，翠娥，

(安徽工程大學(xué) 紡織服裝學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

固定化酶的催化活性與載體的性質(zhì)密切相關(guān)，優(yōu)良的載體一方面可提高酶的固載量，另一方面也可保持酶的活性[1-2]，因此構(gòu)建合適的載體是酶固定化的重要環(huán)節(jié).目前常用固定酶的載體有納米金屬材料、磁性納米材料、多孔納米材料等[3-4].其中，電紡絲納米纖維是酶固定良好的載體之一，其優(yōu)點(diǎn)包括：巨大的比表面積和富含功能性反應(yīng)基團(tuán)有利于酶固載量的提高；通過(guò)對(duì)納米纖維的改性可以防止酶構(gòu)象的扭曲以保證酶處于高活性構(gòu)象狀態(tài)；方便回收利用.目前報(bào)道的用于固定脂肪酶的電紡絲納米纖維在固載量和生物相容性兩方面仍較難實(shí)現(xiàn)完美統(tǒng)一[5].

果膠是一種非淀粉多糖類的可溶性膳食纖維,無(wú)毒、生物可降解、來(lái)源廣泛[6]，此外，果膠能有效減少蛋白的凝固沉淀，在一定 pH、溫度變化內(nèi)保護(hù)酪蛋白，且表面有大量功能性基團(tuán)[7-8]，可大量固定酶分子.綜上，基于靜電紡絲技術(shù)制備甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸(PMMA-co-PAA)共聚電紡絲納米纖維，并用果膠對(duì)納米纖維表面進(jìn)行改性，利用果膠的生物相容性為脂肪酶提供良好的生物環(huán)境，果膠的親水性能為脂肪酶提供微水體系，有效維持酶在復(fù)雜環(huán)境下的穩(wěn)定性，此外，果膠側(cè)鏈有大量功能性基團(tuán)，可有效固定脂肪酶，提高酶的固載量.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

丙烯酸(CP，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；甲基丙烯酸甲酯(98%,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(AR,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；偶氮二異丁氰(CP,阿拉丁試劑上海有限公司)；鋁箔(東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；亮藍(lán)G250(上海瀚思化工有限公司)；磷酸(88%,無(wú)錫市亞盛化工有限公司)；無(wú)水乙醇(AR,無(wú)錫市亞盛化工有限公司)；聚乙二醇1788(AR,阿拉丁試劑上海有限公司)；橄欖油(CP,阿拉丁試劑上海有限公司)；氯化鈉、氯化鉀(AR,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(AR,無(wú)錫市亞盛化工有限公司)；果膠(98%,阿拉丁試劑上海有限公司)；南極假絲酵母脂肪酶B(6%,杭州創(chuàng)科生物科技有限公司);蒸餾水，自制.

JZB-1800D雙道注射泵(費(fèi)森尤斯卡比健源(長(zhǎng)沙)醫(yī)療科技有限公司)；JSM-7500F掃描電子顯微鏡(SEM)(日本電子株式會(huì)社)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司)；PHS-3CpH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；EA2004N電子天平(常州市衡正電子儀器有限公司)；DSA-25型視屏光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x(德國(guó)Dataphysics公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

(1)納米纖維的制備.①PMMA-co-PAA共聚物制備.通過(guò)溶液聚合法制備PMMA-co-PAA.取32 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)于錐形瓶中，加入1.1 mL丙烯酸(AA)，14 mL甲基丙烯酸甲酯(MMA)及0.076 g偶氮二異丁腈(AIBN)，通入氮?dú)?，?0 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h后加入8 mL DMF，0.076 g AIBN，0.55 mL AA繼續(xù)反應(yīng)，2 h后再加入8 mL DMF，0.076 g AIBN，0.55 mL AA，反應(yīng)20 h后取出，用丙酮稀釋，加入石油醚，過(guò)濾取沉淀，將沉淀真空干燥至恒重.②基于靜電紡絲技術(shù)制備PMMA-co-PAA納米纖維.將上述制備的PMMA-co-PAA聚合物用DMF配置成11%的紡絲液前驅(qū)體，將配制好的前驅(qū)體溶液移入注射器中，設(shè)置進(jìn)樣速度為0.3 mL/h，紡絲間距為14 cm，針頭接入正極，鋁箔接入負(fù)極，調(diào)節(jié)電壓為18 kV且恒定，滾筒速度100 r/min.PMMA-co-PAA共聚反應(yīng)如圖1所示.

圖1 PMMA-co-PAA共聚反應(yīng)

(2)納米纖維膜活化．取一定量PMMA-co-PAA納米纖維膜，分別用蒸餾水和磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.05 M，pH 7.0)沖洗.將清洗過(guò)的納米纖維膜放入含有一定EDC/NHS(EDC和NHS的摩爾比為1∶1)的PBS中反應(yīng)活化，在25 ℃水浴中浸泡1 h后取出.活化的納米纖維膜用大量PBS沖洗，以除去表面粘附的活化劑.將納米纖維膜自然風(fēng)干保存?zhèn)溆?

(3)果膠改性膜材料.配置不同質(zhì)量濃度的果膠溶液，與活化過(guò)的膜放入水浴鍋中震蕩2 h，取出后用PBS反復(fù)沖洗，以除去表面粘附的殘留果膠，將活化的膜晾干保存?zhèn)溆?

(4)固定酶.配制脂肪酶溶液(酶溶液與PBS溶液體積比為2∶3)，將表面活化的PMMA-co-PAA與PMMA-co-PAA@果膠納米纖維膜浸入酶溶液中，于25 ℃水浴中振蕩反應(yīng)18 h.將膜取出，用大量PBS沖洗，以除去表面附著的酶液.將固定化酶膜吸干，于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.3 測(cè)試與表征

(1)酶固載量的測(cè)定.酶溶液和清洗液中的酶蛋白量用Bradford法測(cè)定[9]，固定到載體上的酶蛋白量可以用下面的公式計(jì)算:

×100%

式中,Ae是固定酶蛋白量(mg/g)；C0和C分別是反應(yīng)液中起始和固定化后的酶質(zhì)量濃度(mg/mL)；V是反應(yīng)液的體積(mL)；W是載體的質(zhì)量(g)；數(shù)據(jù)是3次測(cè)定值所得的平均值.

(2)酶活的測(cè)定.根據(jù)GB/T 23535-2009測(cè)量酶活[10].酶活可以用下面的公式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖2 PMMA-co-PAA紅外光譜

PMMA-co-PAA的紅外光譜圖如圖2所示.由圖2可以明顯看出，1 736 cm-1處是酯羰基的伸縮振動(dòng)峰，1 710 cm-1處是羧酸羰基的伸縮振動(dòng)峰，這兩個(gè)峰有重疊；3 400 cm-1處是羧酸中羥基的伸縮振動(dòng)峰，表明聚合物中酯和羧酸同時(shí)存在；而2 986 cm-1，2 932 cm-1，2 843 cm-1處是甲基和亞甲基的伸縮振動(dòng)峰.紅外圖譜表明聚合物是PMMA-co-PAA.

2.2 掃描電鏡分析

納米纖維果膠改性前后的電鏡照片如圖3所示.從圖3中可以看出，PMMA-co-PAA納米纖維的直徑在400～600 nm左右.修飾果膠后纖維的直徑增加到500～700 nm，這是因?yàn)樵诶w維表面接枝了一層果膠，果膠本身為線型多糖聚合物，經(jīng)果膠修飾后，纖維的質(zhì)地也變得柔軟，固定酶之后，纖維的直徑進(jìn)一步增加到700～900 nm左右.另外，從圖3中可以明顯地看到納米纖維表面變得粗糙.

圖3 納米纖維的掃描電鏡圖

2.3 靜態(tài)接觸角分析

果膠質(zhì)量濃度對(duì)材料親水性能的影響如表1所示.納米纖維的靜態(tài)接觸角如圖4所示.從表1及圖4可知，修飾果膠前后納米纖維的親水性能發(fā)生顯著變化，修飾之前的PMMA-co-PAA納米纖維接觸角為103.7°(見(jiàn)圖4a)，表現(xiàn)出明顯的疏水性能；修飾有果膠之后，PMMA-co-PAA@果膠的靜態(tài)接觸角明顯降低(見(jiàn)圖4b)，呈現(xiàn)優(yōu)良的親水性能.繼續(xù)提高果膠質(zhì)量濃度會(huì)提高材料的親水性能，但影響并不大，可能是因?yàn)镻MMA-co-PAA纖維為良好的疏水性材料，當(dāng)在其表面裹覆一層果膠后，果膠表面大量的親水基團(tuán)賦予了纖維較好的親水性，降低了其靜態(tài)接觸角，極大地改善了其親水性，繼續(xù)增加果膠質(zhì)量濃度不能明顯地改變其親水性.較好的親水性可以為脂肪酶提供良好的微水環(huán)境，有利于脂肪酶保持較高的活性.

表1 果膠質(zhì)量濃度對(duì)材料親水性能的影響

圖4 納米纖維的靜態(tài)接觸角

2.4 載酶量測(cè)定

果膠質(zhì)量濃度對(duì)酶載量的影響如圖5所示.由圖5可看出，未經(jīng)果膠改性的納米纖維對(duì)酶的固載量為83 mg/g，經(jīng)果膠改性后，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度從0.1 mg/mL升高到0.15 mg/mL時(shí)，酶的固載量從114 mg/g增加到150 mg/g.未經(jīng)果膠改性的納米纖維表面功能基團(tuán)較少，難以大量地固載脂肪酶.經(jīng)果膠改性后，隨著果膠質(zhì)量濃度的增加，使得固定酶的功能基團(tuán)增加，導(dǎo)致酶的固載量提高.繼續(xù)增加果膠的質(zhì)量濃度，酶的固載量反而下降，這可能是由于果膠質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，使得表面的空間位阻顯著增加，另外，當(dāng)果膠在纖維膜上的密度增加，其側(cè)鏈上羥基距離變小，羥基之間容易形成氫鍵，降低了羥基的反應(yīng)性能.

2.5 固定化酶的穩(wěn)定性研究

(1)不同pH下改性前后納米纖維固定化酶相對(duì)酶活的比較.不同pH下改性前后納米纖維固定化酶相對(duì)酶活的比較如圖6所示.由圖6可以看出，經(jīng)改性后的PMMA-co-PAA納米纖維其pH穩(wěn)定性有了顯著地增強(qiáng).pH為5時(shí)，改性前后納米纖維的相對(duì)酶活均較高，基本都能維持在70%以上，PMMA-co-PAA@果膠納米纖維的相對(duì)酶活略高于PMMA-co-PAA納米纖維；在pH為7時(shí)，相對(duì)酶活最大；當(dāng)pH逐漸升高時(shí)，相對(duì)酶活都呈下降趨勢(shì)；在pH為9時(shí)，PMMA-co-PAA固定化酶相對(duì)酶活降至30%，而PMMA-co-PAA@果膠固定化酶相對(duì)酶活仍保持在65%左右，可能是由于果膠為生物酶提供了良好的生物環(huán)境，果膠表面的大量親水性基團(tuán)可以在相對(duì)苛刻的條件下繼續(xù)維持脂肪酶生存的微水環(huán)境，相比固定于PMMA-co-PAA上的脂肪酶而言，固定于PMMA-co-PAA@果膠上的脂肪酶處于更優(yōu)的生存環(huán)境.因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說(shuō)明果膠改性納米纖維有利于提升固定化酶的pH穩(wěn)定性.

圖5 果膠質(zhì)量濃度對(duì)酶載量的影響圖6 不同pH下改性前后納米纖維固定化酶相對(duì)酶活的比較

(2)不同溫度下改性前后納米纖維固定化酶相對(duì)酶活的比較.不同溫度下改性前后納米纖維固定化酶相對(duì)酶活的比較如圖7所示.由圖7可以看出，30 ℃時(shí)固定化酶的相對(duì)酶活最高.在較低的溫度下，如20 ℃時(shí)的相對(duì)酶活均保持在70%左右，這可能是因?yàn)檩^低溫度下，酶的構(gòu)象變化比較慢，催化活性較低.溫度升高到40 ℃時(shí)，改性前后納米纖維固定化酶的相對(duì)酶活都保持在80%左右，進(jìn)一步提高溫度，固定于PMMA-co-PAA上的脂肪酶迅速失活，60 ℃時(shí)的相對(duì)酶活僅保持45%，這可能是因?yàn)檩^高溫度下，酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞；同樣溫度下，固定于PMMA-co-PAA@果膠上的脂肪酶相對(duì)酶活能保持78%，生物相容性載體的存在有效地保護(hù)了脂肪酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得脂肪酶在較高溫度下也能維持較高的活性.這使得脂肪酶有望應(yīng)用于較高溫度下的催化，拓展了酶的催化范圍.

(3)50 ℃下改性前后納米纖維固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性的比較．50 ℃時(shí)改性前后納米纖維固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性的比較如圖8所示.由圖8可以看出，固定于PMMA-co-PAA@果膠上的脂肪酶處于較優(yōu)的生存環(huán)境，因此其儲(chǔ)存穩(wěn)定性也會(huì)有所增強(qiáng).隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶的相對(duì)酶活都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，10 h后，固定在PMMA-co-PAA的脂肪酶相對(duì)酶活剩余20%，相比未改性的納米纖維，固定在PMMA-co-PAA@果膠的脂肪酶的穩(wěn)定性能有顯著提高.同樣時(shí)間長(zhǎng)度下，脂肪酶的相對(duì)酶活保持在73%，這使得脂肪酶有望在較高溫度下實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間催化，增加催化效果.

圖7 不同溫度下改性前后納米纖維固定化酶相對(duì)酶活的比較 圖8 50 ℃時(shí)改性前后納米纖維固定化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性的比較

3 結(jié)論

基于靜電紡絲制備穩(wěn)定均一的PMMA-co-PAA納米纖維，經(jīng)果膠改性后得到生物相容性較好，且表面有大量功能性基團(tuán)的納米纖維，有效地提高了酶的固載量與穩(wěn)定性，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度在0.15 mg/mL時(shí)，固定化酶的酶載量最大，可達(dá)150 mg/g.該改性纖維有效克服了聚合物纖維生物相容性差的缺點(diǎn)，脂肪酶經(jīng)過(guò)固定于改性納米纖維之后，其pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性和較高溫度下的儲(chǔ)存穩(wěn)定性都有顯著提高.同時(shí)，載體的制備簡(jiǎn)單方便、成本低、重復(fù)性好，因此，酶的固定有望進(jìn)一步提高其催化性能，拓展其催化范圍.

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