李潔 陳文成 元輝雄 韋玉霞 龐艷芳 王俊利

【關(guān)鍵詞】 雌激素受體基因α;男性不育;基因多態(tài)性;相關(guān)性分析

中圖分類(lèi)號(hào)：R698+.2;R394.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.003

Analysis of correlation between gene polymorphism at rs1062577 locus of ESRα and male infertility in Zhuang nationality

LI Jie1，CHEN Wencheng，YUAN Huixiong，WEI Yuxia，PANG Yanfang，WANG Junli

【Abstract】 Objective To investigate correlation between male sterility of Zhuang nationality in western Guangxi and the single nucleotide polymorphisms at the rs1062577 locus of estrogen receptor α （ESRα） in Zhuang nationality.

Methods Case-control method was used for the study，and TaqMan probe real-time PCR technique was used to perform genotyping of ESRα loci in 96 infertile men aged 21～46 years（experimental group） and 83 normal healthy men aged 20～46 years （control group），and the method was verified by sequencing.In addition，distribution characteristics of genotype and allele frequency in the experimental group and the control group was counted by SPSS software.

Results Compared with wild homozygous genotype，heterozygous genotype and homozygous mutants genotype showed no correlation with male infertility，and it also showed no correlation in the comparison between mutant allele and wild allele（P>0.05）.Gene polymorphism of ESRα was not correlated with sperm concentration，the percentage of forward motile sperm and normal sperm morphology.

Conclusion Single nucleotide polymorphisms at the rs1062577 locus of ESRα is not correlated with male infertility in Zhuang nationality.

【Key words】 ESRα;male infertility;gene polymorphism;correlation analysis

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)，男性因素在降低人類(lèi)生育能力中起著至關(guān)重要的作用[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體α（estrogen receptor α，ESRα）大量存在于人類(lèi)生殖組織，其基因多態(tài)性與各種疾病，也包括有關(guān)人類(lèi)不孕，在基因型和人類(lèi)生殖行為之間表現(xiàn)出復(fù)雜的相互作用[2]。目前認(rèn)為造成男性不育最主要的因素為環(huán)境和遺傳因素，其中既常見(jiàn)又重要的因素是基因突變。因此研究參與男性精子發(fā)生基因的多態(tài)性成為該鄰域的研究熱點(diǎn)。本研究對(duì)ESRα基因rs1062577位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性分析，闡述該位點(diǎn)基因多態(tài)性與廣西壯族男性不育之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016年10月至2017年3月就診于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心患者，此次研究對(duì)象均為廣西壯族男性，年齡21～46（31.05±5.83）歲，臨床表現(xiàn)為不育癥者96例，患者主訴婚后1年以上不育，有發(fā)育良好的第二性征和正常的睪丸體積，排除女方的因素。在進(jìn)行試驗(yàn)組收集時(shí)，參照《WHO人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：精子密度的參考值下限為15×106/ml，總運(yùn)動(dòng)精子比例的參考值下限為40%，前向運(yùn)動(dòng)精子比例的參考值下限為32%，正常形態(tài)精子比例的參考值下限為4%;同時(shí)記錄患者年齡、民族、籍貫、生育史及家族史等基本情況。對(duì)照組為具有正常生育史的健康男性（83例），體格檢查和精液質(zhì)量分析均正常，排除炎癥、生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變等影響生育能力疾病的患者，年齡20～45（32.40±6.31）歲，本研究獲得右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)且患者知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精液質(zhì)量檢測(cè)

所有檢測(cè)對(duì)象標(biāo)本采集時(shí)使用手淫取精法，取精前禁欲2～7天，收集于帶刻度的、清潔干燥試管內(nèi)，所有標(biāo)本均于本院取精室內(nèi)采取，確保送檢時(shí)間的可控性和及時(shí)性。接收時(shí)立即放入37℃恒溫箱內(nèi)，并記錄標(biāo)本采集時(shí)間。精液常規(guī)檢測(cè)采用西班牙SCA全自動(dòng)精液分析系統(tǒng)，光學(xué)顯微鏡為OLYMPUS（日本，CX41-32C02），完成常規(guī)檢測(cè)后標(biāo)本進(jìn)行Diff-Quik快速染色（參照《WHO人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)）[3]。

1.2.2 外周血 DNA的提取

采用EDTA-K2抗凝真空采血管抽取外周血3 ml，按照天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，采用紫外分光光度儀檢測(cè)所提取的DNA濃度和純度，存放于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ESRα基因分型檢測(cè)

PCR擴(kuò)增：總反應(yīng)體系體積20 μL，其中模板DNA 5 μL（終濃度1 μg/μL）、雙蒸水4.5 μL、基因分型混合物0.5 μL、FastStart Essential DNA探針預(yù)混物10 μL。應(yīng)用羅氏LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)孵育600 s;兩步放大：95℃ 15 s，60℃ 60 s（單次采集），共40個(gè)循環(huán);冷卻：37℃ 30 s，最后4℃保存;熒光通道為FAM/VIC。設(shè)置無(wú)模板質(zhì)控孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)基因型和等位基因的頻率分布進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料若服從正態(tài)分布用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，若不服從正態(tài)分布，則用M（P₂₅，P₇₅）表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn);基因多態(tài)性與男性不育的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系采用比值比（odds radio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidenceinterval，CI）來(lái)描述。使用在線分析工具計(jì)算試驗(yàn)組和對(duì)照組哈德溫伯格平衡值（HWE），檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)? 果

2.1 群體代表性檢驗(yàn)

對(duì)對(duì)照組基因型進(jìn)行哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)，P=0.139，說(shuō)明研究對(duì)象來(lái)自同一群體，具有較好的代表性;年齡分布、禁欲時(shí)間和精液體積在兩組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩組患者的前向運(yùn)動(dòng)精子百分率和精子濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各項(xiàng)基本資料見(jiàn)表1。

2.2 ESRα rs1062577等位基因頻率和基因型分布

采用χ2 檢驗(yàn)對(duì)ESRα rs1062577等位基因分布頻率和基因型頻率進(jìn)行分析，等位基因T、A分布頻率在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。經(jīng)檢測(cè)該位點(diǎn)有三種基因型TT、AT、AA，其分布頻率在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 ESRα基因SNP 突變的測(cè)序分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們隨機(jī)選取ESRα位點(diǎn)的三種基因型個(gè)體的樣本送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與TaqMan探針?lè)椒ǖ玫降慕Y(jié)果一致。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4 ESRα基因型間精液質(zhì)量的分析比較

采用多個(gè)樣本比較非參數(shù)Krukal-Wallis H檢驗(yàn)不同基因型與精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示，rs1062577位點(diǎn)三種基因型間（TT/AT/AA）精液體積、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比及正常精子形態(tài)百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討? 論

近年來(lái)的研究表明[4]，ESRα在精子發(fā)生的早期和生精細(xì)胞成熟的晚期發(fā)揮著生理功能，與精液質(zhì)量有著密切關(guān)系，其遺傳多態(tài)性影響疾病的發(fā)生發(fā)展，雌激素受體在生殖系統(tǒng)中的研究逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。雌激素一直被認(rèn)為是男性生殖的保護(hù)因子，但有研究表明[5～6]，雌激素減少可影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，降低睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量，干擾胎兒睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，調(diào)控生殖細(xì)胞的凋亡。E2通過(guò)ESRα信號(hào)能夠促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞畸形生長(zhǎng)和巨噬細(xì)胞活化，刺激間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)停滯基因6（GAS6），連接細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸（PS），調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞的吞噬作用[7]。已有研究證實(shí)ESRα基因rs1062577位點(diǎn)與多種癌癥的易感性有關(guān)[8～9]，但其與男性不育的相關(guān)性鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：ESRα基因rs1062577位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型分布在試驗(yàn)組和對(duì)照組之間沒(méi)有差異（P>0.05），由此可以推測(cè)ESRα基因rs1062577位點(diǎn)與廣西壯族男性不育不存在相關(guān)性。

雌激素受體激活細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)睪丸支持細(xì)胞增殖和分化，對(duì)建立血-睪屏障，維持精子發(fā)生的能力具有重要作用[10]。有學(xué)者推測(cè)[11]，ESRα基因發(fā)生突變可以使雌激素對(duì)生精細(xì)胞的作用減弱，可能是由于遺傳的連鎖不平衡效應(yīng)改變了基因的表達(dá)與功能，影響mRNA的合成、拼接、成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和降解過(guò)程，間接影響了精子發(fā)生。ESRα廣泛分布于雄性生殖系統(tǒng)內(nèi)，對(duì)生殖功能有一定影響，通過(guò)對(duì)ESRα敲除和敲入小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，主要通過(guò)配體依賴(lài)和非依賴(lài)途徑影響精子的發(fā)生和成熟，尤其是在輸出小管液體重吸收方面起到重要的調(diào)節(jié)作用[12]。已證實(shí)在使用ESRα激動(dòng)劑治療后精子數(shù)目減少，這與ESRα激動(dòng)劑能夠阻滯精子的變形，下調(diào)參與精子發(fā)生的基因有關(guān)[13]。Lazaros等[14]也發(fā)現(xiàn)，ESRα與精子發(fā)生過(guò)程和精子質(zhì)量有關(guān)，影響精子的動(dòng)力和濃度。本研究中，ESRα rs1062577 位點(diǎn)基因多態(tài)性與精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比及正常精子形態(tài)百分比無(wú)相關(guān)性，可能是壯族與其他民族間存在差異，因而造成男性不育易感性差異[15]。

綜上所述，ESRα rs1062577與男性不育之間無(wú)關(guān)聯(lián)，但為廣西人群疾病遺傳多態(tài)性的研究提供參考資料。本研究?jī)H收集廣西地區(qū)壯族為研究對(duì)象，且存在標(biāo)本量較少。因此，在研究的同時(shí)應(yīng)對(duì)本地區(qū)、不同種族進(jìn)行多位點(diǎn)、大樣本量的深入細(xì)致分析。

參 考 文 獻(xiàn)

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