李紅民，李冬民，步懷宇，徐敏，余源，陳富林

（1.西北大學(xué) 分子生物學(xué)課程組，西北大學(xué) 陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北大學(xué) 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710069；2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，西安交通大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061）

限制性內(nèi)切酶水解實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)專業(yè)本科生必修的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本內(nèi)容之一，是從事生物學(xué)研究與工作必須掌握的基本技能。為了幫助學(xué)生利用一次簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)學(xué)到更多的知識(shí)、培養(yǎng)更多的技能，筆者嘗試將探究式教學(xué)用于限制性內(nèi)切酶水解實(shí)驗(yàn)，通過(guò)設(shè)置情境問(wèn)題、啟發(fā)思考、調(diào)動(dòng)討論、課后思考與拓展閱讀等環(huán)節(jié)，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中獲得足夠多的知識(shí)信息。

1 研究對(duì)象

西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2014—2016年生物科學(xué)與生物科學(xué)基地班三年級(jí)本科生，每個(gè)實(shí)驗(yàn)班20～24人，其中生物科學(xué)基地班進(jìn)行傳統(tǒng)講授教學(xué)、生物科學(xué)班進(jìn)行探究學(xué)習(xí)。

2 教學(xué)內(nèi)容與環(huán)節(jié)

2.1 教學(xué)內(nèi)容

限制性內(nèi)切酶水解實(shí)驗(yàn)是將選定的限制性內(nèi)切酶、底物DNA（質(zhì)粒DNA）、反應(yīng)緩沖液等按照比例構(gòu)建酶切反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí)間的酶切處理，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切作用后質(zhì)粒DNA分子的變化[1]。

以傳統(tǒng)講授進(jìn)行授課的生物科學(xué)基地班，其授課內(nèi)容由限制性內(nèi)切酶作用機(jī)理、限制酶的種類、命名與應(yīng)用、酶的保存、移液器基本操作、儀器設(shè)備的使用、酶切體系的構(gòu)建、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察與分析組成；以探究教學(xué)進(jìn)行授課的生物科學(xué)班，其授課內(nèi)容除傳統(tǒng)教學(xué)內(nèi)容外，增加圍繞限制性內(nèi)切酶作用結(jié)果分析、酶的選擇（基因工程實(shí)際應(yīng)用舉例）、反應(yīng)緩沖液的選擇、限制性內(nèi)切酶與遺傳多態(tài)性分析等問(wèn)題的情境討論學(xué)習(xí)。

2.2 教學(xué)環(huán)節(jié)

教學(xué)環(huán)節(jié)由實(shí)驗(yàn)前傳統(tǒng)講授、學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作、酶切處理期間進(jìn)行探究學(xué)習(xí)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察與分析4部分組成。

3 教學(xué)環(huán)節(jié)的實(shí)施

3.1 傳統(tǒng)講授

實(shí)驗(yàn)開始之前，由教師與學(xué)生一起回顧理論課堂學(xué)習(xí)的相關(guān)知識(shí)，加深對(duì)限制性內(nèi)切酶的定義、分類、命名以及酶作用特點(diǎn)的理解。結(jié)合生物化學(xué)中酶學(xué)理論知識(shí)，強(qiáng)調(diào)溫度、離子條件、pH等對(duì)限制性內(nèi)切酶催化活性和穩(wěn)定性的影響以及控制這些條件的方法與途徑。例如，離子條件、pH可以通過(guò)自行添加于反應(yīng)體系或使用試劑供應(yīng)商出售限制性內(nèi)切酶時(shí)提供的反應(yīng)緩沖液予以控制，而溫度則可以使用恒溫水浴或孵箱控制。強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)，特別是非特異性核酸酶污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的可能影響以及避免污染的途徑。

3.2 學(xué)生獨(dú)立實(shí)驗(yàn)

限制性內(nèi)切酶水解實(shí)驗(yàn)的操作由微量酶切體系的構(gòu)建、適當(dāng)溫度下保溫酶切和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)觀察酶切結(jié)果三部分構(gòu)成。操作過(guò)程中，由教師不斷巡視、檢查每個(gè)同學(xué)的基本操作，督促學(xué)生反復(fù)練習(xí)移液器的使用，熟悉培養(yǎng)箱、水浴鍋、電泳槽等儀器的使用及注意事項(xiàng)。

3.3 探究學(xué)習(xí)

探究學(xué)習(xí)的關(guān)鍵與核心是設(shè)置問(wèn)題情境，是教師引導(dǎo)學(xué)生探究學(xué)習(xí)的關(guān)鍵。圍繞實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，設(shè)置難易適中的問(wèn)題，以自由討論的形式開展探究分析。在限制性內(nèi)切酶水解實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，設(shè)置3個(gè)主要問(wèn)題情境。

（1）關(guān)于限制性內(nèi)切酶作用結(jié)果分析。面向本科生開設(shè)的限制性內(nèi)切酶水解實(shí)驗(yàn)，通常采用質(zhì)粒DNA樣品，其相對(duì)分子質(zhì)量和酶切位點(diǎn)已知。酶切處理混合物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)DNA樣品被酶水解后，產(chǎn)生了一些大小不等的片段，這就是酶切結(jié)果[2]。這樣的酶切結(jié)果能夠提供給實(shí)驗(yàn)者的信息是什么（作用結(jié)果分析）？圍繞該問(wèn)題情境，組織同學(xué)分組討論，被探究的相關(guān)問(wèn)題如下：①根據(jù)電泳結(jié)果，質(zhì)粒DNA分子被單酶切水解產(chǎn)生了一個(gè)大小與質(zhì)粒DNA一樣的片段，說(shuō)明質(zhì)粒DNA中有幾個(gè)該酶的切割位點(diǎn)？②如果產(chǎn)生2個(gè)大小不同、但2個(gè)片段的大小之和等于質(zhì)粒DNA分子大小，說(shuō)明質(zhì)粒DNA分子中存在幾個(gè)該酶的切割位點(diǎn)？③如果產(chǎn)生了1個(gè)片段，但其大小僅有質(zhì)粒DNA分子大小的一半，說(shuō)明質(zhì)粒DNA分子大小存在幾個(gè)該酶切割位點(diǎn)、切割位點(diǎn)之間的距離如何？④如果被作用的底物DNA分子是線狀的，被單酶切、雙酶切處理后，又會(huì)產(chǎn)生什么樣的電泳結(jié)果？⑤同一種或者兩種以上的酶作用于不同DNA樣品，產(chǎn)生了相同的電泳圖譜，從這樣的水解結(jié)果又可以得到什么樣的信息？⑥對(duì)于已知的共價(jià)閉合雙鏈質(zhì)粒DNA分子，若其中僅有一個(gè)限制性內(nèi)切酶A的作用位點(diǎn)，被酶A作用后，產(chǎn)生幾個(gè)片段？⑦當(dāng)一種限制性內(nèi)切酶作用于哺乳動(dòng)物基因組時(shí)，會(huì)產(chǎn)生怎樣的結(jié)果？⑧當(dāng)雙螺旋DNA變性為單鏈狀態(tài)的DNA分子，是否還能被原本可作用的限制性內(nèi)切酶切割？⑨反應(yīng)體系中酶的用量是不是越多越好？討論過(guò)程中，適時(shí)建議學(xué)生通過(guò)簡(jiǎn)單作圖示意可能的酶切結(jié)果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)的信息。

（2）關(guān)于酶的選擇（基因工程實(shí)際應(yīng)用）。限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以來(lái)，最主要的用途是在基因研究中對(duì)DNA分子進(jìn)行人為的遺傳操作，實(shí)現(xiàn)目的片段的克隆化、保存及充足的用于基因功能、外源表達(dá)等研究的材料。為實(shí)現(xiàn)基因操作的目的，如何選擇添加在DNA片段上下游的酶切位點(diǎn)？圍繞該問(wèn)題情境，組織同學(xué)分組討論，在教師的啟發(fā)下，被探究的相關(guān)問(wèn)題如下：①為什么要加酶切位點(diǎn)？②選擇酶切位點(diǎn)時(shí)，要不要考慮載體中存在的酶切位點(diǎn)、選擇什么樣的酶切位點(diǎn)、選擇的酶切位點(diǎn)是否會(huì)影響載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制、穩(wěn)定性以及外源基因的表達(dá)效率？③選擇酶切位點(diǎn)時(shí)，是否需要考慮被操作基因片段中存在的酶切位點(diǎn)，選擇的標(biāo)準(zhǔn)是什么？④當(dāng)把基因片段從克隆載體亞克隆到一個(gè)表達(dá)載體中時(shí)，是否可以直接通過(guò)酶切和連接重組實(shí)現(xiàn)，是否會(huì)有不妥，解決的方法有哪些？

（3）關(guān)于反應(yīng)緩沖液的選擇。限制性內(nèi)切酶與其他蛋白質(zhì)性質(zhì)的酶一樣，其催化活性需要合適的溫度、離子條件、pH等環(huán)境條件以發(fā)揮最大催化活性[3]。啟發(fā)同學(xué)討論：當(dāng)在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行雙酶切（基因工程常規(guī)操作）乃至三酶切時(shí)，上述條件怎樣同時(shí)滿足不同酶的最適作用條件、而溫度條件又怎樣滿足？

探究學(xué)習(xí)結(jié)束時(shí)，通過(guò)即時(shí)考查鞏固學(xué)習(xí)效果，鼓勵(lì)有興趣的學(xué)生積極開展課后拓展閱讀，鼓勵(lì)學(xué)生根據(jù)探究學(xué)習(xí)的收獲自主分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 探究學(xué)習(xí)的實(shí)踐效果

探究式教學(xué)實(shí)踐已在限制性內(nèi)切酶水解實(shí)驗(yàn)中連續(xù)開展了3年，圍繞酶切作用結(jié)果分析的情境問(wèn)題討論，可以很好地引導(dǎo)學(xué)生利用理論知識(shí)分析各種不同的酶切作用結(jié)果，并對(duì)實(shí)驗(yàn)并未涉及的酶切處理結(jié)果進(jìn)行分析，明晰實(shí)驗(yàn)結(jié)果、結(jié)果分析和結(jié)論的區(qū)別，無(wú)形中提高學(xué)生獨(dú)立分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果、學(xué)以致用的能力；圍繞酶的選擇、緩沖液的選擇的情境問(wèn)題討論，可以更好地幫助學(xué)生理解酶作為生物催化劑的高效性和作用條件對(duì)酶活性的影響，了解限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于離體條件下進(jìn)行基因操作的重要性，引導(dǎo)學(xué)生較好地學(xué)習(xí)進(jìn)行基因功能研究、外源基因表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)選擇可操作的限制性內(nèi)切酶的一般原則、方法和技巧[4]。結(jié)合即時(shí)在線文獻(xiàn)查閱和課后擴(kuò)展閱讀，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證理論知識(shí)的同時(shí)拓展知識(shí)面，完全超越“進(jìn)實(shí)驗(yàn)室、按步驟操作、看個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果、寫個(gè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告”的學(xué)習(xí)狀態(tài)，切實(shí)提高獨(dú)立操作、獨(dú)立觀察、獨(dú)立思考、獨(dú)立分析等實(shí)際能力。3年的實(shí)踐教學(xué)顯示，進(jìn)行探究式教學(xué)的生物科學(xué)班學(xué)生中，能夠比較熟練地解答考查問(wèn)題和正確判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的學(xué)生比例大幅度升高，明顯高于接受傳統(tǒng)講授的生物科學(xué)基地班（基地班的平均高考入學(xué)成績(jī)高于生物科學(xué)班），而難以正確判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果和難以解答問(wèn)題的學(xué)生人數(shù)明顯降低，這與其他學(xué)者的觀察結(jié)果一致。

5 結(jié)語(yǔ)

探究學(xué)習(xí)在限制性內(nèi)切酶水解實(shí)驗(yàn)中的教學(xué)實(shí)踐表明，探究學(xué)習(xí)中的啟發(fā)、思考、討論等訓(xùn)練，能夠開拓學(xué)生思路，顯著提高多數(shù)學(xué)生的思維活躍度，將理論知識(shí)與實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、問(wèn)題解析等相聯(lián)系，實(shí)現(xiàn)學(xué)以致用，切實(shí)提高本科生的科學(xué)素養(yǎng)和培養(yǎng)質(zhì)量。

[1]Byrne A, McNeill J, Rogers K, et al. Impact of Enquiry Based Learning(EBL) on Student Midwife Praxis[J]. Midwifery,2018, 58: 83-85

[2]Yoon H, Joung YJ, Kim M. The Challenges of Science Inquiry Teaching for Pre-service Teachers in Elementary Classrooms: Difficulties on and under the scene[J]. Research in Science & Technological Education,2012,42(3)：589-608.

[3]Dobber M, Zwart R, Tanis M, et al. Literature Review: The Role of the Teacher in Inquiry-based Education[J]. Educational Research Review,2017,22:194-214.

[4]Meijerman I, Nab J, Koster AS. Designing and implementing an inquirybased undergraduate curriculum in pharmaceutical sciences. Currents in Pharmacy Teaching and Learning,2016,8:905-919.