趙 靜，劉偉偉，李雪萍，高永翔

(成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，成都 610075)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)慢性炎癥為主要表現(xiàn)，伴有關(guān)節(jié)外的各系統(tǒng)損傷的自身免疫性疾病[1]。RA的病因及發(fā)病機(jī)制仍不甚明確，為多種因素共同作用的結(jié)果，包括：遺傳因素、感染、基因突變、滑膜細(xì)胞的演變、炎性細(xì)胞浸潤及促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放等。但自身免疫及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的紊亂在RA發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮的關(guān)鍵作用已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可[2]。清風(fēng)藤用于治療風(fēng)濕性疾病歷史悠久，李時珍在《本草綱目》中稱清風(fēng)藤“主治風(fēng)疾，治風(fēng)濕流注、歷節(jié)鶴膝”。青藤堿是清風(fēng)藤的單體提取物?，F(xiàn)代藥理研究顯示,青藤堿具有顯著的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫抑制等藥理作用,但青藤堿的免疫抑制和抗風(fēng)濕的機(jī)制尚未完全闡明[3]。為進(jìn)一步探討青藤堿抗RA的作用及機(jī)制，本實(shí)驗通過復(fù)制佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(AIA)大鼠模型，選取炎癥相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行研究，探討青藤堿對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)細(xì)胞因子的影響及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 清潔級SD大鼠96只，7周齡，雌雄各48只，體質(zhì)量(200±10)g，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，質(zhì)量合格證號No.0006045，許可證號SCXK(川)2008-11。

1.1.2藥物 甲氨蝶呤，購自上海信誼藥制藥有限公司，批號H31020644。以臨床常用量換算為大鼠等效劑量作為本實(shí)驗劑量，每3天1次(0.51 mg·kg-1·d-1)。鹽酸青藤堿，購自寶雞市永嘉天然植物開發(fā)有限公司，批號YJ0110822A。參照陳奇編著《中藥藥理研究方法學(xué)》，在多次給藥實(shí)驗后，給藥濃度確定為按臨床用量240 mg進(jìn)行折算后6.25倍作為中劑量組，本實(shí)驗中鹽酸青藤堿低、中、高劑量組分別設(shè)計給藥量為30、60、120 mg·kg-1·d-1。

1.1.3試劑 完全弗式佐劑，Sigma公司，每瓶10 mL?？ń槊?BCG)，成都生物制品研究所，每瓶5 mg；白細(xì)胞介素(IL)-1檢測試劑盒(R&D公司，貨號：CK-E30418R)；IL-6檢測試劑盒(R&D公司，貨號：CK-E30646R)；IL-10檢測試劑盒(R&D公司，貨號：CK-E30651R)。

1.1.4儀器 酶標(biāo)儀：Thermo Mulliskan Ascant公司；顯微鏡：德國萊卡顯微鏡，德國萊卡病理圖像分析系統(tǒng)DM2000。

1.2方法

1.2.1造模 SD大鼠常規(guī)條件下飼養(yǎng)，自由飲水，普通飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，取80只大鼠，雌雄各40只，參照文獻(xiàn)[4]采用完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)法復(fù)制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，即取CFA每支10 mL，在冰浴下與卡介苗混合，配制成含卡介苗10 mg/mL的水包油乳劑，對大鼠予以每只0.1 mL左足趾皮下注射。取16只大鼠，雌雄各8只，予生理鹽水以每只0.1 mL左足趾皮下注射。第14天加強(qiáng)免疫，操作方法同前，注射部位改為尾部皮下，制成AIA模型。

1.2.2分組和給藥 加強(qiáng)免疫7 d后取注射CFA的80只大鼠，雌雄各40只，分成模型組、甲氨蝶呤組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組、青藤堿高劑量組；取注射生理鹽水的16只大鼠為正常對照組。甲氨蝶呤組灌胃給藥劑量為0.51 mg·kg-1·d-1，青藤堿低、中、高劑量組灌胃給藥劑量分別為30、60、120 mg·kg-1·d-1，正常對照組和模型組給予10 mg·kg-1·d-1生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥21 d。

1.2.3取材 末次給藥后禁食禁水12 h，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射，輔以乙醚吸入麻醉大鼠。每組選取大鼠6只，剖開大鼠腹腔，腹主動脈取血并處死大鼠，離斷大鼠注射側(cè)足髖關(guān)節(jié)，取包含踝關(guān)節(jié)的足部。血液經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清液備用，離斷的大鼠含踝關(guān)節(jié)的足置于4%多聚甲醛中固定備用。

1.2.4指標(biāo)檢測

1.2.4.1病理觀察及半定量評分 標(biāo)本經(jīng)乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察關(guān)節(jié)的病理改變，根據(jù)滑膜炎病理改變：滑膜襯層細(xì)胞層數(shù)、血管翳形成、炎性細(xì)胞浸潤、新生血管/毛細(xì)血管；骨/軟骨破壞：骨侵蝕、軟骨侵蝕、關(guān)節(jié)粘連、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞；關(guān)節(jié)修復(fù)：新生骨、新生軟骨10項基本病變的不同嚴(yán)重程度(正常、輕度、中度、中度)給予0～3分，進(jìn)行病理學(xué)半定量分析。

1.2.4.2全自動血生化儀檢測大鼠血清類風(fēng)濕因子(RF)和C反應(yīng)蛋白(CRP)水平 以標(biāo)記后的血生化采血管(紅色)，從大鼠腹主動脈采取抗凝血3 mL。以全自動血生化儀檢測各組大鼠RF和CRP的水平。

1.2.4.3ELISA法檢測大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10的水平 根據(jù)ELISA試劑盒使用說明書中標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行，每組選6只大鼠血清，ELISA法檢測給藥21 d后的大鼠血清IL-1、IL-6、IL-10水平，在酶標(biāo)儀(λ=490 nm)測定吸光度(A)值。

2 結(jié) 果

2.1青藤堿對大鼠關(guān)節(jié)病理損傷的影響 正常對照組大鼠關(guān)節(jié)腔均未見病變(圖1A)。模型組大鼠關(guān)節(jié)腔幾乎完全消失，出現(xiàn)彌漫性滑膜細(xì)胞和纖維組織增生，血管翳形成，填滿關(guān)節(jié)腔；多灶性區(qū)域出現(xiàn)炎性細(xì)胞聚集和新生毛細(xì)血管形成，并向軟骨和骨組織浸潤，軟骨和骨破壞現(xiàn)象多見；灶性區(qū)域可見新生骨/軟骨組織形成(圖1B)。甲氨蝶呤組(圖1C)、青藤堿低劑量組(圖1D)和青藤堿中劑量組(圖1E)，雖然呈現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)腔狹窄、腔內(nèi)有炎性滲出物，以及關(guān)節(jié)囊測的滑膜組織明顯增生和血管翳形成，但其程度低于模型組；灶性區(qū)域仍可見炎性細(xì)胞浸潤和新生毛細(xì)血管形成，軟骨和骨破壞現(xiàn)象也在部分切片中出現(xiàn)，但出現(xiàn)的頻率和程度均遠(yuǎn)低于模型組，此3組的病理學(xué)積分與模型組比較顯著降低。青藤堿高劑量組病理改變及病理學(xué)積分雖比模型組有所改善和降低(圖1F)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各實(shí)驗組大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)積分統(tǒng)計結(jié)果見圖2。

A：正常對照組；B:模型組；C:甲氨蝶呤組；D:青藤堿低劑量組；E:青藤堿中劑量組；F:青藤堿高劑量組

圖1大鼠關(guān)節(jié)組織病理切片(HE，×400)

表1 青藤堿對各組大鼠IL-1、IL-6、IL-10的水平的影響

a：P<0.05，b：P<0.01，與模型組比較

n=6；a：P<0.05，與模型組比較;b:P<0.05,與青藤堿高劑量組比較

圖2各實(shí)驗組大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)積分

2.2青藤堿對大鼠血清RF和CRP表達(dá)水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清RF和CRP水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，甲氨蝶呤組、青藤堿低、中、高劑量組RF水平降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3；甲氨蝶呤組，青藤堿低、中、高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見圖4。

n=6；a：P<0.05，與模型組比較

圖3各組大鼠血清RF水平比較

n=6；a：P<0.05，b：P<0.01，與模型組比較

圖4各組大鼠血清CRP水平比較

2.3青藤堿對大鼠血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響 模型組大鼠與正常對照組相比，IL-1、IL-6水平明顯上升，IL-10水平則明顯下降，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。用藥后，甲氨蝶呤組和青藤堿低、中劑量組與模型組相比，IL-1、IL-6水平下降，IL-10水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。青藤堿高劑量組與模型組相比，指標(biāo)下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3 討 論

根據(jù)RA的臨床表現(xiàn)特征，其歸屬于中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“歷節(jié)”“痹病”范疇。如《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》提出：“病歷節(jié)不可屈伸疼痛”“諸肢節(jié)疼痛，身體魁贏，腳腫如脫”，其中對癥狀的描述，與RA有相似之處[5]。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，風(fēng)寒濕邪為“痹病”發(fā)生的重要外在因素，痰淤互結(jié)是痹癥產(chǎn)生的關(guān)鍵病機(jī)，其治療常用清熱解毒、祛風(fēng)散寒，活血化瘀、補(bǔ)益肝腎等法。清風(fēng)藤為防己科植物青藤、華防己或清風(fēng)藤科植物清風(fēng)藤等的藤莖，李時珍在《本草綱目》中稱清風(fēng)藤“主治風(fēng)疾，治風(fēng)濕流注、歷節(jié)鶴膝”[6]?！侗静輩R言》記載：“清風(fēng)藤，散風(fēng)寒濕痹之藥也，能舒筋活血，正骨利髓，故風(fēng)病軟弱無力，并勁強(qiáng)偏廢之證，久服常服，大建奇功”[7]。青藤堿是清風(fēng)藤的單體提取物，現(xiàn)代藥理研究證實(shí),青藤堿具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫抑制等藥理作用，臨床用于治療風(fēng)濕病常有良效[3]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，機(jī)體免疫功能紊亂，免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡是RA重要的發(fā)病機(jī)制和表現(xiàn)形式，尤其是細(xì)胞因子IL-1、IL-6和IL-10在其中發(fā)揮重要作用。IL-1是目前已知的RA中最重要的炎性細(xì)胞因子之一。血漿和滑膜中的IL-1水平，與關(guān)節(jié)炎性活動水平、關(guān)節(jié)破壞進(jìn)展直接相關(guān)。RA的IL-1主要來源于活化的巨噬細(xì)胞，可由腫瘤壞死因子(TNF)-α或IL-1自身刺激產(chǎn)生，具有促進(jìn)自我分泌的能力，能將炎癥信號迅速放大。滑液中的IL-1會刺激前列腺素E2、一氧化氮(NO)和基質(zhì)金屬蛋白的表達(dá)，促進(jìn)關(guān)節(jié)的破壞；并能抑制膠原的合成而抑制關(guān)節(jié)修復(fù)，刺激破骨細(xì)胞重吸收骨。此外IL-1作為內(nèi)生致熱源，能激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，并使巨噬細(xì)胞活化釋放各種蛋白水解酶和趨化因子[8-10]。IL-6也是RA中重要的促炎細(xì)胞因子。當(dāng)滑膜成纖維細(xì)胞受到促炎細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α、IL-17等刺激時，能大量產(chǎn)生IL-6，繼而通過誘導(dǎo)新生血管形成、促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤和促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生，促進(jìn)滑膜炎性進(jìn)程。此外，IL-6還能誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)，刺激破骨細(xì)胞形成，引起骨質(zhì)吸收[11]。更重要的是IL-6還能通過破壞Th17和Treg之間的平衡參與自身免疫性疾病的發(fā)病[12]。由于其在發(fā)病中的核心地位，IL-6已成為一個獨(dú)立的阻斷靶點(diǎn)。同進(jìn)針對IL-6的單抗已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗，并被證實(shí)有效。而與IL-1和IL-6相反，IL-10是RA疾病過程中，比較重要的抑炎因子。作為Th2細(xì)胞的代表細(xì)胞因子，IL-10具有很強(qiáng)的免疫抑制及免疫調(diào)控作用，在RA的發(fā)病環(huán)節(jié)中能抑制IL-8，粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等炎癥因子的釋放，拮抗相關(guān)TH1細(xì)胞因子，從而發(fā)揮對RA的抑制作用[13-14]。

如上所述，IL-1和IL-6是RA疾病進(jìn)程中重要的促炎因子，與關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞程度呈正相關(guān)；IL-10則是重要的抑炎因子，與關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。同時血液中的IL-1、IL-6 和IL-10水平還能反映RA發(fā)生時機(jī)體的全身免疫狀態(tài)。本實(shí)驗選取上述3個因子作為RA發(fā)生時炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡的代表，以期探討青藤堿能否通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，恢復(fù)促炎因子與抑炎因子的失衡狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮治療作用。

RF和CRP 與RA的臨床表現(xiàn)和關(guān)節(jié)損傷程度密切相關(guān)，在一定程度上反映 RA的疾病活動度[15]。本實(shí)驗研究結(jié)果顯示，造模處理后，模型組大鼠RF和CRP水平明顯升高，同時血清IL-1和IL-6水平升高，IL-10水平降低，大鼠關(guān)節(jié)病理損傷程度半定量評分明顯增加，提示佐劑誘導(dǎo)性AIA模型復(fù)制成功；經(jīng)過灌胃給藥治療后，甲氨蝶呤組及青藤堿低、中、高劑量組大鼠血清CRP水平明顯低于模型組，青藤堿低、中劑量組大鼠血清IL-1和IL-6水平降低，IL-10水平上升，大鼠關(guān)節(jié)病理損傷程度半定量評分也相應(yīng)降低，提示青藤堿對佐劑誘導(dǎo)性AIA模型大鼠具有治療作用。青藤堿高劑量組大鼠關(guān)節(jié)組織病理評分、血清IL-1、IL-6和IL-10水平變化與模型組比較均無顯著差異，可能為高劑量青藤堿免疫抑制的藥理作用減弱，反而對大鼠臟器產(chǎn)生不良反應(yīng)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。已有研究報道顯示，大劑量青藤堿可導(dǎo)致大鼠肝臟損傷，且臟器損傷程度與藥物在組織中濃度呈正相關(guān)[16]。青藤堿能明顯減輕關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性反應(yīng)，抑制滑膜組織增生及血管翳的形成，減輕軟骨和骨組織浸潤及關(guān)節(jié)腔的破壞，可能與青藤堿抑制模型動物的血清IL-1和IL-6的上升趨勢，同時促進(jìn)IL-10的分泌有關(guān)。這一現(xiàn)象既能夠反映青藤堿對模型組的治療作用，同時也揭示了部分可能的治療作用機(jī)制，即青藤堿可能通過下調(diào)血清促炎細(xì)胞因子IL-1和IL-6的表達(dá)，上調(diào)抑炎因子IL-10的表達(dá)，對RA的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)節(jié)，阻斷或干擾其后續(xù)炎性反應(yīng)，減輕滑膜血管翳增生和軟骨破壞。青藤堿對促炎因子與抑炎因子失衡狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用，與中醫(yī)治療疾病 “調(diào)節(jié)陰陽，以平為期”最終目的不謀而合。

盡管發(fā)現(xiàn)了青藤堿能對部分細(xì)胞因子起調(diào)控作用，從而發(fā)揮其抗炎效應(yīng)。但針對點(diǎn)狀模式的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，并不能全面解釋其對RA炎性反應(yīng)過程中，復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)過程。在實(shí)驗后續(xù)機(jī)制探索部分，將應(yīng)用基因芯片技術(shù)，全面檢測全基因表達(dá)譜的改變，試圖尋找位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中心的信號通路和基因，并分析之間相互聯(lián)系。通過以上探索，可為后續(xù)發(fā)掘中藥青藤堿對RA的治療機(jī)制，拓展青藤堿在治療自身免疫性疾病的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

[1]KLARESKOG L,CATRINA A I,PAGET S.Rheumatoid arthritis[J].Lancet,2009,373(2):659-672.

[2]CICCIA F,GUGGINO G,RIZZO A,et al.Potential involvement of IL-9 and Th9 cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J].Rheumatology(Oxford),2015,54(12):2264-2272.

[3]危紅華，趙曉旭，程亮，等．青藤堿治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展及展望[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2013，8(10)：3001-3003．

[4]吳晶金.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型研究進(jìn)展[J]．風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5(12)：70-73.

[5]李晶，張華東，王振興，等.從《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》論痹病發(fā)病機(jī)制[J].北京中醫(yī)藥，2013，32(6)：448-449.

[6]熊力群，余舒鵬，李文龍，等.清風(fēng)藤臨床應(yīng)用研究概況[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2017，13(2)：63-65.

[7]高晨鑫，張湛明，陳繼紅，等.青藤堿對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子影響的研究進(jìn)展[J]．風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2017，6(2)：72-75.

[8]KOSEK E,ALTAWIL R,KADETOFF D,et al.Evidence of different mediators of central inflammation in dysfunctional and inflammatory pain--interleukin-8 in fibromyalgia and interleukin-1 β in rheumatoid arthritis[J].J Neuroimmunol,2015,280(1):49-55.

[9]UMAR S,HEDAYA O,SINGH A K,et al.Thymoquinone inhibits TNF-α-induced inflammation and cell adhesion in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts by ASK1 regulation[J].Toxicol Appl Pharmacol,2015,287(3):299-305.

[10]王志中，王勇，牟方祥，等.血小板、TNF-α及IL-1β與活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2011，33(5)：469-472.

[11]SAEKI Y,KUDO-TANAKA E,OHSHIMA S,et al.Baseline anti-citrullinated peptide antibody(ACPA)titers and serum interleukin-6(IL-6)levels possibly predict progression of bone destruction in early stages of rheumatoid arthritis(ERA)[J].Rheumatol Int,2013,33(2):451-456.

[12]YOSHIDA Y,TANAKA T.Interleukin 6 and rheumatoid arthritis[J].Biomed Res Int,2014:698313

[13]陳曉梅,李靜,張曉盈,等.不同亞型的濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的臨床意義[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2016,48(6)：958-963.

[14]蔡輝，張群燕，郭郡浩，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血血漿中TNF-α、IL-1β及IL-10的表達(dá)及臨床意義[J]．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35(3)：519-521.

[15]蘭由玉，王友強(qiáng)，何成松．五項檢測指標(biāo)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷中的臨床價值[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23(9)：2130-2135．

[16]葉木榮,劉良,曾元兒,等.青藤堿在大鼠體內(nèi)分布與臟器毒理的關(guān)系研究[J].中國藥理學(xué)通報,2001,17(1):65-69.