李紅民，李冬民，步懷宇，徐敏，余源，陳富林

（1.西北大學(xué) 分子生物學(xué)課程組，西北大學(xué) 陜西省生物技術(shù)重點實驗室，西北大學(xué) 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，陜西西安 710069；2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，西安交通大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，陜西西安 710061）

限制性內(nèi)切酶水解實驗是生物學(xué)專業(yè)本科生必修的分子生物學(xué)實驗基本內(nèi)容之一，是從事生物學(xué)研究與工作必須掌握的基本技能。為了幫助學(xué)生利用一次簡單實驗學(xué)到更多的知識、培養(yǎng)更多的技能，筆者嘗試將探究式教學(xué)用于限制性內(nèi)切酶水解實驗，通過設(shè)置情境問題、啟發(fā)思考、調(diào)動討論、課后思考與拓展閱讀等環(huán)節(jié)，使學(xué)生在實驗中獲得足夠多的知識信息。

1 研究對象

西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2014—2016年生物科學(xué)與生物科學(xué)基地班三年級本科生，每個實驗班20～24人，其中生物科學(xué)基地班進行傳統(tǒng)講授教學(xué)、生物科學(xué)班進行探究學(xué)習(xí)。

2 教學(xué)內(nèi)容與環(huán)節(jié)

2.1 教學(xué)內(nèi)容

限制性內(nèi)切酶水解實驗是將選定的限制性內(nèi)切酶、底物DNA（質(zhì)粒DNA）、反應(yīng)緩沖液等按照比例構(gòu)建酶切反應(yīng)體系，經(jīng)過適當(dāng)時間的酶切處理，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切作用后質(zhì)粒DNA分子的變化[1]。

以傳統(tǒng)講授進行授課的生物科學(xué)基地班，其授課內(nèi)容由限制性內(nèi)切酶作用機理、限制酶的種類、命名與應(yīng)用、酶的保存、移液器基本操作、儀器設(shè)備的使用、酶切體系的構(gòu)建、實驗注意事項以及實驗結(jié)果觀察與分析組成；以探究教學(xué)進行授課的生物科學(xué)班，其授課內(nèi)容除傳統(tǒng)教學(xué)內(nèi)容外，增加圍繞限制性內(nèi)切酶作用結(jié)果分析、酶的選擇（基因工程實際應(yīng)用舉例）、反應(yīng)緩沖液的選擇、限制性內(nèi)切酶與遺傳多態(tài)性分析等問題的情境討論學(xué)習(xí)。

2.2 教學(xué)環(huán)節(jié)

教學(xué)環(huán)節(jié)由實驗前傳統(tǒng)講授、學(xué)生進行實驗操作、酶切處理期間進行探究學(xué)習(xí)以及實驗結(jié)果觀察與分析4部分組成。

3 教學(xué)環(huán)節(jié)的實施

3.1 傳統(tǒng)講授

實驗開始之前，由教師與學(xué)生一起回顧理論課堂學(xué)習(xí)的相關(guān)知識，加深對限制性內(nèi)切酶的定義、分類、命名以及酶作用特點的理解。結(jié)合生物化學(xué)中酶學(xué)理論知識，強調(diào)溫度、離子條件、pH等對限制性內(nèi)切酶催化活性和穩(wěn)定性的影響以及控制這些條件的方法與途徑。例如，離子條件、pH可以通過自行添加于反應(yīng)體系或使用試劑供應(yīng)商出售限制性內(nèi)切酶時提供的反應(yīng)緩沖液予以控制，而溫度則可以使用恒溫水浴或孵箱控制。強調(diào)實驗注意事項，特別是非特異性核酸酶污染對實驗結(jié)果產(chǎn)生的可能影響以及避免污染的途徑。

3.2 學(xué)生獨立實驗

限制性內(nèi)切酶水解實驗的操作由微量酶切體系的構(gòu)建、適當(dāng)溫度下保溫酶切和瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察酶切結(jié)果三部分構(gòu)成。操作過程中，由教師不斷巡視、檢查每個同學(xué)的基本操作，督促學(xué)生反復(fù)練習(xí)移液器的使用，熟悉培養(yǎng)箱、水浴鍋、電泳槽等儀器的使用及注意事項。

3.3 探究學(xué)習(xí)

探究學(xué)習(xí)的關(guān)鍵與核心是設(shè)置問題情境，是教師引導(dǎo)學(xué)生探究學(xué)習(xí)的關(guān)鍵。圍繞實驗內(nèi)容，設(shè)置難易適中的問題，以自由討論的形式開展探究分析。在限制性內(nèi)切酶水解實驗中，針對實驗?zāi)康模O(shè)置3個主要問題情境。

（1）關(guān)于限制性內(nèi)切酶作用結(jié)果分析。面向本科生開設(shè)的限制性內(nèi)切酶水解實驗，通常采用質(zhì)粒DNA樣品，其相對分子質(zhì)量和酶切位點已知。酶切處理混合物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)DNA樣品被酶水解后，產(chǎn)生了一些大小不等的片段，這就是酶切結(jié)果[2]。這樣的酶切結(jié)果能夠提供給實驗者的信息是什么（作用結(jié)果分析）？圍繞該問題情境，組織同學(xué)分組討論，被探究的相關(guān)問題如下：①根據(jù)電泳結(jié)果，質(zhì)粒DNA分子被單酶切水解產(chǎn)生了一個大小與質(zhì)粒DNA一樣的片段，說明質(zhì)粒DNA中有幾個該酶的切割位點？②如果產(chǎn)生2個大小不同、但2個片段的大小之和等于質(zhì)粒DNA分子大小，說明質(zhì)粒DNA分子中存在幾個該酶的切割位點？③如果產(chǎn)生了1個片段，但其大小僅有質(zhì)粒DNA分子大小的一半，說明質(zhì)粒DNA分子大小存在幾個該酶切割位點、切割位點之間的距離如何？④如果被作用的底物DNA分子是線狀的，被單酶切、雙酶切處理后，又會產(chǎn)生什么樣的電泳結(jié)果？⑤同一種或者兩種以上的酶作用于不同DNA樣品，產(chǎn)生了相同的電泳圖譜，從這樣的水解結(jié)果又可以得到什么樣的信息？⑥對于已知的共價閉合雙鏈質(zhì)粒DNA分子，若其中僅有一個限制性內(nèi)切酶A的作用位點，被酶A作用后，產(chǎn)生幾個片段？⑦當(dāng)一種限制性內(nèi)切酶作用于哺乳動物基因組時，會產(chǎn)生怎樣的結(jié)果？⑧當(dāng)雙螺旋DNA變性為單鏈狀態(tài)的DNA分子，是否還能被原本可作用的限制性內(nèi)切酶切割？⑨反應(yīng)體系中酶的用量是不是越多越好？討論過程中，適時建議學(xué)生通過簡單作圖示意可能的酶切結(jié)果，并對結(jié)果進行分析，獲得相應(yīng)的信息。

（2）關(guān)于酶的選擇（基因工程實際應(yīng)用）。限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以來，最主要的用途是在基因研究中對DNA分子進行人為的遺傳操作，實現(xiàn)目的片段的克隆化、保存及充足的用于基因功能、外源表達等研究的材料。為實現(xiàn)基因操作的目的，如何選擇添加在DNA片段上下游的酶切位點？圍繞該問題情境，組織同學(xué)分組討論，在教師的啟發(fā)下，被探究的相關(guān)問題如下：①為什么要加酶切位點？②選擇酶切位點時，要不要考慮載體中存在的酶切位點、選擇什么樣的酶切位點、選擇的酶切位點是否會影響載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制、穩(wěn)定性以及外源基因的表達效率？③選擇酶切位點時，是否需要考慮被操作基因片段中存在的酶切位點，選擇的標(biāo)準(zhǔn)是什么？④當(dāng)把基因片段從克隆載體亞克隆到一個表達載體中時，是否可以直接通過酶切和連接重組實現(xiàn)，是否會有不妥，解決的方法有哪些？

（3）關(guān)于反應(yīng)緩沖液的選擇。限制性內(nèi)切酶與其他蛋白質(zhì)性質(zhì)的酶一樣，其催化活性需要合適的溫度、離子條件、pH等環(huán)境條件以發(fā)揮最大催化活性[3]。啟發(fā)同學(xué)討論：當(dāng)在同一反應(yīng)體系中進行雙酶切（基因工程常規(guī)操作）乃至三酶切時，上述條件怎樣同時滿足不同酶的最適作用條件、而溫度條件又怎樣滿足？

探究學(xué)習(xí)結(jié)束時，通過即時考查鞏固學(xué)習(xí)效果，鼓勵有興趣的學(xué)生積極開展課后拓展閱讀，鼓勵學(xué)生根據(jù)探究學(xué)習(xí)的收獲自主分析實驗結(jié)果。

4 探究學(xué)習(xí)的實踐效果

探究式教學(xué)實踐已在限制性內(nèi)切酶水解實驗中連續(xù)開展了3年，圍繞酶切作用結(jié)果分析的情境問題討論，可以很好地引導(dǎo)學(xué)生利用理論知識分析各種不同的酶切作用結(jié)果，并對實驗并未涉及的酶切處理結(jié)果進行分析，明晰實驗結(jié)果、結(jié)果分析和結(jié)論的區(qū)別，無形中提高學(xué)生獨立分析實驗結(jié)果、學(xué)以致用的能力；圍繞酶的選擇、緩沖液的選擇的情境問題討論，可以更好地幫助學(xué)生理解酶作為生物催化劑的高效性和作用條件對酶活性的影響，了解限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)對于離體條件下進行基因操作的重要性，引導(dǎo)學(xué)生較好地學(xué)習(xí)進行基因功能研究、外源基因表達載體構(gòu)建時選擇可操作的限制性內(nèi)切酶的一般原則、方法和技巧[4]。結(jié)合即時在線文獻查閱和課后擴展閱讀，使學(xué)生在實驗中驗證理論知識的同時拓展知識面，完全超越“進實驗室、按步驟操作、看個實驗結(jié)果、寫個實驗報告”的學(xué)習(xí)狀態(tài)，切實提高獨立操作、獨立觀察、獨立思考、獨立分析等實際能力。3年的實踐教學(xué)顯示，進行探究式教學(xué)的生物科學(xué)班學(xué)生中，能夠比較熟練地解答考查問題和正確判讀實驗結(jié)果的學(xué)生比例大幅度升高，明顯高于接受傳統(tǒng)講授的生物科學(xué)基地班（基地班的平均高考入學(xué)成績高于生物科學(xué)班），而難以正確判讀實驗結(jié)果和難以解答問題的學(xué)生人數(shù)明顯降低，這與其他學(xué)者的觀察結(jié)果一致。

5 結(jié)語

探究學(xué)習(xí)在限制性內(nèi)切酶水解實驗中的教學(xué)實踐表明，探究學(xué)習(xí)中的啟發(fā)、思考、討論等訓(xùn)練，能夠開拓學(xué)生思路，顯著提高多數(shù)學(xué)生的思維活躍度，將理論知識與實驗現(xiàn)象、實驗結(jié)果、問題解析等相聯(lián)系，實現(xiàn)學(xué)以致用，切實提高本科生的科學(xué)素養(yǎng)和培養(yǎng)質(zhì)量。

[1]Byrne A, McNeill J, Rogers K, et al. Impact of Enquiry Based Learning(EBL) on Student Midwife Praxis[J]. Midwifery,2018, 58: 83-85

[2]Yoon H, Joung YJ, Kim M. The Challenges of Science Inquiry Teaching for Pre-service Teachers in Elementary Classrooms: Difficulties on and under the scene[J]. Research in Science & Technological Education,2012,42(3)：589-608.

[3]Dobber M, Zwart R, Tanis M, et al. Literature Review: The Role of the Teacher in Inquiry-based Education[J]. Educational Research Review,2017,22:194-214.

[4]Meijerman I, Nab J, Koster AS. Designing and implementing an inquirybased undergraduate curriculum in pharmaceutical sciences. Currents in Pharmacy Teaching and Learning,2016,8:905-919.