張方方，鄧娟娟，王茜，張衡，劉玲彥，楊華，許引虎*

（1. 湖北省酵母功能重點實驗室，湖北宜昌 443033；2. 國家酵母技術(shù)研究推廣中心，湖北宜昌 443003；3. 安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003）

甘露糖蛋白是葡萄酒中主要的多糖之一，來源于釀酒酵母細(xì)胞壁。甘露糖蛋白是高度糖基化的蛋白，占細(xì)胞壁干重的35%～40%[1]，位于細(xì)胞壁的外層。甘露糖蛋白分子量在5～800 kDa，含有10%～20%蛋白質(zhì)和80% D-甘露糖[2]。

酵母甘露糖蛋白最初用于白葡萄酒的化學(xué)穩(wěn)定，近年有越來越多的釀酒師將其應(yīng)用于紅葡萄酒的釀造過程。研究發(fā)現(xiàn)，甘露糖蛋白在整個葡萄酒釀造過程中起著非常重要的作用，不僅影響葡萄酒的穩(wěn)定性，同時對紅葡萄酒的質(zhì)量也具有積極影響，主要有以下幾個方面[2-7]：（1）抑制酒石酸鹽結(jié)晶，穩(wěn)定酒石酸；（2）防止蛋白渾濁；（3）促進(jìn)蘋果酸-乳酸發(fā)酵；（4）吸附赭曲霉素A；（5）促進(jìn)葡萄酒香氣的相互作用；（6）影響葡萄酒的顏色；（7）降低粗糙單寧的收斂性，提升葡萄酒的口感。

葡萄酒的顏色最初源于發(fā)酵過程對葡萄皮中花色苷的浸漬，但是在發(fā)酵、陳釀、貯存等過程中葡萄酒顏色和花色苷成分等均發(fā)生變化。紅葡萄酒中的呈色物質(zhì)主要是花色素苷，它是決定葡萄酒品質(zhì)和感官質(zhì)量的重要因素之一。因此，對于葡萄酒中花色素苷的研究有著非常重要的意義[8]。

在420 nm、520 nm、620 nm波長處分別測定吸光度，通過色度、色調(diào)表達(dá)葡萄酒顏色并不能全面的反應(yīng)葡萄酒真實顏色特征。CIELAB是用來描述人眼可見的所有顏色的最完備的色彩模型，是由國際照明委員會提出，現(xiàn)已被世界各國正式采納，并作為國際通用的測色標(biāo)準(zhǔn)，它適用于一切光源色或物體色的表示與計算。在葡萄酒顏色評價中，CIELAB顏色空間是公認(rèn)的最佳葡萄酒顏色評價方法，能夠全面反映葡萄酒顏色信息[9-11]。

本試驗的目的是研究酒精發(fā)酵過程中甘露糖蛋白對葡萄酒發(fā)酵過程中顏色參數(shù)的影響以及酒精發(fā)酵結(jié)束后對葡萄酒中顏色相關(guān)指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

天平，小型發(fā)酵罐，移液器，冷凍離心機(jī)，島津紫外可見分光光度計UV-2000。

1.2 試驗材料

赤霞珠，188 g/L總糖，8.39 g/L總酸（以酒石酸計）；酵母CECA和甘露糖蛋白MP60均由安琪酵母股份公司研發(fā)；6%亞硫酸。

1.3 試驗方法

將葡萄除梗破碎后分別裝入小型發(fā)酵桶中進(jìn)行發(fā)酵，每桶裝3.5 kg葡萄，加入60 mg/L的6%亞硫酸，添加蔗糖將葡萄汁中的糖含量調(diào)節(jié)至230 g/L，添加250 mg/L葡萄酒活性干酵母CECA，300 mg/L甘露糖蛋白MP60，不添加甘露糖蛋白的樣品為對照，按照紅葡萄酒的發(fā)酵工藝，發(fā)酵溫度控制在25 ℃，10 d后酒精發(fā)酵結(jié)束，每個試驗重復(fù)兩次。

發(fā)酵過程中，每天取2 mL酒樣，在溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速10 000 r/min下離心6 min，取上清酒液測定葡萄酒的CIELAB參數(shù)及色度和色調(diào)。采用CIELAB[10-11]法計算發(fā)酵過程中葡萄酒的a*值、b*值、亮度L*值、飽和度C*值以及色調(diào)角H*。選取2 mm的比色皿，用蒸餾水作為空白對照，分別測定葡萄酒在波長為420 nm、520 nm和620 nm下的吸光度A420、A520和A620，色度＝5×(A420＋A520＋A620)，色調(diào)＝A420/A520。

發(fā)酵結(jié)束后，取樣測定CIELAB參數(shù)，輔色素化花色苷、單體花色苷、聚合花色苷和總花色苷[12]。取2 mL酒樣，添加20 μL 20% 乙醛水溶液，混勻靜置45 min，在1 mm比色皿中，波長為520 nm，測得的吸光值為總花色苷（Aace）；取2 mL酒樣，添加160 μL 5%（w/v）SO2，在1 mm比色皿中，波長為520 nm，測得吸光值為聚合花色苷（ASO2）；取酒樣在1 mm的比色皿中，波長為520 nm條件下的吸光值為Awine。單體花色苷：Awine-ASO2；輔色素化花色苷：Aace-Awine。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中葡萄酒色度和色調(diào)的變化

從圖1可以看出，發(fā)酵開始葡萄汁中的顏色比較淺，色度低，但是色調(diào)比較高。以后色度不斷上升，發(fā)酵第3天色度達(dá)到最高值，隨后色度下降，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。添加甘露糖蛋白MP60的酒精發(fā)酵過程中，色度始終高于對照，最高達(dá)到13.1，雖然隨后有所下降，但隨后的發(fā)酵中色度均比對照高。在此過程中，兩處理的色調(diào)變化趨勢一致，因此添加甘露糖蛋白MP60對葡萄酒的色調(diào)影響不大。

2.2 葡萄酒發(fā)酵過程中a＊和b＊值的變化

CIELAB參數(shù)中，其中a*與紅綠相關(guān)，a*＞0與紅色相關(guān)，a*＜0與綠色相關(guān)。圖2顯示發(fā)酵開始時a*值較小，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄皮中的顏色不斷浸漬出來，a*值增大，表示葡萄酒的顏色越來越紅，到達(dá)峰值后葡萄酒的a*值稍有下降。這可能與葡萄醪中的酒度有關(guān)，隨著酒度的增加，葡萄汁中的花色苷會受酒精的影響，可能變成無色的，因此導(dǎo)致a*值的下降。添加甘露糖蛋白的葡萄酒中a*值始終高于對照，因此甘露糖蛋白有助于紅色色度的提高。

圖1 酒精發(fā)酵過程中色度和色調(diào)的變化Figure 1 Dynamics of chromaticity and hue during wine fermentation

CIELAB參數(shù)中，b*與黃藍(lán)相關(guān)，b*＞0與黃色相關(guān)，b*＜0與藍(lán)色相關(guān)。從圖2可以看出，b*值首先是上升的，隨后下降，在發(fā)酵第5天時出現(xiàn)最小值，然后再上升，在第10天時達(dá)到最大值。在發(fā)酵后第3天之前添加甘露糖蛋白處理的b*值低于對照，隨后均大于對照。在整個發(fā)酵過程中的b*＞0。

圖2 葡萄酒酒精發(fā)酵階段a*和b*的變化Figure 2 Dynamics of a* and b* during wine fermentation

2.3 葡萄酒發(fā)酵過程中L＊和C＊的變化

在CIELAB參數(shù)中，L*表示明暗程度，與葡萄酒的顏色深淺呈反比，圖3顯示在發(fā)酵第1天，L*值最大，顏色最淺，隨后L*值不斷的降低，在發(fā)酵第3天顏色最深，特別是添加MP60的赤霞珠葡萄酒的顏色，最低L*值達(dá)到52.37，然后L*值緩慢上升，最后達(dá)到一個相對穩(wěn)定的平衡階段。添加甘露糖蛋白MP60的葡萄酒中，發(fā)酵中后期的L*值均低于對照，說明添加MP60的葡萄酒的顏色比對照顏色深。

C*表示發(fā)酵過程中葡萄酒的飽和度，飽和度C*即葡萄酒的鮮艷程度，C*值越大，顏色越純正。從圖3中可以看出，發(fā)酵前期葡萄酒的飽和度上升較快，后期變化平緩，因此葡萄酒的顏色較好，且添加甘露糖蛋白的葡萄酒中飽和度C*值比對照高，因此顏色的飽和度高于對照。

2.4 酒精發(fā)酵結(jié)束后的顏色相關(guān)參數(shù)

圖3 葡萄酒酒精發(fā)酵過程中L*值與C*值的變化Figure 3 Dynamics of L* and C* during wine fermentation

酒精發(fā)酵結(jié)束后，檢測CIELAB、色度、色調(diào)以及花色苷等與顏色相關(guān)的參數(shù)。從表1中可以看出，添加甘露糖蛋白的葡萄酒色度比對照高1.20，L*值為59.97，顯著低于對照，說明顏色更深；飽和度C*為50.67，比對照高2.75，因此顏色飽和度更好。因此添加甘露糖蛋白的葡萄酒中的CIELAB參數(shù)及色度明顯好于對照。

H*表示色調(diào)角，紅色為0°（360°）；黃色為90°；綠色為180°；藍(lán)色為270°。ΔE*表示兩種葡萄酒之間的色差，ΔE*＜1可以認(rèn)為兩個酒樣之間沒有色差，當(dāng)ΔE*＞1可以認(rèn)為兩個酒樣之間有色差，ΔE*值越大表示顏色的差異也越大。在本次試驗中，ΔE*為5.02，明顯大于1，因此兩個葡萄酒之間存在著明顯的色差，添加甘露糖蛋白有助于葡萄酒顏色的提升。

表2中的數(shù)據(jù)是酒精發(fā)酵結(jié)束后酒樣中的酸、多酚以及不同種類花色苷的含量。葡萄酒中的酸、pH、單寧、總酚以及花色苷的含量影響葡萄酒的顏色。從表2中可以看出，兩個酒樣的總酸、pH、單寧和總酚的含量都沒有差異，因此并非酸和單寧含量的不同造成的葡萄酒顏色的差異。分析不同的花色苷的含量可以看出，兩個酒樣的輔色素化花色苷存在顯著差異，添加甘露糖蛋白的葡萄酒中的輔色素化花色苷為0.95，顯著高于對照，甘露糖蛋白能與葡萄酒的花色苷化合物相互作用，從而起到穩(wěn)定花色素的作用。

表1 發(fā)酵結(jié)束后甘露糖蛋白對葡萄酒顏色的影響Table 1 Effect of mannoproteins on wine colour after fermentation

表2 酒精發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒理化指標(biāo)Table 2 Wine chemical parameters after alcoholic fermentation

3 討論與結(jié)論

葡萄酒的顏色是葡萄酒釀造中重要的指標(biāo)，也是影響葡萄酒質(zhì)量的重要參數(shù)，特別是在紅葡萄酒釀造中，甘露糖蛋白不僅能穩(wěn)定葡萄酒中的酒石酸，還能與葡萄酒中的花色苷等物質(zhì)相互作用，有利于葡萄酒顏色的浸提[2-3,13]。因此，甘露糖蛋白與葡萄酒中的酚類物質(zhì)相互作用，一方面改善葡萄酒的口感，另一方面對葡萄酒顏色的穩(wěn)定性帶來積極影響[14]。

在紅葡萄酒的發(fā)酵過程中，葡萄酒的顏色是不斷變化的。在發(fā)酵初期葡萄酒的顏色淺，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄皮中不斷有色素被浸漬進(jìn)入葡萄汁，因此葡萄酒的顏色不斷的加深，但在葡萄酒的發(fā)酵過程中各參數(shù)的趨勢不同。葡萄酒的色度、a*值，飽和度C*是先上升，在第3天達(dá)到最大值后稍微緩慢下降，b*值先上升后下降達(dá)到最低值后再上升。色調(diào)和L*值先下降，達(dá)到最低值后再上升。

在添加甘露糖蛋白MP60的葡萄酒中，發(fā)酵過程中的色度比對照高，因此添加甘露糖蛋白有助于葡萄酒色度的提高，同時提高a*值和飽和度C*值。亮度L*值比對照低，L*值與葡萄酒的顏色呈反比，因此添加MP60有助于加深葡萄酒的顏色。酒精發(fā)酵結(jié)束后，添加甘露糖蛋白的葡萄酒色度、飽和度C*顯著高于對照，L*值顯著低于對照，顏色更深；兩個葡萄酒之間的色差ΔE*為5.02，存在明顯差異。因此，添加甘露糖蛋白能提高葡萄酒的顏色。

對于葡萄酒中酚類等物質(zhì)的影響，添加甘露糖蛋白的酒樣中總酸、pH、單寧、總酚、單體花色苷、聚合花色苷等指標(biāo)均無顯著影響，但輔色素化花色苷的含量顯著高于對照酒樣，因此表明甘露糖蛋白與花色苷之間的相互作用有助于花色苷的輔色素化，從而穩(wěn)定葡萄酒的顏色。

[1] KLIS F M, MOLP, HELLINGWERF K, et al. Dynamics of cell wall structure inSaccharomyces cerevisiae[J]. Fems Microbiology Reviews, 2002, 26(3): 239-256.

[2] RODRIGUES A, RICARDO-DA-SILVA J M, LUCAS C, et al.Effect of commercial mannoproteins on wine colour and tannins stability[J]. Food Chemistry, 2012, 131(3): 907-914.

[3] GUADALUPE Z, AYESTARAN B. Effect of commercial mannoprotein addition on polysaccharide, polyphenolic, and color composition in red wines[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(19): 9022-9029.

[4] ISABELLE V S, DUPIN, BRETT M M, et al.Saccharomyces cerevisiaemannoproteins that protect wine from protein haze:their release during fermentation and lees contact and a proposal for their mechanism of action[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(8): 3098-3105.

[5] CARIDI A, GALVANO F, TAFURI A, et al. Ochratoxin a removal during winemaking[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006,40(1), 122-126.

[6] CHALIER P, ANGOT B, DELTEIL D, et al. Interactions between aroma compounds and whole mannoprotein isolated fromSaccharomyces cerevisiaestrains[J]. Food Chemistry, 2007,100(1): 22-30.

[7] 周攀, 周元. 甘露糖蛋白對葡萄酒穩(wěn)定性的影響[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2011(7): 57-59.

[8] 王華, 丁剛, 崔福君. 葡萄酒中花色素苷研究現(xiàn)狀[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2002(2): 25-29.

[9] 王宏, 陳曉藝, 張軍翔. 賀蘭山東麓年輕紅葡萄酒的CIELab顏色空間特征[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(9): 20-23.

[10] AYALA F, ECHAVARRI J F, NEGUERUELA A I. A new simplified method for measuring the color of wines. I. Red and rose wines[J]. American Journal of Enology and Viticulture,1997, 48(3): 357-363.

[11] PéREZ-CABALLERO V, AYALA F, ECHáVARRI J F, et al.Proposal for a new standard OIV method for determination of chromatic characteristics of wine[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2003, 54: 59-62.

[12] CLIFF M A, KING M C, SCHLOSSER J. Anthocyanin,phenolic composition, colour measurement and sensory analysis of BC commercial red wines[J]. Food Research International,2007, 40(1): 92-100.

[13] GUADALUPE Z, PALACIOS A, AYESTARAN B. Maceration enzymes and mannoproteins: a possible strategy to increase colloidal stability and color extraction in red wines[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(12): 4854-4862.

[14] GUADALUPE Z, MARTíNEZ L, AYESTARáN B. Yeast mannoproteins in red winemaking: effect on polysaccharide,polyphenolic and color composition[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2010, 61(19): 191-200.