李海東 張艷艷 康濤 陳建生 張利民 任志紅 李文金

摘要：以花生品種山花108為材料，探討了5個(gè)施氮水平N0（不施氮，CK）、N37.5（施純氮37.5 kg/hm2，下同）、N75、N112.5、N150對(duì)花生葉片活性氧產(chǎn)生途徑米勒反應(yīng)和光呼吸、H2O2含量、葉片衰老、葉斑病發(fā)生程度及產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，隨著施氮量的增加，在N0到N75處理范圍內(nèi)，米勒反應(yīng)、光呼吸、H2O2含量、葉片衰老和葉斑病發(fā)生呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，而產(chǎn)量呈升高趨勢(shì)；在N75到N150處理范圍內(nèi)，產(chǎn)量呈降低趨勢(shì)，以上其它指標(biāo)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。施氮量可通過調(diào)控活性氧的清除和產(chǎn)生對(duì)花生衰老和葉斑病的發(fā)生以及產(chǎn)量進(jìn)行影響。

關(guān)鍵詞：花生；衰老；葉斑??；活性氧；光呼吸；米勒反應(yīng)

中圖分類號(hào)：S565.201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）02-0093-05

Abstract The effects of different nitrogen application rates on the Mehler reaction， photorespiration， H2O2 content， leaf senescence， incidence of leaf spot disease and yield were studied with the peanut cultivar Shanhua 108 as material. Five nitrogen application rates were designed as no nitrogen （N0）， 37.5 kg/hm2 （N37.5）， 75.0 kg/hm2 （N75.0）， 112.5 kg/hm2 （N112.5） and 150.0 kg/hm2 （N150）. The results showed that in the range of 0～75 kg/hm2， the Mehler reaction， photorespiration， H2O2 content， leaf senescence and incidence of leaf spot disease decreased， while the yield increased with the increase of nitrogen application rates.But in the range of 75～150 kg/hm2， the yield decreased while the other characters increased.In conclusion， nitrogen application rate regulated the peanut senescence，incidence of leaf spot disease and yield via affecting both the elimination and generation of reactive oxygen species （ROS）.

Keywords Peanut； Senescence； Leaf spot disease； ROS； Photorespiration； Mehler reaction

花生是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物。前人研究表明，花生生育后期的衰老是導(dǎo)致其產(chǎn)量下降的重要原因，延緩衰老可以提高花生產(chǎn)量[1，2]?；ㄉ笃诎l(fā)生的葉斑病是花生生產(chǎn)中最普遍、危害最大的病害，是產(chǎn)量下降的另一重要因素，一般使花生減產(chǎn)10%～20%[3，4]。

植物的衰老是一種程序化死亡過程[5，6]，受多種信號(hào)分子的調(diào)控，如活性氧、Ca2+、一氧化氮和多胺等[7-10]。葉斑病的發(fā)生也需要眾多信號(hào)分子的調(diào)控，包括Ca2+、活性氧和水楊酸等[11-14]?；钚匝跫饶苷{(diào)控葉片的衰老，也能調(diào)控葉斑病的發(fā)生。光合作用中的光呼吸和米勒反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧占葉片產(chǎn)生活性氧的絕大部分[15]，其中光呼吸在過氧化物體中產(chǎn)生H2O2[16]，米勒反應(yīng)產(chǎn)生O·-2，O·-2受SOD的作用轉(zhuǎn)化為H2O2[17]。研究光合機(jī)構(gòu)活性氧的產(chǎn)生與花生衰老、葉斑病發(fā)生的關(guān)系具有重要理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

施氮量會(huì)影響花生的衰老[1]，而葉斑病往往和衰老同時(shí)發(fā)生[2]，但是由于測(cè)定方法的限制，前人對(duì)活性氧的清除研究較多，對(duì)活性氧的產(chǎn)生過程米勒反應(yīng)和光呼吸的變化了解較少。

本試驗(yàn)采用較成熟的氣體交換和熒光方法，測(cè)定米勒反應(yīng)和光呼吸，為延緩花生衰老和降低葉斑病發(fā)生的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016年在泰安市邱家店試驗(yàn)站進(jìn)行，供試土壤為中壤土，土壤肥力為有機(jī)質(zhì)含量17.2 g/kg，全氮 1.2 g/kg，堿解氮 110.1 mg/kg，速效磷 35.2 mg/kg，速效鉀 103.5 mg/kg。

供試材料為花生品種山花108。設(shè)置5個(gè)施氮水平：N0（不施氮肥，CK）、N37.5（施純氮37.5 kg/hm2，下同）、N75、N112.5、N150，磷（P2O5 120 kg/hm2）、鉀（K2O 150 kg/hm2）用量相同。隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次，小區(qū)面積13.3 m2。6月10日麥?zhǔn)蘸筚N茬種植花生，666.7m2種植密度為9 000穴 ，每穴2粒。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

分別于播種后27、47、81、96、111 d取樣，測(cè)定葉片H2O2含量，SOD、CAT、APX 活性，葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量，于上午9∶00—11∶00測(cè)定米勒反應(yīng)和光呼吸速率，播種后96、111 d測(cè)定葉斑病的病級(jí)，于收獲期（播種后120 d）以小區(qū)為單位收獲，自然風(fēng)干，測(cè)定花生莢果產(chǎn)量。

過氧化氫含量、CAT活性和MDA含量參照趙世杰等[18]的方法測(cè)定，SOD參照王愛國(guó)等[19]的方法，APX活性參照Nakano等[20]的方法測(cè)定。

米勒反應(yīng)以Miyake等[17]的方法進(jìn)行測(cè)算。根據(jù)公式Je=PFD×ΦPSII×α計(jì)算總電子流Je，其中α=4×（Pn+Rd）/（PFD×ΦPSII）；碳代謝的電子流（Jg）根據(jù)公式Jg=（Pn+Rd）×（4Ci + 8Γ）/（Ci-Γ）測(cè)定，其中Rd為暗呼吸速率，Γ為CO2補(bǔ)償點(diǎn)。額外電子流（Ja）根據(jù)公式Ja=Je-Jg計(jì)算。通過光合儀與熒光儀聯(lián)用分別測(cè)定和計(jì)算出大氣條件（21% O2，360 μmol/mol CO2）與自配低氧氣體（2% O2，360 μmol/mol CO2）條件下的Ja和Ja′，根據(jù)下式計(jì)算米勒反應(yīng)：米勒反應(yīng)=Ja-Ja′。

采用PP-Systems公司生產(chǎn)的Ciras-1便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)分別測(cè)定大氣（21% O2，360 μmol/mol CO2）與自配低氧氣體（2% O2，360 μmol/mol CO2）條件下葉片的光合速率Pn，每次測(cè)定選取3株，重復(fù)3次。計(jì)算光呼吸速率Pr=Pn2-Pn1，式中Pn2為低氧氣體下的Pn，Pn1為大氣條件下的Pn[21]。

病情分級(jí)參照劉風(fēng)珍等[22]的標(biāo)準(zhǔn)，小區(qū)內(nèi)單株病級(jí)加權(quán)平均為小區(qū)病級(jí)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2007和DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮量對(duì)花生葉片H2O2含量、米勒反應(yīng)和光呼吸的影響

圖1A顯示，隨著花生生育期的推進(jìn)，葉片H2O2含量呈增加趨勢(shì)。在播種后27 d不同氮處理的H2O2含量差異不顯著，到生育期后期差異逐漸明顯。施氮75 kg/hm2處理葉片產(chǎn)生的H2O2含量最少，施氮量增加或減小都會(huì)導(dǎo)致葉片H2O2含量的增加，比如在播種后111 d，N0、N37.5、N112.5和N150處理葉片的H2O2含量分別是N75處理的1.89、1.29、1.22倍和1.63倍。

圖1B顯示，在整個(gè)生育期內(nèi)，米勒反應(yīng)呈增加趨勢(shì)，播種后111 d米勒反應(yīng)的大小為播種后27 d的4～9倍。在生育期初期，不同施氮處理的米勒反應(yīng)差異并不明顯，至生育期后期，差異逐漸顯著。在播種后111 d時(shí)，當(dāng)施氮量小于75 kg/hm2時(shí)，米勒反應(yīng)表現(xiàn)為N75N112.5>N75，表明在此范圍內(nèi)，隨著施氮量的增加，米勒反應(yīng)呈增加趨勢(shì)。

圖1C顯示，在整個(gè)生育期內(nèi)，光呼吸速率呈增加趨勢(shì)，至播種后111 d，光呼吸速率為播種后27 d的2～4倍。在播種后111 d，N75處理下的光呼吸速率最小，在N0到N75處理范圍內(nèi)，隨著施氮量的增加，光呼吸速率呈減小趨勢(shì)，在N75到N150處理范圍內(nèi)，隨著施氮量的增加，光呼吸速率呈增加趨勢(shì)。

2.2 不同施氮量對(duì)花生葉片抗氧化酶活性的影響

圖2A顯示，在花生整個(gè)生育期內(nèi)，SOD活性的最大值出現(xiàn)在播種后81 d，呈現(xiàn)出單峰曲線變化趨勢(shì)。N75處理SOD活性處于最高位置，施氮量增加或減少都會(huì)導(dǎo)致SOD活性的降低。

圖2B顯示，在整個(gè)生育期內(nèi)，CAT活性的最大值出現(xiàn)在播種后47 d，為單峰曲線。在N0到N75處理范圍內(nèi)，隨著施氮量的增加，CAT活性呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，在N75到N150處理范圍內(nèi)，隨著施氮量的增加，CAT活性呈下降趨勢(shì)。

圖2C顯示，隨著生育期的推進(jìn)，APX活性呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在播后81 d。隨著施氮量的增加，APX活性的變化趨勢(shì)與SOD一致。

2.3 不同施氮量對(duì)花生葉片MDA含量的影響

MDA含量高低代表膜脂過氧化程度，是植物衰老的重要指標(biāo)。隨著生育期的推進(jìn)，MDA含量呈增加趨勢(shì)，但是在不同施氮量處理中，N75處理下的MDA含量一直最低（圖3），顯示N75處理膜脂過氧化程度最輕，最有利于延緩花生的衰老。

2.4 不同施氮量對(duì)花生生育后期葉斑病發(fā)病程度的影響

由圖4看出，花生生育后期葉斑病呈增加趨勢(shì)，隨著施氮量的增加，在N0至N75處理范圍內(nèi)，葉斑病發(fā)生呈降低趨勢(shì)，在N75至N150處理范圍內(nèi)，葉斑病發(fā)生呈上升趨勢(shì)。

2.5 不同施氮量對(duì)花生產(chǎn)量的影響

圖5顯示，隨著施氮量的增加，花生產(chǎn)量呈現(xiàn)出先增高后下降的趨勢(shì)，其中以N75處理花生莢果產(chǎn)量最高，達(dá)5 882.63 kg/hm2。以上結(jié)果表明，適宜的施氮量可以抑制活性氧的產(chǎn)生，提高花生產(chǎn)量。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在整個(gè)生育期中，光呼吸速率和米勒反應(yīng)均呈增加趨勢(shì)，表明活性氧一直在增加?？寡趸富钚砸话銜?huì)隨著活性氧的增多呈現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)[23-25]，但在本試驗(yàn)中，SOD活性和APX活性在播種后81 d出現(xiàn)峰值，CAT活性在播種后47 d出現(xiàn)峰值，表明抗氧化酶活性在生育后期并沒有隨活性氧的增多而增加，這勢(shì)必會(huì)進(jìn)一步造成活性氧含量的增大，圖1A中H2O2含量變化也證實(shí)了這一點(diǎn)?；钚匝醯脑龆嗫梢允辜?xì)胞膜受到傷害，本試驗(yàn)中MDA含量的變化也印證了這一事實(shí)，而細(xì)胞膜的傷害是細(xì)胞衰老的重要指標(biāo)[26，27]。以上結(jié)果顯示，在花生葉片中，活性氧（米勒反應(yīng)和光呼吸）的增多以及抗氧化酶活性的降低共同導(dǎo)致了花生葉片的衰老。而施氮量調(diào)控著活性氧的產(chǎn)生和清除，在施氮量為75 kg/hm2時(shí)，米勒反應(yīng)和光呼吸速率最小而活性氧清除酶活性最高，MDA含量最低，衰老最緩慢，產(chǎn)量也最高。

葉斑病是花生生育后期普遍發(fā)生的一種病害[3，4]，但是關(guān)于施氮量與葉斑病發(fā)生的研究較少。本研究顯示，適宜的施氮量（75 kg/hm2）可以顯著抑制花生葉斑病的發(fā)生，而施氮量的增多或減少都會(huì)不同程度地加重葉斑病的發(fā)生。鑒于活性氧是調(diào)控葉斑病發(fā)生的重要信號(hào)分子，我們推測(cè)施氮量很可能通過調(diào)控活性氧的產(chǎn)生和清除來(lái)調(diào)控葉斑病的發(fā)生，從而使葉斑病的發(fā)生與花生葉片的衰老具有同一變化趨勢(shì)。但是施氮量通過何種信號(hào)途徑影響到抗氧化酶的活性、米勒反應(yīng)和光呼吸的大小還需要進(jìn)一步研究。

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