榮雅昕，王英超，張耀方，盧順?gòu)?，周倩，陳慧?/p>

（天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384）

SUMO是存在于真核生物中起相關(guān)修飾作用的一類蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)運、相互作用，維持基因完整性等多種功能[1-3]。SUMO家族有4個成員，其蛋白長度略有差別：SUMO1由101個氨基酸組成，SUMO2有103個氨基酸，而SUMO3和SUMO4只有95個氨基酸。目前，對SUMO家族成員的研究已經(jīng)成為今后一段時期的研究熱點。

1 SUMO融合表達系統(tǒng)的優(yōu)點[4]

與傳統(tǒng)的蛋白融合標(biāo)簽，如多聚組氨酸標(biāo)記、融合八個氨基酸的親水性多肽、麥芽糖結(jié)合蛋白等相比，SUMO融合表達系統(tǒng)除了具備促進可溶性的特性外，還具有以下優(yōu)點。

1.1 抗蛋白酶降解

在細胞內(nèi)，蛋白酶解受到嚴(yán)密調(diào)控，重組的蛋白質(zhì)極易被降解。以SUMO作為融合標(biāo)簽進行表達時，可以降低細胞內(nèi)蛋白酶的敏感性，提高融合蛋白的穩(wěn)定性。

1.2 提高蛋白的折疊率

大腸桿菌大量表達含有二硫鍵的蛋白時，常形成錯誤的非活性包涵體結(jié)構(gòu)。以SUMO作為融合標(biāo)簽在大腸桿菌中進行表達，可以增強融合蛋白的溶解性，提高蛋白質(zhì)的折疊率。

1.3 提高重組蛋白表達量

蛋白質(zhì)的表達量與多種因素相關(guān)，而重組蛋白的表達量與轉(zhuǎn)錄的延伸、翻譯的加強緊密相關(guān)。以SUMO作為融合標(biāo)簽進行表達，能夠在一定程度上抵抗蛋白酶的降解，促進蛋白質(zhì)的折疊，從而間接地提高了蛋白質(zhì)的表達量。王中原[5]研究發(fā)現(xiàn)，人SUMO01、SUMO02融合標(biāo)簽改善了基質(zhì)金屬蛋白酶13的可溶性，增強了綠色熒光蛋白的表達水平和可溶性。武陽[6]發(fā)現(xiàn)MT在SUMO融合表達系統(tǒng)中表達量更高。

1.4 無誤地切除融合標(biāo)簽且快速高效，酶切條件寬松

SUMO作為表達標(biāo)簽，酶切后得到的蛋白質(zhì)保持了天然結(jié)構(gòu)，便于日后的功能分析。酶切條件寬松（溫度4～37 ℃，pH5.5～10.5、2mol/L尿素），切除快速高效，準(zhǔn)確無誤。

2 原核生物中的SUMO融合表達

SUMO融合表達系統(tǒng)因種種優(yōu)勢，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于以大腸桿菌為代表的原核表達系統(tǒng)中。Li等在中國家蠶中分離出抗菌肽CM4，通過rPCR克隆到pET32a載體上，構(gòu)建了融合表達質(zhì)粒。使用SUMO蛋白酶進行切割，效率達到90%以上[7]。某些抗菌肽，如IDR1、MX226、LL37、CRAMP、HHC-10和E5等對大腸桿菌具有毒性，不適宜與大腸桿菌融合進行融合表達。SUMO融合標(biāo)簽則完美地解決了這一問題，該融合標(biāo)簽可以有效屏蔽抗菌肽對宿主菌的毒性。SUMO也應(yīng)用于多聚體表達，JF Li等[8]為了提高CM4在大腸桿菌中的表達水平，對CM4基因串聯(lián)重復(fù)序列分別克隆到表達載體pSUMO上構(gòu)建出新的表達載體pSUMO-2CM4。融合蛋白SUMO-2CM4經(jīng)鎳柱螯合層析純化，用鹽酸羥胺裂解釋放重組CM4，102L培養(yǎng)物中獲得4802mg重組CM4，純度大于96%。此外，SUMO也可以與硫氧還蛋白作為融合標(biāo)簽共同使用。Li[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，在SUMO/肽的連接點，LL-37抗菌肽被SUMO蛋白酶裂解產(chǎn)生N-末端。利用凝膠色譜分離釋放出的肽段。平均每1 L細菌培養(yǎng)能夠得到2.4mg抗菌肽。質(zhì)譜分析證明，重組肽的分子量在理論上是預(yù)期的。所產(chǎn)生的肽對大腸桿菌K-12具有抗菌活性。SUMO融合表達在枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中同樣得到很好的應(yīng)用。Chen等[10]融合了抗菌肽基因與小泛素樣修飾（SUMO）基因和基因信號肽，在枯草芽孢桿菌表達構(gòu)建了一種基于操縱子基因修飾的枯草芽孢桿菌細胞系統(tǒng)。包括異丙基-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)的啟動子Spac、amyQ信號肽、SUMO蛋白酶基因。從1L培養(yǎng)的上清液中可以分離純化出30.6mg的重組蛋白，純化的抗菌肽AD對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性較強。肖亮[11]以4種人源SUMO蛋白作為融合標(biāo)簽，構(gòu)建4種融合表達載體—pSl、pS2、pS3、pS4。比較4種SUMO-tag促表達和促溶效果的高低，研究發(fā)現(xiàn)，以SUMO1作為融合標(biāo)簽時，對于P53和GFP兩種重組蛋白的促表達和促溶效果是最好的。有切割的SENPICP53和GFP兩種重組蛋白的促表達和促具有較好的可溶性。張杰[12]建立了一種新的在大腸桿菌中促蛋白可溶性高效表達系統(tǒng)。ELP-SUMO融合蛋白大多數(shù)以可溶形式表達，質(zhì)譜結(jié)果表明得到的重組蛋白分子量與天然蛋白一樣，目的蛋白具有活力。

3 真核生物中的SUMO融合表達

利用大腸桿菌作為宿主菌進行表達時，常出現(xiàn)蛋白質(zhì)錯誤折疊、蛋白質(zhì)降解和溶解度低的情況。真核生物在蛋白表達時，會利用自身的蛋白酶進行校正，減少了錯誤的發(fā)生。真核生物細胞內(nèi)存在內(nèi)源SUMO蛋白酶，會切除SUMO融合蛋白，限制了SUMO作為融合標(biāo)簽的應(yīng)用[13-14]。為了解決此類問題，Butt等[15]制備了一種納米結(jié)構(gòu)水溶膠的自組裝肽。利用自身誘導(dǎo)方法在pET載體上成功表達SUMO融合蛋白。親和層析純化融合蛋白，SUMO蛋白酶用反相高效液相色譜法回收水中的肽。結(jié)果表明，融合蛋白產(chǎn)量高，β-結(jié)構(gòu)肽效率高。由SUMO蛋白酶釋放出來產(chǎn)生的不含額外氨基酸殘基的肽，回收率為46%～99%。此外，Lifesensors公司相繼開發(fā)出SUMOstar蛋白酶1和SUMOpro蛋白酶2，以此突破SUMO作為融合標(biāo)簽在真核生物外源蛋白表達時的障礙。Liu等[15]開發(fā)了一種可獲得的SUMOstar融合標(biāo)簽，測試了幾種鼠UBP43、人類胰蛋白酶βⅡ、USP4、USP15和GFP蛋白質(zhì)在昆蟲內(nèi)的表達。研究結(jié)果表明，SUMOstar融合蛋白的表達水平與之前相比至少增強4倍，證明SUMOstar融合標(biāo)簽可以有效阻止細胞內(nèi)SUMO蛋白酶的切割，并在一定程度上增加蛋白的表達。

4 結(jié)語

盡管SUMO在蛋白表達方面具有良好的優(yōu)勢，但將其規(guī)?；瘧?yīng)用還具有一定的限制性。在某些方面，它的蛋白表達水平仍然低于其他的融合標(biāo)簽，今后有關(guān)SUMO的表達應(yīng)用還需進一步摸索。

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