鄭紅艷, 王 磊

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)且抗逆性強(qiáng)的農(nóng)作物品種一直是育種家追求的育種目標(biāo)，而傳統(tǒng)育種方法具有育種周期長(zhǎng)、選育針對(duì)性差等缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)快速育種的目標(biāo)。CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)是近年來發(fā)展起來的對(duì)基因組進(jìn)行精準(zhǔn)定點(diǎn)編輯的技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，利用該技術(shù)可以對(duì)基因組中的目的基因進(jìn)行定向敲除、插入或定點(diǎn)突變，從而精確引入目標(biāo)性狀，為作物育種工作提供新的途徑。

1 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介及發(fā)展

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)(genome editing)是植物基因功能研究和育種改良的熱點(diǎn)技術(shù)，其由小分子RNA介導(dǎo)，且主要依賴于核酸內(nèi)切酶在目標(biāo)位置產(chǎn)生雙鏈斷裂(double strand breaks, DSBs)，DSBs可以通過非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HDR)兩種方式進(jìn)行修復(fù)，通過NHEJ的修復(fù)容易發(fā)生錯(cuò)誤，使斷裂位置產(chǎn)生小片段的缺失或插入，從而導(dǎo)致基因突變；在有供體DNA存在的情況下，有可能通過HDR進(jìn)行斷裂位置的修復(fù)，產(chǎn)生精準(zhǔn)的基因插入或替換。

CRISPR-Cas系統(tǒng)包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種類型，其中Ⅰ型和Ⅲ型需要多種蛋白參與才能形成具有功能的Cas蛋白復(fù)合體[1]，而來自于化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Ⅱ型系統(tǒng)僅需要一種Cas蛋白就能夠發(fā)揮作用[2]。在Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)中，入侵的外源核酸序列整合到前導(dǎo)序列與第一段重復(fù)序列之間，并轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)鏈的CRISPR RNAs(crRNA)前體物，與反式激活tracrRNA(trans-activating crRNA)互補(bǔ)結(jié)合，然后在Cas9/RNAseⅢ加工下形成成熟的tracrRNA: crRNA復(fù)合物，通過crRNA與入侵DNA上原間隔序列互補(bǔ)配對(duì)，從而激活并誘導(dǎo)Cas9蛋白到原間隔序列的區(qū)域進(jìn)行剪切，該過程需要在靶標(biāo)DNA上有一段保守的PAM(protospacer adjacent motif)序列。Cas9蛋白包括兩個(gè)區(qū)域，其中HNH結(jié)構(gòu)域切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，RuvC-like域則剪切非互補(bǔ)的DNA鏈，從而形成DSBs，降解入侵片段[1]?？茖W(xué)家利用上述原理，通過將crRNA和tracrRNA序列相連構(gòu)成一個(gè)嵌合的sgRNA(small guide RNA)分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別，并利用Cas蛋白進(jìn)行定點(diǎn)剪切形成DSBs，隨后通過體內(nèi)NHEJ或HDR方式進(jìn)行修復(fù)[3]。近來，新一代CRISPR基因編輯工具CRISPR/Cpf1、單堿基突變及無外源DNA污染編輯的出現(xiàn)，標(biāo)志著CRISPR基因編輯技術(shù)又取得了突破性進(jìn)展。

1.1 新一代CRISPR基因編輯工具CRISPR/Cpf1

2015年，張鋒團(tuán)隊(duì)首先發(fā)現(xiàn)了Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)第5亞家族的成員Cpf1核酸內(nèi)切酶，并證實(shí)了來自氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、弗朗西斯氏菌屬(Franisellanovicida)和毛螺科菌屬(Lachnospiraceae)的AsCpf1、LbCpf1和FnCpf1都具有RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶活性，且AsCpf1和LbCpf1用于動(dòng)物的基因組編輯效率與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相似，但其與Cas9相比卻具有更多優(yōu)勢(shì)：①Cpf1蛋白因更小而更容易進(jìn)入組織和細(xì)胞；②Cpf1同時(shí)具有DNA和RNA內(nèi)切酶活性；③Cpf1的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pre-crRNA由Cpf1自身加工，不需要tracrRNA的參與；④Cpf1識(shí)別位于靶序列5′端富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列，擴(kuò)大了基因組編輯的靶點(diǎn)范圍；⑤Cpf1的切割位點(diǎn)離PAM序列較遠(yuǎn)，便于對(duì)同一位點(diǎn)進(jìn)行多輪基因編輯；⑥Cpf1剪切后形成黏性末端，讓DNA插入更可控。目前CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)已被用于水稻、擬南芥等物種的基因組編輯，朱健康團(tuán)隊(duì)[4]利用該技術(shù)對(duì)水稻中RLK和CYP81A家族的4個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)編輯，各位點(diǎn)的敲除效率達(dá)到40%～75%。近期，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所夏蘭琴團(tuán)隊(duì)與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙云德團(tuán)隊(duì)合作，利用能夠識(shí)別“TYCV”序列的LbCpf1(RR)和LbCpf1(RVR)變體，以水稻OsPDS和OsSBEIIb基因?yàn)榘袠?biāo)基因，LbCpf1(RR)編輯效率達(dá)51%左右，該研究擴(kuò)展了CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在植物基因組中的編輯范圍[5]。

1.2 單堿基突變編輯

在農(nóng)作物遺傳改良方面，少部分可以通過完全破壞基因功能來獲得育種材料，但更多的是需要置換單個(gè)或數(shù)個(gè)堿基來改變基因的功能，從而實(shí)現(xiàn)定向改良作物農(nóng)藝性狀的目的，而利用CRISPR/Cas9定點(diǎn)修飾主要是依賴于效率低下的同源重組機(jī)制。2016年，哈佛大學(xué)David Liu團(tuán)隊(duì)[6]發(fā)現(xiàn)了一種新的基因編輯工具——單堿基編輯系統(tǒng)。單堿基編輯技術(shù)通過將Cas9切口酶(Cas9 nikase, Cas9n)或無核酸酶活性的Cas9(nuclease dead Cas9, dCas9)與胞嘧啶脫氨酶(APOBEC1)形成融合蛋白，并通過sgRNA(單鏈向?qū)NA)將融合蛋白引導(dǎo)至靶位點(diǎn)，在不引起DNA雙鏈斷裂的情況下對(duì)靶位點(diǎn)附近的單個(gè)堿基進(jìn)行由C/G到T/A的精確置換，目前該技術(shù)已在植物、動(dòng)物以及人細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效的定點(diǎn)突變。朱健康團(tuán)隊(duì)[7]利用單堿基編輯系統(tǒng)APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)，率先實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族NRT1.1B和DELLA家族SLR1的堿基替換，隨后高彩霞團(tuán)隊(duì)[8]通過改進(jìn)，成功地將此系統(tǒng)運(yùn)用到三大重要農(nóng)作物小麥、水稻和玉米的性狀改良上，為作物品種改良帶來了新的途徑。

1.3 無外源DNA污染編輯

目前常用的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)主要是通過基因槍或農(nóng)桿菌侵染的方法將DNA表達(dá)框整合到植物基因組中，此種方法一般需通過后代分離才能獲得無CRISPR/Cas9 DNA的突變體材料。DNA-free基因組編輯技術(shù)的建立，大大降低了外源DNA的整合率，為CRISPR/Cas9技術(shù)用于農(nóng)作物品種改良提供了新思路。DNA-free基因組編輯是通過將CRISPR/Cas9蛋白與gRNA在體外組裝成核糖蛋白體(RNP)，實(shí)現(xiàn)無外源DNA的基因編輯體系，避免外源DNA整合到基因組中產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)，從而推動(dòng)作物基因編輯育種的發(fā)展。此技術(shù)已經(jīng)在擬南芥、煙草、生菜等模式植物[9]和水稻、玉米、小麥等主要糧食作物[10,11]中得到了成功應(yīng)用。高彩霞團(tuán)隊(duì)[12]以小麥為研究對(duì)象，對(duì)此方法步驟做了詳細(xì)總結(jié)，為其廣泛應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。最近，瑞典科學(xué)家利用RNP方法成功實(shí)現(xiàn)了馬鈴薯的DNA-free基因組編輯，編輯效率達(dá)9%～25%[13]。

2 CRISPR-Cas技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用

自CRISPR/Cas9技術(shù)被用于進(jìn)行基因定點(diǎn)編輯以來，被廣泛應(yīng)用于酵母、果蠅、斑馬魚、小鼠、人類等多個(gè)物種中。2013年8月，《Nature Biotechnology》期刊上同時(shí)刊登了3篇關(guān)于CRSPR-Cas9技術(shù)介導(dǎo)植物基因組定點(diǎn)編輯的文章，預(yù)示著該技術(shù)在植物中的廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。其中Nekrasov等[14]利用CRISPR-Cas技術(shù)在本生煙(Nicotianabenthamiana)中實(shí)現(xiàn)了基因組的定點(diǎn)突變，突變效率約為2%；Li等[15]利用CRSPR-Cas9分別對(duì)擬南芥和本生煙中的PDS基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，在原生質(zhì)體系統(tǒng)中，擬南芥AtPDS和本生煙NbPDS突變效率分別為5.6%和38%，而通過農(nóng)桿菌浸染發(fā)現(xiàn)，在植物中AtPDS和NbPDS的突變效率相差不大(擬南芥為2.7%，本生煙為4.8%)，表明突變效率與植物基因型、生理狀態(tài)和轉(zhuǎn)化方式密切相關(guān)。該研究還在原生質(zhì)體中成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)AtPDS3的兩個(gè)不同位點(diǎn)和同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因(AtRACK1b和AtRACK1c)的編輯，為植物基因編輯打開了新的思路；高彩霞團(tuán)隊(duì)[16]利用基因槍技術(shù)首次在水稻中對(duì)OsPDS和OsBADH2基因進(jìn)行敲除，突變效率分別為9.4%和7.1%，并獲得了T0代PDS基因敲除的水稻純合突變植株。同時(shí)，朱健康團(tuán)隊(duì)[17]也利用CRISPR-Cas9技術(shù)分別在擬南芥和水稻中進(jìn)行基因定點(diǎn)突變，突變效率分別為26%和84%；瞿禮嘉團(tuán)隊(duì)[18]通過對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行優(yōu)化，使該系統(tǒng)在水稻中對(duì)OsCAO1和OsLAZY1基因的編輯效率分別高達(dá)83%和92%。CRISPR/Cas9技術(shù)在植物中，尤其是作物中的成功應(yīng)用，為該技術(shù)在作物品種改良中的應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持，隨后大量相關(guān)研究相繼開展。

2.1 在糧食作物育種中的應(yīng)用

水稻是世界上最為重要的糧食作物之一，并且水稻遺傳轉(zhuǎn)化更易操作，因此近年來利用CRISPR/Cas9技術(shù)開展與水稻產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性相關(guān)的研究被大量報(bào)道。產(chǎn)量方面，王加峰等[19]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)調(diào)控水稻產(chǎn)量千粒重的基因TGW6定點(diǎn)編輯，T0代材料中該基因突變頻率約為90%，其中純合缺失突變率高達(dá)51%，T1代純合缺失突變體千粒重顯著增加。Li等[20]利用CRISPR/Cas9技術(shù)以中花11作為轉(zhuǎn)化材料對(duì)Gn1a、DEP1、GS3及IPA1基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，結(jié)果表明T0代材料中突變效率分別為42.5%、67.5%、57.5%、27.5%，T2代純合缺失突變體中植株籽粒數(shù)目及長(zhǎng)度增加，達(dá)到增產(chǎn)的效果；品質(zhì)方面，中國水稻研究所[21]和東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所[22]同時(shí)采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)控制水稻香味的BADH2基因進(jìn)行敲除，結(jié)果表明突變體材料中香味物質(zhì)顯著增加，為香稻育種提供了豐富的理論指導(dǎo)，加快了香稻的育種進(jìn)程?？剐苑矫?，李家洋與高彩霞團(tuán)隊(duì)[23]利用CRISPR/Cas9技術(shù)以NHEJ修復(fù)方式對(duì)水稻5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)進(jìn)行編輯，實(shí)現(xiàn)了水稻內(nèi)源EPSPS基因保守區(qū)域兩個(gè)重要氨基酸的定點(diǎn)置換，在T0代獲得具有草甘膦抗性的突變體材料。Wang等[24]利用CRISPR/Cas9技術(shù)修飾稻瘟病侵染效應(yīng)因子基因OSERF922，以提高水稻對(duì)稻瘟病的抗性。近期，Tang等與袁隆平團(tuán)隊(duì)[25]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻中與鎘離子吸收和積累相關(guān)的基因，獲得了抗鎘毒害的水稻品種。此外，朱健康研究組[21]利用新型腺嘌呤堿基編輯器ABE7-10對(duì)調(diào)節(jié)水稻株型的OsSPL14和SLR1進(jìn)行單堿基編輯，A/T到G/C的替換效率分別為26%和12.5%，該研究推動(dòng)了作物精準(zhǔn)分子育種的發(fā)展。

玉米不僅是世界第一大糧食作物之一，也是飼料、化工和醫(yī)用等的原料。朱金潔等[26]經(jīng)過摸索，搭建了玉米基因組高效定點(diǎn)突變的技術(shù)平臺(tái)，并在玉米全基因組范圍內(nèi)篩選高度特異的sgRNA靶標(biāo)序列，為玉米品種改良提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。杜邦先鋒公司利用CRISPR-Cas9技術(shù)，將自然存在的糯玉米性狀直接引入具有優(yōu)良性狀的雜交種中，解決了糯玉米產(chǎn)量低的問題，同時(shí)避免了繁雜的回交育種工作，同年，該公司利用CRISPR-Cas9技術(shù)將一個(gè)玉米內(nèi)源啟動(dòng)子GOS2精確插入到玉米中乙烯應(yīng)答調(diào)控因子ARGOS8的5′端，獲得耐旱材料[27]。

小麥屬于異源多倍體，基因組龐大，因此通過傳統(tǒng)方法育種難度很大。Zhang等[11]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小麥粒長(zhǎng)和粒重調(diào)控基因TaGASR7和穗密度調(diào)控基因TaDEP1進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得的TaGASR7純合突變材料粒重顯著增加，TaDEP1純合突變材料明顯變矮。高彩霞和唐定中團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)，獲得了同時(shí)敲除3個(gè)同源基因的突變體，該突變體對(duì)白粉病表現(xiàn)出有較強(qiáng)抗性[28]。

2.2 在經(jīng)濟(jì)作物育種中的應(yīng)用

Cai等[29]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)大豆光周期開花途徑關(guān)鍵基因GmFT2a進(jìn)行了定向編輯，靶向大豆內(nèi)源GmFT2a上的3個(gè)位點(diǎn)，T1代純合突變體植株花期延遲。Wang等[30]建立了適用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，以棉花葉綠素合成相關(guān)基因GhCLA1為靶標(biāo)設(shè)計(jì)3對(duì)sgRNA，各靶標(biāo)位點(diǎn)的編輯效率高達(dá)到66.7%～100%，為推動(dòng)棉花基因組編輯工作打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。Xu等[31]利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)CLV3進(jìn)行了基因編輯，使得番茄果實(shí)的心室數(shù)顯著增加；Soyk等[32]采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)番茄抗成花基因SP5G進(jìn)行定向編輯，突變體材料番茄開花及成熟時(shí)間提前約2周，且產(chǎn)量顯著增加。以上研究結(jié)果表明該技術(shù)在番茄重要農(nóng)藝性狀改良方面具有巨大的應(yīng)用潛力。雙孢菇(Agaricusbisporus)非常容易褐變，從而影響其品質(zhì)。Waltz[33]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)雙孢菇的1個(gè)多酚氧化酶基因PPO進(jìn)行定向編輯，獲得的突變體材料中多酚氧化酶的活性降低了30%，抗褐變能力大幅提高。

3 展望

傳統(tǒng)育種需要投入大量的時(shí)間和精力，才能將相關(guān)基因的有益變異累積為最佳的品種，而通過CRISPR/Cas9技術(shù)能夠直接且有目的進(jìn)行優(yōu)良性狀選擇。但CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前還存在一些技術(shù)方面的問題，有待進(jìn)一步改進(jìn)和探討：①以往報(bào)道的CRISPR/Cas9技術(shù)在應(yīng)用過程中會(huì)出現(xiàn)一定程度的脫靶現(xiàn)象，引起基因組非靶向位點(diǎn)的突變，這樣會(huì)造成研究結(jié)果的不確定性，嚴(yán)重限制了該技術(shù)的應(yīng)用。提高sgRNA序列特異性和使用合適的Cas蛋白等都能夠有效降低甚至消除脫靶現(xiàn)象[34,35]。此外，2017年Rauch等[36]在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了能夠阻斷CRISPR-Cas9活性的AcrllA4蛋白，該蛋白讓CRISPR-Cas9在基因編輯一段時(shí)間后“關(guān)閉其活性”，防止在不必要的位點(diǎn)隨意剪切造成的脫靶效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，Yang和Patel[37]采用冷凍電子顯微鏡和人體細(xì)胞培養(yǎng)等方法進(jìn)一步揭示了AcrIIA4主要是通過競(jìng)爭(zhēng)Cas9蛋白上的DNA結(jié)合域發(fā)揮作用，這一發(fā)現(xiàn)為CRISPR/Cas9技術(shù)在育種中的廣泛應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的支持和保障。②基因編輯范圍有限。CRISPR系統(tǒng)中，DNA的精確剪切依賴于gRNA及PAM序列。目前的研究中，CRISPR/Cas9所識(shí)別的PAM位點(diǎn)包括經(jīng)典的“NGG”和Cas9改變后的“NGA”和“NGCG”等。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步拓寬了基因組編輯的范圍，與CRISPR/Cas9不同，CRISPR/Cpf1的PAM序列主要位于“T/A”富集區(qū)，包括LbCpf1識(shí)別的“TTTV”及LbCpf1(RR)變體識(shí)別的“TYCV”。如何有效拓展CRISPR系統(tǒng)PAM位點(diǎn)范圍，是該技術(shù)在育種中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在。③提高同源重組(HDR)效率。目前CRISPR技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用，主要集中于依賴HNEJ途徑的基因敲除，如何通過HDR實(shí)現(xiàn)高效率的大片段插入或堿基替換仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。Charpentier等[38]最近的研究中，通過將同源重組過程早期關(guān)鍵蛋白CtIP與Cas9蛋白融合，從而激活HDR途徑，在人類細(xì)胞、鼠受精卵細(xì)胞中將編輯效率提高2倍以上。Aird等[39]將供體DNA通過PCV共價(jià)鍵連接到Cas9/gRNA核糖核蛋白復(fù)合體上，增加DSB處供體DNA的濃度，從而提高Cas9介導(dǎo)的同源重組修復(fù)效率。利用HDR在靶位點(diǎn)插入目的基因，將是基因編輯育種的重要攻關(guān)內(nèi)容之一。

總之，雖然目前基因編輯技術(shù)還存在很多不足，但其相對(duì)傳統(tǒng)育種的優(yōu)勢(shì)顯而易見，因此其具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景，相信在不久的將來，經(jīng)過優(yōu)化和改良的基因編輯技術(shù)將成為培育作物新品種的主要手段之一。

參 考 文 獻(xiàn)

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