個(gè)(15.9%)，說明建甌白筍的堿性蛋白分布高于竹葉。由圖4B可知，在分子量為35～45 kDa時(shí)，建甌白筍及其竹葉蛋白點(diǎn)分布最為集中，分別達(dá)到382個(gè)(23.5%)和224個(gè)(24.9%)，明顯高于杭州市余杭區(qū)的毛竹冬筍(88個(gè))[8]。建甌白筍及其竹葉蛋白的分子量主要分布在18～66 kDa，蛋白點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為1 083(66.6%)和672(74.7%)，其它分子量范圍分布相對(duì)較少。結(jié)果表明，建甌白筍蛋白種類優(yōu)于竹葉蛋白，建甌白筍蛋白種類極其豐富(數(shù)量多于杭州余杭毛竹冬筍)。

圖3 建甌白筍(A)及其竹葉(B)總蛋白雙向電泳圖Fig.3 The 2-DE profile of total protein of Jianou Moso bamboo shoots (A) and leaves (B)

圖4 建甌白筍及其竹葉蛋白雙向電泳凝膠中不同等電點(diǎn)(A)和相對(duì)分子質(zhì)量(B)的蛋白點(diǎn)數(shù)Fig.4 The protein spots for different isoelectric point distribution (A) and various molecular mass (B) in 2-DE gel of Jianou Moso bamboo shoots and leaves

3 結(jié)論

以建甌連地村同一顆毛竹的白筍和竹葉為研究對(duì)象提取總蛋白，采用Bradford法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行了濃度測(cè)定(竹筍：11.13 mg·mL-1；竹葉：9.98 mg·mL-1)，并進(jìn)行了雙向電泳實(shí)驗(yàn)(pH=3～10)，其上樣量分別為107.8和120.2 μL。

(1) 建甌白筍含有1 626個(gè)蛋白點(diǎn)，明顯多于杭州余杭毛竹冬筍(1 024個(gè))和雷竹筍(812個(gè))，且差異性較大，蛋白種類極其豐富；同時(shí)，竹葉的蛋白點(diǎn)數(shù)也高達(dá)900個(gè)；(2) 建甌白筍及其竹葉的等電點(diǎn)主要集中在pH=5～7，含蛋白點(diǎn)分別為1 102個(gè)和589個(gè)，占總蛋白點(diǎn)數(shù)的67.8%和65.4%；其分子量主要分布在18～66 kDa，蛋白點(diǎn)數(shù)分別為1 083個(gè)和672個(gè)，占總蛋白點(diǎn)數(shù)的66.6%和74.7%。

建甌白筍(毛竹筍)及其竹葉在天然植物蛋白利用方面具有潛在的應(yīng)用前景。