李紅民，李冬民，步懷宇，徐敏，余源，陳富林

（1.西北大學 分子生物學課程組，西北大學 陜西省生物技術(shù)重點實驗室，西北大學 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，陜西西安 710069；2.西安交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學部，西安交通大學 生物化學與分子生物學系，陜西西安 710061）

限制性內(nèi)切酶水解實驗是生物學專業(yè)本科生必修的分子生物學實驗基本內(nèi)容之一，是從事生物學研究與工作必須掌握的基本技能。為了幫助學生利用一次簡單實驗學到更多的知識、培養(yǎng)更多的技能，筆者嘗試將探究式教學用于限制性內(nèi)切酶水解實驗，通過設(shè)置情境問題、啟發(fā)思考、調(diào)動討論、課后思考與拓展閱讀等環(huán)節(jié)，使學生在實驗中獲得足夠多的知識信息。

1 研究對象

西北大學生命科學學院2014—2016年生物科學與生物科學基地班三年級本科生，每個實驗班20～24人，其中生物科學基地班進行傳統(tǒng)講授教學、生物科學班進行探究學習。

2 教學內(nèi)容與環(huán)節(jié)

2.1 教學內(nèi)容

限制性內(nèi)切酶水解實驗是將選定的限制性內(nèi)切酶、底物DNA（質(zhì)粒DNA）、反應(yīng)緩沖液等按照比例構(gòu)建酶切反應(yīng)體系，經(jīng)過適當時間的酶切處理，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切作用后質(zhì)粒DNA分子的變化[1]。

以傳統(tǒng)講授進行授課的生物科學基地班，其授課內(nèi)容由限制性內(nèi)切酶作用機理、限制酶的種類、命名與應(yīng)用、酶的保存、移液器基本操作、儀器設(shè)備的使用、酶切體系的構(gòu)建、實驗注意事項以及實驗結(jié)果觀察與分析組成；以探究教學進行授課的生物科學班，其授課內(nèi)容除傳統(tǒng)教學內(nèi)容外，增加圍繞限制性內(nèi)切酶作用結(jié)果分析、酶的選擇（基因工程實際應(yīng)用舉例）、反應(yīng)緩沖液的選擇、限制性內(nèi)切酶與遺傳多態(tài)性分析等問題的情境討論學習。

2.2 教學環(huán)節(jié)

教學環(huán)節(jié)由實驗前傳統(tǒng)講授、學生進行實驗操作、酶切處理期間進行探究學習以及實驗結(jié)果觀察與分析4部分組成。

3 教學環(huán)節(jié)的實施

3.1 傳統(tǒng)講授

實驗開始之前，由教師與學生一起回顧理論課堂學習的相關(guān)知識，加深對限制性內(nèi)切酶的定義、分類、命名以及酶作用特點的理解。結(jié)合生物化學中酶學理論知識，強調(diào)溫度、離子條件、pH等對限制性內(nèi)切酶催化活性和穩(wěn)定性的影響以及控制這些條件的方法與途徑。例如，離子條件、pH可以通過自行添加于反應(yīng)體系或使用試劑供應(yīng)商出售限制性內(nèi)切酶時提供的反應(yīng)緩沖液予以控制，而溫度則可以使用恒溫水浴或孵箱控制。強調(diào)實驗注意事項，特別是非特異性核酸酶污染對實驗結(jié)果產(chǎn)生的可能影響以及避免污染的途徑。

3.2 學生獨立實驗

限制性內(nèi)切酶水解實驗的操作由微量酶切體系的構(gòu)建、適當溫度下保溫酶切和瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察酶切結(jié)果三部分構(gòu)成。操作過程中，由教師不斷巡視、檢查每個同學的基本操作，督促學生反復練習移液器的使用，熟悉培養(yǎng)箱、水浴鍋、電泳槽等儀器的使用及注意事項。

3.3 探究學習

探究學習的關(guān)鍵與核心是設(shè)置問題情境，是教師引導學生探究學習的關(guān)鍵。圍繞實驗內(nèi)容，設(shè)置難易適中的問題，以自由討論的形式開展探究分析。在限制性內(nèi)切酶水解實驗中，針對實驗?zāi)康?，設(shè)置3個主要問題情境。

（1）關(guān)于限制性內(nèi)切酶作用結(jié)果分析。面向本科生開設(shè)的限制性內(nèi)切酶水解實驗，通常采用質(zhì)粒DNA樣品，其相對分子質(zhì)量和酶切位點已知。酶切處理混合物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)DNA樣品被酶水解后，產(chǎn)生了一些大小不等的片段，這就是酶切結(jié)果[2]。這樣的酶切結(jié)果能夠提供給實驗者的信息是什么（作用結(jié)果分析）？圍繞該問題情境，組織同學分組討論，被探究的相關(guān)問題如下：①根據(jù)電泳結(jié)果，質(zhì)粒DNA分子被單酶切水解產(chǎn)生了一個大小與質(zhì)粒DNA一樣的片段，說明質(zhì)粒DNA中有幾個該酶的切割位點？②如果產(chǎn)生2個大小不同、但2個片段的大小之和等于質(zhì)粒DNA分子大小，說明質(zhì)粒DNA分子中存在幾個該酶的切割位點？③如果產(chǎn)生了1個片段，但其大小僅有質(zhì)粒DNA分子大小的一半，說明質(zhì)粒DNA分子大小存在幾個該酶切割位點、切割位點之間的距離如何？④如果被作用的底物DNA分子是線狀的，被單酶切、雙酶切處理后，又會產(chǎn)生什么樣的電泳結(jié)果？⑤同一種或者兩種以上的酶作用于不同DNA樣品，產(chǎn)生了相同的電泳圖譜，從這樣的水解結(jié)果又可以得到什么樣的信息？⑥對于已知的共價閉合雙鏈質(zhì)粒DNA分子，若其中僅有一個限制性內(nèi)切酶A的作用位點，被酶A作用后，產(chǎn)生幾個片段？⑦當一種限制性內(nèi)切酶作用于哺乳動物基因組時，會產(chǎn)生怎樣的結(jié)果？⑧當雙螺旋DNA變性為單鏈狀態(tài)的DNA分子，是否還能被原本可作用的限制性內(nèi)切酶切割？⑨反應(yīng)體系中酶的用量是不是越多越好？討論過程中，適時建議學生通過簡單作圖示意可能的酶切結(jié)果，并對結(jié)果進行分析，獲得相應(yīng)的信息。

（2）關(guān)于酶的選擇（基因工程實際應(yīng)用）。限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以來，最主要的用途是在基因研究中對DNA分子進行人為的遺傳操作，實現(xiàn)目的片段的克隆化、保存及充足的用于基因功能、外源表達等研究的材料。為實現(xiàn)基因操作的目的，如何選擇添加在DNA片段上下游的酶切位點？圍繞該問題情境，組織同學分組討論，在教師的啟發(fā)下，被探究的相關(guān)問題如下：①為什么要加酶切位點？②選擇酶切位點時，要不要考慮載體中存在的酶切位點、選擇什么樣的酶切位點、選擇的酶切位點是否會影響載體在宿主細胞中的復制、穩(wěn)定性以及外源基因的表達效率？③選擇酶切位點時，是否需要考慮被操作基因片段中存在的酶切位點，選擇的標準是什么？④當把基因片段從克隆載體亞克隆到一個表達載體中時，是否可以直接通過酶切和連接重組實現(xiàn)，是否會有不妥，解決的方法有哪些？

（3）關(guān)于反應(yīng)緩沖液的選擇。限制性內(nèi)切酶與其他蛋白質(zhì)性質(zhì)的酶一樣，其催化活性需要合適的溫度、離子條件、pH等環(huán)境條件以發(fā)揮最大催化活性[3]。啟發(fā)同學討論：當在同一反應(yīng)體系中進行雙酶切（基因工程常規(guī)操作）乃至三酶切時，上述條件怎樣同時滿足不同酶的最適作用條件、而溫度條件又怎樣滿足？

探究學習結(jié)束時，通過即時考查鞏固學習效果，鼓勵有興趣的學生積極開展課后拓展閱讀，鼓勵學生根據(jù)探究學習的收獲自主分析實驗結(jié)果。

4 探究學習的實踐效果

探究式教學實踐已在限制性內(nèi)切酶水解實驗中連續(xù)開展了3年，圍繞酶切作用結(jié)果分析的情境問題討論，可以很好地引導學生利用理論知識分析各種不同的酶切作用結(jié)果，并對實驗并未涉及的酶切處理結(jié)果進行分析，明晰實驗結(jié)果、結(jié)果分析和結(jié)論的區(qū)別，無形中提高學生獨立分析實驗結(jié)果、學以致用的能力；圍繞酶的選擇、緩沖液的選擇的情境問題討論，可以更好地幫助學生理解酶作為生物催化劑的高效性和作用條件對酶活性的影響，了解限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)對于離體條件下進行基因操作的重要性，引導學生較好地學習進行基因功能研究、外源基因表達載體構(gòu)建時選擇可操作的限制性內(nèi)切酶的一般原則、方法和技巧[4]。結(jié)合即時在線文獻查閱和課后擴展閱讀，使學生在實驗中驗證理論知識的同時拓展知識面，完全超越“進實驗室、按步驟操作、看個實驗結(jié)果、寫個實驗報告”的學習狀態(tài)，切實提高獨立操作、獨立觀察、獨立思考、獨立分析等實際能力。3年的實踐教學顯示，進行探究式教學的生物科學班學生中，能夠比較熟練地解答考查問題和正確判讀實驗結(jié)果的學生比例大幅度升高，明顯高于接受傳統(tǒng)講授的生物科學基地班（基地班的平均高考入學成績高于生物科學班），而難以正確判讀實驗結(jié)果和難以解答問題的學生人數(shù)明顯降低，這與其他學者的觀察結(jié)果一致。

5 結(jié)語

探究學習在限制性內(nèi)切酶水解實驗中的教學實踐表明，探究學習中的啟發(fā)、思考、討論等訓練，能夠開拓學生思路，顯著提高多數(shù)學生的思維活躍度，將理論知識與實驗現(xiàn)象、實驗結(jié)果、問題解析等相聯(lián)系，實現(xiàn)學以致用，切實提高本科生的科學素養(yǎng)和培養(yǎng)質(zhì)量。

[1]Byrne A, McNeill J, Rogers K, et al. Impact of Enquiry Based Learning(EBL) on Student Midwife Praxis[J]. Midwifery,2018, 58: 83-85

[2]Yoon H, Joung YJ, Kim M. The Challenges of Science Inquiry Teaching for Pre-service Teachers in Elementary Classrooms: Difficulties on and under the scene[J]. Research in Science & Technological Education,2012,42(3)：589-608.

[3]Dobber M, Zwart R, Tanis M, et al. Literature Review: The Role of the Teacher in Inquiry-based Education[J]. Educational Research Review,2017,22:194-214.

[4]Meijerman I, Nab J, Koster AS. Designing and implementing an inquirybased undergraduate curriculum in pharmaceutical sciences. Currents in Pharmacy Teaching and Learning,2016,8:905-919.