孫立偉，靳遠(yuǎn)祥，傅正偉，錢海豐,

1. 浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，杭州 310014 2. 浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，杭州 310014

目前，在我國開設(shè)有環(huán)境科學(xué)與工程專業(yè)的高校中，各級科教人員均越來越認(rèn)識到生態(tài)毒理學(xué)在整個課程體系中的重要性。伴隨著我國在生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的飛速發(fā)展，在過去的20年間，相關(guān)的教材陸續(xù)出版，比如周啟星、孔繁翔、朱琳合著的《生態(tài)毒理學(xué)》(科學(xué)出版社，2004)[1]和孟紫強主編的《生態(tài)毒理學(xué)》(高教出版社，2009)[2]等，開啟了我國生態(tài)毒理學(xué)教學(xué)的新紀(jì)元。然而，生態(tài)毒理學(xué)作為一門實踐性很強的學(xué)科，經(jīng)典理論需要實驗來展示，前沿理念需要實驗來驗證。目前，雖有個別相關(guān)的實驗教材出版，比如孔志明、楊柳燕、尹大強、程樹培合著的《現(xiàn)代環(huán)境生物學(xué)實驗技術(shù)與方法》(中國環(huán)境科學(xué)出版社，2005)[3]，付保榮主編的《環(huán)境污染生態(tài)毒理與創(chuàng)新型綜合設(shè)計實驗教程》(中國環(huán)境出版社，2016)[4]和宋志慧編著的《水生生態(tài)毒理學(xué)實驗》(化學(xué)工業(yè)出版社，2008)[5]等，但相較于較為成熟和完備的理論教學(xué)，生態(tài)毒理學(xué)實驗教學(xué)體系的構(gòu)建和實踐相對滯后，也難以反映相關(guān)領(lǐng)域的最新發(fā)展，阻礙了我國生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的人才培養(yǎng)。

水生生態(tài)毒理學(xué)一直是生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的重要組成部分。放眼國際上的最新研究成果，其中基于斑馬魚(Daniorerio)的研究占有相當(dāng)?shù)谋戎?，貢獻良多[6-7]。作為國際上廣受歡迎的模式動物，斑馬魚除了易于養(yǎng)殖、性成熟周期短、產(chǎn)卵量大等特點之外，還具有諸多獨特的優(yōu)勢，包括受精卵體外發(fā)育、胚胎透明；易于活體成像以及細(xì)胞追蹤；易進行化合物的高通量篩選以及一系列新興分子生物學(xué)技術(shù)手段的成功應(yīng)用等[8-9]。同時，研究發(fā)現(xiàn)人類和斑馬魚之間，生理和遺傳上均有高度同源性，其中基因的同源性高達70%，而人類疾病相關(guān)的基因中更有大約84%也存在于斑馬魚中[8]。此外，傳統(tǒng)應(yīng)用嚙齒類動物的毒性測試受到越來越嚴(yán)苛的實驗動物福利倫理規(guī)定的挑戰(zhàn)，而應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞的體外測試方法由于缺少生物體的復(fù)雜性，從而限制了其實驗數(shù)據(jù)的意義[8]。因此，以斑馬魚為實驗動物的研究近年來越來越受到毒理學(xué)領(lǐng)域科研工作者的重視，不僅在探究污染物對水生生物的毒性效應(yīng)及其作用機制中發(fā)揮了重要作用，相關(guān)的數(shù)據(jù)還有助于評價污染物對哺乳動物乃至人類的毒作用。本文試圖在目前已成功開發(fā)并應(yīng)用于科研的一系列斑馬魚毒性測試策略和方法的基礎(chǔ)上，初步構(gòu)建較為完整的水生生態(tài)毒理學(xué)實驗內(nèi)容和案例，其對于現(xiàn)有的生態(tài)毒理學(xué)教學(xué)有一定的參考和借鑒意義。

1 實驗用魚斑馬魚的簡介(Introduction of zebrafish)

斑馬魚常見的野生品系約有10余個，目前國內(nèi)外用于科研的主要有源于德國的Tübingen和源于美國的AB系。對于國內(nèi)科研院所而言，可直接向國家斑馬魚資源中心(China Zebrafish Resource Center)訂購，中心另提供多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚。若僅用于實驗教學(xué)，則也可以用當(dāng)?shù)鼗B市場購買的斑馬魚替代，在實驗前注意足夠的馴化時間即可。

斑馬魚的養(yǎng)殖方法詳見于TheZebrafishBook[11]。實驗用水可使用Westerfield[11]推薦的培養(yǎng)液，也可用曝氣自來水替代。鑒于實際操作中的可行性，比如希望有數(shù)量足夠多的實驗動物、較短的實驗時間和較小的實驗空間，推薦使用斑馬魚胚胎或者幼魚。由于斑馬魚目前還未發(fā)現(xiàn)明確的性別決定基因，因此，可忽略胚胎或者幼魚的性別差異。斑馬魚是一種光周期調(diào)控交配行為的魚類，因此，對于發(fā)育階段要求嚴(yán)格的實驗，則推薦人工調(diào)控光周期，并使用配魚專用缸。在26～28 ℃的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溫度下，斑馬魚約在受精后72 h(即72 hpf，hours post fertilization)孵化完全，孵化后即可自由游泳，約5～6 dpf (days post fertilization)開始進食。由于飼料對實驗結(jié)果可能帶來難以預(yù)料的影響，實際操作中可視幼魚卵黃囊是否已被完全吸收，再決定是否喂食。

2 實驗編排和內(nèi)容設(shè)計(Course contents and experiment design)

由于篇幅所限，本文僅給出實驗方法的簡要描述，而不涉及具體的實驗條件、設(shè)備、步驟、統(tǒng)計分析方法以及結(jié)果報告等。相關(guān)內(nèi)容可以參考國內(nèi)外毒性測試標(biāo)準(zhǔn)，比如經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)的化學(xué)品毒性測試標(biāo)準(zhǔn)等。具體操作時可因時因地制宜，根據(jù)實際情況作出調(diào)整。

2.1 致死效應(yīng)的檢測——幼魚急性毒性實驗

本實驗適用于檢測單一化合物的急性毒性，也可測定環(huán)境水體的污染程度[12]。毒理學(xué)終點為斑馬魚的死亡。以剛孵化的斑馬魚幼魚(72 hpf)為實驗動物，暴露時間可選24～96 h，從而得到相應(yīng)時間點的半致死濃度(lethal concentration 50%, LC50)。從本實驗中，通過劑量(濃度)-效應(yīng)曲線，學(xué)生可以理解有關(guān)經(jīng)典毒理學(xué)的最基本概念，即“劑量決定毒性”。

實驗方法簡介：考慮到操作的安全性以及受試化合物的穩(wěn)定性，實驗毒物可選擇銅離子。實驗前一天將雌雄成魚轉(zhuǎn)移至配魚專用盒中，用隔板將雌雄分開。在實驗當(dāng)天早晨抽去隔板，30 min后即可得到受精卵。胚胎在72 hpf完全孵化，即可用于后續(xù)實驗。在正式實驗前，授課教師可參考有關(guān)資料或者進行預(yù)實驗，確定正式實驗濃度范圍。正式實驗按等比間距設(shè)置5個污染物濃度，以得到較為完整的劑量效應(yīng)曲線，并包括必要的對照組。暴露方式可選擇靜水或者半靜水式，容器可選用燒杯或者6孔板。每個濃度至少設(shè)3個平行，每個平行10條實驗魚。一般而言，每升溶液中魚的負(fù)荷最好不超過1 g[3]，在此發(fā)育階段的幼魚，每條魚100 μL水也能滿足要求[8]。在暴露后每天定時檢查幼魚的狀況，記錄死魚數(shù)目，并及時清除死魚。條件具備的話，應(yīng)該同時檢測并記錄暴露液的水溫、pH、溶解氧、硬度等信息以及受試毒物的真實濃度。實驗結(jié)束后計算各時間點的LC50以及95%置信區(qū)間，確定化合物毒性分級[3,12-13]。

2.2 致畸效應(yīng)的檢測——胚胎發(fā)育毒性實驗

斑馬魚胚胎發(fā)育快速，絨毛膜透明，在倒置光學(xué)顯微鏡下即可觀察。暴露的容器可選擇96或者24孔板，從而適用于高通量篩選。在受精后的72 h內(nèi)，胚胎歷經(jīng)卵裂期、囊胚期、原腸期、體節(jié)期直至孵化，可以觀察到化合物在不同發(fā)育階段對體節(jié)、血管、腦、心臟、耳石、眼點等各器官部位的毒性效應(yīng)，尤其是諸如脊椎彎曲、心包水腫、眼點不發(fā)育等畸形，以及無心跳、卵凝結(jié)、無自主活動、不孵化等致死效應(yīng)[14]。針對不同的毒理學(xué)終點，可以得到各自的無可見效應(yīng)濃度(no observed effects concentration, NOEC)和最低可見效應(yīng)濃度(lowest observed effects concentration, LOEC)。此外，可通過手工或者鏈霉蛋白酶酶解脫膜[8]，從而對比研究卵膜對化合物毒性的影響。

實驗方法簡介：實驗毒物可選擇和幼魚急性毒性實驗一致的化合物，有利于相互比較。收集魚卵后，在倒置顯微鏡下甄別是否受精。將受精卵放置于多孔培養(yǎng)板，每孔一個胚胎，防止相互干擾。按等比間距設(shè)置3～5個污染物濃度，每個濃度至少3個平行(應(yīng)分布在不同孔板中)，每個平行至少10枚胚胎。在暴露后定時觀察胚胎的發(fā)育狀況，并記錄異常發(fā)育現(xiàn)象。暴露結(jié)束后，進行結(jié)果分析。

2.3 神經(jīng)毒性的檢測——幼魚游泳行為實驗

神經(jīng)系統(tǒng)對于外源因素的影響極為敏感，尤其是尚處于發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)。運動行為可視為評價神經(jīng)系統(tǒng)正常與否的重要指標(biāo)，與生物的機體健康及其在環(huán)境中的適應(yīng)能力息息相關(guān)[15]。目前，已發(fā)展了基于斑馬魚等小型模式魚運動行為的多種測試方法。而近年來，由于行為軌跡分析系統(tǒng)的開發(fā)，更使得斑馬魚游泳行為檢測在毒理學(xué)測試，特別是高通量篩選中擁有廣闊的應(yīng)用前景[16]。開展本項實驗需要有專門的行為軌跡分析設(shè)備，比如Zebralab高通量行為分析儀(ViewPoint Life Sciences, France)，也有研究人員自制行為記錄分析系統(tǒng)[17]。可采用受精卵或者剛孵化的斑馬魚幼魚進行暴露，并對幼魚進行自由游泳或者明暗光刺激下的行為檢測。實驗毒物可選擇乙醇，其為已知的神經(jīng)毒物，在低濃度有神經(jīng)興奮效應(yīng)，而高濃度則有神經(jīng)抑制效應(yīng)[18]。

實驗方法簡介：以剛孵化的斑馬魚幼魚為例。按等比間距設(shè)置3～5個污染物濃度，每個濃度至少3個平行，每個平行至少10條幼魚。在暴露3 d后，將斑馬魚轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔一尾，并更換暴露液為曝氣自來水或者稀釋水(假如暴露液不影響行為分析儀的圖像采集，也可不必更換)?？装逯糜谛袨榉治鰞x中進行測試，記錄自由游泳和在光周期下的游泳行為。一般而言，測定神經(jīng)毒性時所設(shè)定的濃度應(yīng)該不會導(dǎo)致致死效應(yīng)或者其他發(fā)育畸形，因此分析結(jié)果時需剔除死亡和不能正常發(fā)育幼魚的行為數(shù)據(jù)[19]。

必須注意：游泳行為的改變也可能是其他毒作用模式所導(dǎo)致，比如化合物影響肌肉組織發(fā)育，或者影響視力從而改變其對光刺激的反應(yīng)等等。以此為例，也可以加深學(xué)生關(guān)于毒理學(xué)終點特異性的理解。

此外，對于神經(jīng)毒性，檢測乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)的活性也是經(jīng)典方法[19]。毒物可選擇有機磷農(nóng)藥等。對于幼魚，可以選擇整體勻漿；而對于成魚，可單獨分離腦組織，并進行后續(xù)的酶活測定?？紤]到生態(tài)毒理學(xué)中有一大類以酶活為生物標(biāo)志物的經(jīng)典研究方法，該實驗有助于學(xué)生掌握其原理和實驗步驟，對于未配備小型模式魚行為檢測系統(tǒng)的實驗室而言，是一個很好的選擇。

2.4 內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的檢測——幼魚卵黃蛋白原的誘導(dǎo)實驗

在現(xiàn)有的內(nèi)分泌干擾物清單中，以雌激素受體激動劑最為典型。卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)，作為雌激素受體激動劑暴露最為經(jīng)典的生物標(biāo)志物，其在幼魚或者雄魚中的表達可有效指示環(huán)境中相關(guān)化合物的存在，并已發(fā)展了一套成熟的檢測方法[20-21]。在本實驗中，可選擇幼魚為實驗對象?；衔锟蛇x擇人工合成的雌激素，比如己烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)，其為口服避孕藥的主要成分，或者雙酚A(bisphenol A, BPA)，其曾廣泛使用于食品包裝和容器內(nèi)壁涂裝中[4]。在實踐中，可以通過反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測斑馬魚幼魚在暴露后體內(nèi)vtg基因mRNA的誘導(dǎo)水平，或者通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測相應(yīng)的Vtg蛋白，也可使用商業(yè)化的試劑盒，比如Cayman Chemical公司的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒等。該實驗可以向?qū)W生直觀地闡述有關(guān)生物標(biāo)志物的相關(guān)概念，以及目前各種分子生物學(xué)檢測手段在生態(tài)毒理學(xué)中的廣泛應(yīng)用。

實驗方法簡介：以qRT-PCR檢測vtg基因的mRNA水平為例?；衔锇吹缺乳g距設(shè)置3～5個濃度，每個濃度至少3個平行?？紤]到能否提取足夠的mRNA進行后續(xù)實驗，每個平行幼魚(3 dpf)數(shù)量至少為20條。暴露3 d后，幼魚整體勻漿，提取總RNA，進行cDNA第一鏈合成，并進行qRT-PCR分析。以肌動蛋白-actin為管家基因，測定vtg相對轉(zhuǎn)錄水平[21]?？赡艿脑挘瑫r測定雌激素受體(estrogen receptor,er)的轉(zhuǎn)錄水平，并從er和vtg的相關(guān)性上使學(xué)生對于此類內(nèi)分泌干擾物的作用機理有更深入理解。

2.5 免疫毒性的檢測——幼魚中性粒細(xì)胞遷移實驗

環(huán)境中的污染物暴露可引起免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或功能的損害[22]。由于免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，有關(guān)免疫毒性的檢測有很多方法。對于魚類而言，先天免疫系統(tǒng)的作用至關(guān)重要。因此，本實驗針對先天免疫系統(tǒng)的中性粒細(xì)胞，通過測定其遷移能力來評價化合物對于斑馬魚免疫系統(tǒng)的影響。實驗選用轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(mpx:EGFP)，其中性粒細(xì)胞由熒光蛋白特異性標(biāo)記，在熒光顯微鏡下可清楚觀察到幼魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞的行為[23]。實驗中通過幼魚尾鰭斷尾，或者手術(shù)造成其他機械損傷，使得中性粒細(xì)胞大量遷移到傷口處，而部分化合物的毒性作用可能改變傷口周圍的中性粒細(xì)胞數(shù)量，從而體現(xiàn)其對免疫系統(tǒng)的損害。在實驗中可選用糖皮質(zhì)激素類化合物，其為臨床上通用的消炎劑和免疫抑制劑[24]，效應(yīng)顯著。同時，選擇此類化合物也可向?qū)W生強化藥品和個人護理品(pharmaceutical and personal care products, PPCPs)對生態(tài)環(huán)境的潛在危害這一概念。

實驗方法簡介：以地塞米松的免疫抑制效應(yīng)為例。轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚(3 dpf)在體視顯微鏡下切斷尾鰭后[25]，進行化合物暴露。化合物按等比間距設(shè)置3～5個濃度，每個濃度至少3個平行，每個平行10條幼魚。在暴露后的12、24、48、72 h定時統(tǒng)計遷移到傷口周圍一定面積內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)量，從而闡明糖皮質(zhì)激素類化合物對魚類免疫系統(tǒng)的抑制作用。

如果購買轉(zhuǎn)基因斑馬魚有困難的話，則可利用蘇丹黑(Sudan black)染色檢測中性粒細(xì)胞在傷口處的招募和遷移[26]。此外，也可通過qRT-PCR檢測免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。以細(xì)胞因子為例，可檢測促炎因子IL-6、TNF，抗炎因子IL-10，調(diào)控因子NFκB，以及趨化因子CC-chem等等[27]。

2.6 遺傳毒性檢測——成魚紅細(xì)胞微核實驗

微核實驗可指示染色體損傷，已成為檢測環(huán)境污染物致突變效應(yīng)的有效手段。諸如蠶豆根尖、紫露草、哺乳動物骨髓等，均是常規(guī)使用的生物材料[13]。不同于哺乳類，魚類的成熟紅細(xì)胞依然存在細(xì)胞核，因此可進行微核實驗，從而用于檢測水體中可能的致突變物質(zhì)?？紤]到血量，宜選用成魚進行實驗。實驗毒物可選用重鉻酸鉀(或者絲裂霉素C)。

實驗方法簡介：化合物按等比間距設(shè)置3～5個濃度，每個濃度至少3個平行，每個平行10尾成魚。在暴露7 d后，按常規(guī)方法尾部采血、涂片、染色(可采用吉姆薩Giemsa或吖啶橙染色)，鏡檢后記錄微核率即可。

此外，也可采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(single cell gel electrophoresis, SCGE)，又名彗星實驗，其可在單細(xì)胞水平上檢測DNA損傷與修復(fù)[13]。以斑馬魚活體暴露為例，其實驗流程為：斑馬魚暴露后，按常規(guī)方法尾部采血，細(xì)胞懸液與瓊脂糖混合后鋪膠，裂解后置于水平電泳槽中進行DNA解旋，之后電泳。電泳時DNA斷片向陽極遷移，形成特征性彗星尾部，可在染色(如用溴化乙錠)后觀察。彗尾中DNA含量越多，表明DNA受損越嚴(yán)重。此外，也可采血制備單細(xì)胞懸液后再進行體外暴露。詳細(xì)的實驗步驟可參考孔志明主編的《環(huán)境毒理學(xué)》(第五版)[13]。

2.7 綜合性或者設(shè)計性實驗——未知化合物或者環(huán)境水體的毒性檢測

上述實驗均針對某一特定毒作用模式，而在實際工作中，需要檢測毒性和作用模式未知的化合物，或者需要對環(huán)境水體(比如，城市污水或者工業(yè)廢水)的生物毒性做出綜合評價[4]。因此，授課教師可就以上實驗?zāi)繕?biāo)，設(shè)置綜合性或者設(shè)計性實驗，讓學(xué)生運用所掌握的基礎(chǔ)知識和實驗技能，利用上述基于斑馬魚的水生生態(tài)毒性實驗方法，并結(jié)合其他研究手段，發(fā)揮主觀能動性，自主設(shè)計實驗方案，擬定實驗步驟，并對結(jié)果進行科學(xué)有效的整理和分析。在此過程中，不但可以鞏固學(xué)生對于所學(xué)的實驗原理和方法的掌握程度，更可以培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)造性思維和獨立進行科研的能力。

3 結(jié)論和展望(Conclusion and expectation)

斑馬魚作為實驗動物，符合目前所推崇的3R原則(Reduction減少、Replace替代、Refinement優(yōu)化)[28]。相關(guān)的毒性數(shù)據(jù)不但能夠為水生生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)安全性評價提供有效的參考，而且可合理外推至哺乳類乃至人類，具有重要的科學(xué)意義。上述一系列實驗雖都基于斑馬魚這一種實驗動物，但涵蓋了不同生物學(xué)層面的多個毒理學(xué)終點，可以充分訓(xùn)練學(xué)生的實驗技能，使其進一步鞏固所學(xué)的理論知識。在實驗內(nèi)容的編排上由易而難，兼顧基礎(chǔ)和前沿，授課教師可酌情增刪，以滿足本科乃至研究生教學(xué)的要求。同時，所設(shè)置的綜合性或者設(shè)計性實驗，更能全面提高學(xué)生的綜合科研素質(zhì)，有利于高級應(yīng)用型人才的培養(yǎng)。

當(dāng)然，水生生態(tài)毒理學(xué)內(nèi)涵豐富，研究手段多樣。在實際教學(xué)中，授課教師可以結(jié)合初級生產(chǎn)者(如銅綠微囊藻(原核生物)和小球藻(真核生物))、維管植物(如浮萍)、無脊椎動物(如大型溞)、兩棲類動物(如爪蟾)等不同模式生物或者其他本地特有物種，針對不同脅迫設(shè)定毒理學(xué)終點，建立實驗方法，豐富實驗教學(xué)體系，從而推進我國生態(tài)毒理學(xué)教學(xué)的進一步發(fā)展。

通訊作者簡介：錢海豐(1973-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為生態(tài)毒理學(xué)，主持國家自然科學(xué)基金(5項)，浙江省杰出青年基金等項目。已發(fā)表SCI論文70余篇，被SCI源期刊引用1300余次。

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