黃 潔，張 捷

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科三病區(qū)，昆明 650101)

本研究利用“下一代”測(cè)序技術(shù)(NGS)，首次針對(duì)不同膽囊結(jié)石類型患者的膽囊黏膜和微生物群落的16S rDNA進(jìn)行Illumina Miseq檢測(cè)和分析,進(jìn)一步探討膽囊結(jié)石發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1-12月在本院肝膽胰外科三病區(qū)行膽囊切除術(shù)的60例膽囊結(jié)石患者為病例組，分膽固醇、膽色素和混合性結(jié)石組3組，每組各20例。選取肝右前葉血管瘤切除膽囊的11例患者為對(duì)照組。術(shù)后膽汁培養(yǎng)和厭氧菌培養(yǎng)陽(yáng)性的病例不納入本次研究，所有樣本均經(jīng)病理證實(shí)。所有患者均知情同意，本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1采集 完成膽囊切除術(shù)，切開并取出結(jié)石，對(duì)結(jié)石表面附著物用生理鹽水沖洗。用無(wú)菌組織剪剪取膽囊黏膜1塊，大小約2.0 cm×2.0 cm。無(wú)菌螺口離心管收集樣本，完成后立即放置于-80 ℃液氮瓶中儲(chǔ)存。

1.2.2DNA提取 從-80 ℃的冰箱中取出樣本并解凍，用無(wú)菌刀片將結(jié)石均分成4份。收集每份的核心部分，烘干至37 ℃后粉碎，取180～220 mg提取細(xì)菌DNA，余下的樣本用于膽固醇含量測(cè)定；稱取患者及對(duì)照者的黏膜各180～200 mg;分別放置于2 mL離心管(含200 μL 0.1 mm氧化鋯/硅珠)，加入2 mL 緩沖液ATL(由QIAamp?DNA Stool Mini Kit提供的細(xì)胞裂解液)，均質(zhì)化后，首先20 ℃下物理破碎2 min，6 000 r/min離心1 min，95 ℃裂解5 min。DNA提取的試劑使用OMEGA E.Z.N.A.土壤DNA提取試劑盒進(jìn)行微生物DNA的提取。

1.2.3PCR擴(kuò)增 使用帶有樣本特異標(biāo)簽序列(barcode)的PCR引物對(duì)(341F/805R)，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。341F引物：CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT CTN(barcode)CCT ACG GGN GGC WGC AG；805R引物：GAC TGG AGT TCC TTG GCA CCC GAG AAT TCC AGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C。其中barcode為各樣本的條形碼，用于后續(xù)Raw Data的分配。

1.2.4文庫(kù)構(gòu)建及Miseq測(cè)序 使用Illumina自帶的Miseq Control Software (MCS)軟件進(jìn)行監(jiān)控和原始數(shù)據(jù)的校檢。主要包含以下5個(gè)步驟：制作樣本數(shù)據(jù)表，解凍試劑盒，加載DNA文庫(kù)到試劑盒，上樣，設(shè)置程序參數(shù)并按照MCS的提示進(jìn)行操作和監(jiān)控。

1.2.5細(xì)菌分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)的鑒定 采用QIIME1.9.1軟件進(jìn)行分類單元的鑒定和生物多樣性的評(píng)估分析。

2 結(jié) 果

2.1研究樣本基本情況 3組膽囊結(jié)石患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，膽固醇含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同類型膽囊結(jié)石患者基本條件的比較

表2 樣本的測(cè)序情況匯總表

a:P<0.05

圖1 不同類型的膽結(jié)石、不同部位的屬的分布(顯示前11個(gè)屬和其他)

2.2膽囊結(jié)石和黏膜樣本的DNA提取結(jié)果 對(duì)照組中未檢測(cè)出細(xì)菌微生物群落DNA。病例組結(jié)石樣本中有6例未提取出微生物群落DNA，1例黏膜樣本未提取出微生物群落DNA，總微生物群落DNA提取率為94.2%。

2.3Miseq測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果 各組樣本的測(cè)序情況，3組OTU數(shù)/樣本、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。豐度最高的為變形細(xì)菌門(Proteobacteria)，其余豐度最多的3個(gè)門分別為厚壁菌門(Firmicutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)。占比超過(guò)1%的其他稀有細(xì)菌門類群中，同一類型的結(jié)石患者的結(jié)石和黏膜成比較為一致，而不同類型的組成差異較大，見圖1、2。

圖2 不同類型的結(jié)石黏膜優(yōu)勢(shì)菌門的分布

所有的樣本進(jìn)行熱圖分析，可看出樣本主要分兩類，結(jié)石和黏膜樣本分別聚集在不同支，且在不同細(xì)菌類群上有明顯差異分布。細(xì)菌分布較集中的是膽固醇結(jié)石，在大多數(shù)差異大的類群有較高的分布，而膽色素結(jié)石的細(xì)菌主要集中在Pseudomonas、stutzeri和Enterococcus類群，見圖3。

圖3 全部OTU水平進(jìn)行熱圖分析

3 討 論

本研究通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序?qū)δ懩覂?nèi)微生物群落樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)香農(nóng)指數(shù)、Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)在不同類型結(jié)石組間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且同一類型結(jié)石組黏膜和微生物群落ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同一組內(nèi)結(jié)石和黏膜樣本，微生物群落菌群多樣性都有明顯的個(gè)體差異?？傮w規(guī)律為，在膽固醇結(jié)石和膽色素結(jié)石組膽囊黏膜樣本的生物多樣性指數(shù)顯著高于其對(duì)應(yīng)的結(jié)石樣本，而混合性結(jié)石組則相反。

同一類型患者的結(jié)石和黏膜膽囊微生物群落多樣性構(gòu)成比較相似，而不同類型患者的結(jié)石和黏膜膽囊微生物群落多樣性構(gòu)成比差異較大。在微生物門、綱、目這些較高分類水平上結(jié)石和黏膜微生物群落多樣性分布并不是很高，而在屬種水平則表現(xiàn)出了豐富的多樣性。筆者發(fā)現(xiàn)，由于稀有菌群比例較大，導(dǎo)致即使在膽固醇含量高于90%的膽固醇結(jié)石和黏膜中，膽囊微生物群落也顯示多樣性分布，且有極為復(fù)雜的群落分布。根據(jù)Illumina Miseq測(cè)序分析，由于個(gè)體變異性的存在可能導(dǎo)致膽囊微環(huán)境中的微生物群落有著極大的分散性和差異性。但由于樣本量較小，還需大樣本量去證實(shí)。而目前惟一能夠肯定的是由于膽囊對(duì)膽汁的濃縮功能，膽汁中含有一些物質(zhì)，如膽汁酸鹽、膽固醇和微量元素，可作為電子受體或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)支持細(xì)菌生長(zhǎng)代謝，并使結(jié)石細(xì)菌群落表現(xiàn)出多樣性[2-10]。

本研究尚有許多不足之處：(1)未將與膽囊微生物群落密切相關(guān)的腸道微生物群落納入研究，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。(2)未探討膽囊結(jié)石形成過(guò)程中膽囊微生物群落的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。(3)未涉及膽囊微生物群落與宿主的相互關(guān)系。

低濃度的微生物群落通過(guò)局部免疫機(jī)制對(duì)膽囊黏膜微環(huán)境產(chǎn)生影響，可進(jìn)一步研究結(jié)石形成及發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中膽囊微生物群落的生態(tài)作用。

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